制备肺炎球菌荚膜多糖和肺炎球菌疫苗的方法

摘要

本发明涉及制备肺炎球菌荚膜多糖和肺炎球菌疫苗的方法。制备肺炎球菌荚膜多糖的方法包括提供选定血清型的肺炎球菌溶解产物；去除溶解产物中的蛋白质和核酸，去除蛋白质和去除核酸在分开的步骤中不按序地进行；去除蛋白质的步骤包括I)将待处理的样品与脱氧胆酸钠混合，使该混合体系的pH为3‑6，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6‑8，得到第一上清液；II)去除第一上清液中的脱氧胆酸钠；去除核酸的步骤包括A)将待处理的样品与二价盐混合，使该混合体系的pH为1‑4，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6‑8，得到第二上清液；B)去除第二上清液中的在步骤A)中所添加的二价盐。本发明的方法简单、巧妙，实现了优秀的肺炎球菌荚膜多糖纯化效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及制备肺炎球菌荚膜多糖和肺炎球菌疫苗的方法。

背景技术

肺炎球菌是呼吸道感染的首要致病菌，既是引起儿童社区获得性肺炎最常见的病原菌，也是致使老年人致命性肺炎感染的主要病原菌。目前发现90余个血清型，其中约30个血清型的菌株对人类有致病性。荚膜多糖是肺炎球菌的主要毒力因子，研究结果表明，肺炎球菌荚膜多糖疫苗具有良好的免疫原性和安全性。

现有的肺炎球菌荚膜多糖纯化方法一般采用苯酚抽提法和乙醇分级沉淀法。然而苯酚对人体和环境均有危害，乙醇在操作和存储方面也存在重大安全隐患，对生产厂房的要求极高，增加了生产成本。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了制备肺炎球菌荚膜多糖的方法和制备肺炎球菌疫苗的方法。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种制备肺炎球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤：

1)提供选定血清型的肺炎球菌的溶解产物；

2)去除所述溶解产物中的蛋白质和核酸，其中去除蛋白质和去除核酸在分开的步骤中不按序地进行；

其中去除蛋白质的步骤包括：

I)将待处理的样品与脱氧胆酸钠混合，并使该混合体系的pH为3-6，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6-8，得到第一上清液；

II)去除所述第一上清液中的脱氧胆酸钠；

其中去除核酸的步骤包括：

A)将待处理的样品与二价盐混合，并使该混合体系的pH为1-4，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6-8，得到第二上清液；

B)去除所述第二上清液中的在步骤A)中所添加的二价盐；其中：

当去除蛋白质在去除核酸之前进行时，步骤I)所述待处理的样品为所述肺炎球菌溶解产物，步骤A)所述待处理的样品为步骤II)所得去除脱氧胆酸钠的液体；

当去除核酸在去除蛋白质之前进行时，步骤I)所述待处理的样品为步骤B)所得去除在步骤A)中所添加的二价盐的液体，步骤A)所述待处理的样品为所述肺炎球菌溶解产物。

(2)根据(1)所述的方法，其中在步骤I)中，所述脱氧胆酸钠在所述混合体系中的终浓度为0.1-2％(w/v)。

(3)根据(1)所述的方法，其中在步骤I)中，在pH 3-6下用脱氧胆酸钠处理所述样品的时间为5-30分钟，温度为18-30℃。

(4)根据(1)所述的方法，其中重复进行步骤I)1-4次。

(5)根据(1)所述的方法，其中在步骤A)中，所述二价盐在所述混合体系中的终浓度为0.03-1mol/L。

(6)根据(1)所述的方法，其中在步骤A)中，在pH 1-4下用二价盐处理所述样品的时间为5-30分钟，温度为18-30℃。

(7)根据(1)所述的方法，其中步骤I)和A)中所述的离心在3000g以上的离心力下进行10分钟以上。

(8)根据(1)所述的方法，其中步骤II)所述的去除脱氧胆酸钠和步骤B)所述的去除在步骤A)中所添加的二价盐采用超滤浓缩进行；优选地，用截留分子量为100Kd-300Kd的超滤膜进行所述超滤浓缩。

(9)根据(1)所述的方法，其中所述肺炎球菌荚膜多糖选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型。

(10)根据(1)所述的方法，其中所述二价盐包括氯化钙和氯化镁。

(11)一种制备肺炎球菌疫苗的方法，包括利用(1)至(10)中任一项所述方法制得的肺炎球菌荚膜多糖制备肺炎球菌疫苗。

(12)根据(11)所述的方法，其中所述肺炎球菌疫苗包括多糖疫苗和结合疫苗。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明通过简单地采用脱氧胆酸钠和二价盐的组合来纯化肺炎球菌荚膜多糖，同时巧妙地利用在不同pH值下脱氧胆酸钠与蛋白混合溶液的浊度变化来可视化地且准确地判断蛋白质去除效果，实现了优秀的肺炎球菌荚膜多糖纯化效果，所得肺炎球菌荚膜多糖的纯度高。

2.本发明摸索优化了各步骤的条件，进一步提高了纯化效果和效率。

3.本发明的整个纯化工艺仅需3-4天，缩短了工艺时间，降低了生产成本。

4.本发明的工艺操作简便，可实现自动化、管道化的大规模放大。

5.避免了苯酚和乙醇的使用，消除了安全隐患，产品更加安全环保。

附图说明

图1示出脱氧胆酸钠浓度对蛋白质去除步骤的影响；

图2示出pH对蛋白质去除步骤的影响；

图3示出离心力对蛋白质去除步骤的影响；

图4示出离心时间对蛋白质去除步骤的影响；

图5示出氯化钙浓度对核酸去除步骤的影响；

图6示出pH对核酸去除步骤的影响；

图7示出离心力对核酸去除步骤的影响；

图8示出离心时间对核酸去除步骤的影响；

其中，在图1-8中，图A示出1型肺炎球菌荚膜多糖的结果，图B示出5型肺炎球菌荚膜多糖的结果；图C示出9V型肺炎球菌荚膜多糖的结果；图D示出18C型肺炎球菌荚膜多糖的结果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明提供了一种制备肺炎球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤：

1)提供选定血清型的肺炎球菌的溶解产物；

2)去除所述溶解产物中的蛋白质和核酸，其中去除蛋白质和去除核酸在分开的步骤中不按序地进行；

其中去除蛋白质的步骤包括：

I)将待处理的样品与脱氧胆酸钠混合，并使该混合体系的pH为3-6，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6-8，得到第一上清液；

II)去除所述第一上清液中的脱氧胆酸钠；

其中去除核酸的步骤包括：

A)将待处理的样品与二价盐混合，并使该混合体系的pH为1-4，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6-8，得到第二上清液；

B)去除所述第二上清液中的在步骤A)中所添加的二价盐；其中：

当去除蛋白质在去除核酸之前进行时，步骤I)所述待处理的样品为所述肺炎球菌溶解产物，步骤A)所述待处理的样品为步骤II)所得去除脱氧胆酸钠的液体；

当去除核酸在去除蛋白质之前进行时，步骤I)所述待处理的样品为步骤B)所得去除在步骤A)中所添加的二价盐的液体，步骤A)所述待处理的样品为所述肺炎球菌溶解产物。

术语“肺炎球菌的溶解产物”是指用溶解剂裂解肺炎球菌而获得的溶解产物。用溶解剂裂解肺炎球菌可采用本领域常规的方法进行。溶解产物中至少包含肺炎球菌中的主要生物质，例如多糖、蛋白质和核酸，也可以包含生产过程中所产生的其他物质，例如肺炎球菌的代谢产物、培养基等。

本发明发现，对于肺炎球菌而言，利用脱氧胆酸钠和二价盐的组合可以有效且简便地纯化荚膜多糖。其中，因蛋白质分子量较大，在水溶液中易形成胶体，使溶液具有乳光。随着蛋白质浓度的增大，溶液浊度随之增加。脱氧胆酸钠与蛋白质在pH为3-6时形成共沉淀，在pH上升至6-8时解离且脱氧胆酸钠沉淀消失。此时如果体系中存在蛋白质，溶液仍呈乳光，如果此时不存在蛋白质，那么含有脱氧胆酸钠的溶液体系将为澄清的。本发明巧妙地利用该特点，使得可以容易地通过肉眼观察来准确地判断样品中的蛋白质去除效果，进而判断是否需要采取进一步的措施，例如更多地重复蛋白质去除步骤。另一方面，本发明发现，诸如氯化钙和氯化镁等二价盐可以使核酸在pH为1-4时形成沉淀，从而可以通过离心有效地去除核酸，去除核酸后，将pH调至6-8可以保证肺炎球菌荚膜多糖的稳定性，从而更好地保存。

本发明发现，当蛋白质去除步骤中的pH值＞6时，蛋白质去除效果不佳；如果pH＜3，荚膜多糖会与脱氧胆酸钠形成共沉淀，导致收率显著下降。综合考虑pH值对蛋白质去除率、多糖回收率的影响，此步pH优选为4.0-5.0，最优选为4.0-4.5。

本发明还发现，当核酸去除步骤中的pH值＞4时，核酸去除效果不佳；如果pH＜1，荚膜多糖处于强酸环境中可能导致分子结构的变化。综合考虑pH值对核酸去除率、多糖回收率、多糖稳定性的影响，此步pH优选为2-3，最优选为2.5±0.1。

调节pH可以使用常用的无机酸和/或碱进行。

优选地，所述二价盐为二价盐酸盐。更优先地，所述二价盐为氯化钙或氯化镁。本发明发现，当使用氯化钠时，不能理想地去除样品中的核酸。

优选地，在步骤I)中，所述脱氧胆酸钠在所述混合体系中的终浓度为0.1-2％(w/v)，例如为0.2-2％(w/v)、0.1-1％(w/v)，更优选为0.5-1％。

还优选地，在步骤I)中，在pH 3-6下用脱氧胆酸钠处理所述样品的时间为5-30分钟，温度为18-30℃。

优选地，重复进行步骤I)1-4次(例如1-2次)，即能够获得良好的蛋白质去除效果。

优选地，所述二价盐在所述混合体系中的终浓度为0.03-1mol/L，优选为0.1-1mol/L。

还优选地，在步骤A)中，在pH 1-4下用二价盐处理所述样品的时间为5-30分钟，温度为18-30℃。

为了更好地去除用脱氧胆酸钠和氯化钙处理后的体系中的沉淀，步骤I)和A)中所述的离心优选在3000g以上的离心力下离心10分钟以上。例如，离心力为3000g-6400g，更优选为4000g-6000g；离心时间更优选为10-40分钟，对于蛋白质去除步骤更加优选为10-20分钟，对于核酸去除步骤更加优选为15-25分钟。

步骤II)所述的去除脱氧胆酸钠和步骤B)所述的去除二价盐可以很好地避免脱氧胆酸钠在二价盐的存在下形成沉淀，从而影响纯化效果。可以采用本领域常用的手段去除体系中的脱氧胆酸钠和二价盐。优选地，本发明采用超滤浓缩来去除体系中的脱氧胆酸钠和二价盐，这样可以以更高的效率获得更好的效果。还优选地，用截留分子量为100Kd-300Kd的超滤膜进行所述超滤浓缩。如果超滤膜小于100kd，则超滤时间增长，且效果无明显改善。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括：3)在完成步骤2)之后，对所得样品进行干燥，从而得到干燥的、纯化的肺炎球菌荚膜多糖。优选地，此步采用真空冷冻干燥进行。

本发明的方法适用于多种肺炎球菌荚膜多糖，所述肺炎球菌荚膜多糖可以选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型。

在一些具体的实施方案中，选定血清型的肺炎球菌的溶解产物可以通过以下方法提供。使用生物反应器对肺炎球菌进行发酵，生长至对数生长期后加入溶解剂裂解菌体。离心收集上清液，用截留分子量为100Kd-300Kd的超滤膜进行超滤浓缩，获得肺炎球菌的溶解产物。

本发明还提供了一种制备肺炎球菌疫苗的方法，包括利用本发明的方法制得的肺炎球菌荚膜多糖制备肺炎球菌疫苗。

所述肺炎球菌疫苗包括多糖疫苗和结合疫苗。

在一些实施方案中，所述肺炎球菌疫苗含有与蛋白质载体偶联的多糖。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

实施例

除非特别说明，以下例子中所用实验方法均使用本领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。以下例子中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中所用试剂和仪器来源如下：

各型肺炎球菌购自中国医学细菌保藏管理中心；

脱氧胆酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；

氯化钙购自国药集团化学试剂有限公司；

超滤膜购自默克公司。

实施例1：1型肺炎球菌荚膜多糖的纯化

使用生物反应器对1型肺炎球菌进行发酵，生长至对数生长期后加入脱氧胆酸钠裂解菌体。离心收集上清液，用截留分子量为300Kd的超滤膜进行超滤浓缩，获得1型肺炎球菌溶解产物。

1型肺炎球菌溶解产物中加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：25分钟)，收集上清液，调pH至7.0，此时溶液略带浊光。再次加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：25分钟)，收集上清液，调pH至7.0，此时溶液澄清。将该上清液通过300Kd膜包超滤浓缩。在超滤浓缩液中加入氯化钙，使其终浓度为0.2mol/L，调pH至2.5，室温静置5分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：25分钟)，收集上清液，调pH至7.0。将该上清液通过300Kd膜包超滤浓缩后冷冻干燥。纯化后的肺炎球菌荚膜多糖各项检测结果如表1所示，检测方法参照《中国药典》2020版：

表1 1型肺炎球菌纯化荚膜多糖各项检测结果(其中，表1第一列中的参数为《中国药典》中的含量限定值。其他例子同)

实施例2：1型肺炎球菌荚膜多糖的纯化

按照实施例1所述的方法制备1型肺炎球菌溶解产物。

1型肺炎球菌溶解产物中加入氯化钙，使其终浓度为0.2mol/L，调pH至2.5，室温静置5分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：25分钟)，收集上清液，调pH至7.0。将该上清液通过300Kd膜包超滤浓缩。在超滤浓缩液中加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：25分钟)，收集上清液，调pH至7.0，此时溶液略带浊光。再次加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：25分钟)，收集上清液，调pH至7.0，此时溶液澄清。将该上清液通过300Kd膜包超滤浓缩。后冷冻干燥。纯化后的肺炎球菌荚膜多糖各项检测结果如表2所示，检测方法参照《中国药典》2020版：

表2 1型肺炎球菌纯化荚膜多糖各项检测结果

实施例3：5型肺炎球菌荚膜多糖的纯化

使用生物反应器对5型肺炎球菌进行发酵，生长至对数生长期后加入脱氧胆酸钠裂解菌体。离心收集上清液，用截留分子量为100Kd的超滤膜进行超滤浓缩，获得5型肺炎球菌溶解产物。

5型肺炎球菌溶解产物中加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为1％，调pH至4.3，室温静置20分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：20分钟)，收集上清液，调pH至7.0，此时溶液略带浊光。再次加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为1％，调pH至4.3，室温静置20分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：20分钟)，收集上清液，调pH至7.0，此时溶液澄清。将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩。在超滤浓缩液中加入氯化钙，使其终浓度为1mol/L，调pH至2.8，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：20分钟)，收集上清液，调pH至7.0。将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩后冷冻干燥。纯化后的肺炎球菌荚膜多糖各项检测结果如表3所示，检测方法参照《中国药典》2020版：

表3 5型肺炎球菌纯化荚膜多糖各项检测结果

实施例4：5型肺炎球菌荚膜多糖的纯化

5型肺炎球菌溶解产物中加入氯化钙，使其终浓度为1mol/L，调pH至2.8，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：20分钟)，收集上清液，调pH至7.0。将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩。在超滤浓缩液中加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为1％，调pH至4.3，室温静置20分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：20分钟)，收集上清液，调pH至7.0，此时溶液略带浊光。再次加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为1％，调pH至4.3，室温静置20分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：20分钟)，收集上清液，调pH至7.0，此时溶液澄清。将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩后冷冻干燥。纯化后的肺炎球菌荚膜多糖各项检测结果如表4所示：

表4 5型肺炎球菌纯化荚膜多糖各项检测结果

实施例5：脱氧胆酸钠浓度对蛋白质去除步骤的影响

取部分型别肺炎球菌溶解产物，分别加入脱氧胆酸钠至终浓度为0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、1.0％、1.5％、2％；调pH至4.3±0.2，室温静置10分钟；5000g离心10-20分钟，收集上清，调pH至6～8；重复上述处理步骤2次或以上，直至溶液澄清。取样检测型特异糖含量、蛋白质含量，并计算多糖回收率和蛋白去除率。结果如图1所示。

由图1可以看出，当不添加脱氧胆酸钠时，仅依靠调节pH步骤和离心步骤，蛋白质去除效果较差，说明脱氧胆酸钠在本发明中起关键作用。脱氧胆酸钠浓度在0.1％～2.0％的范围内对蛋白质去除步骤没有明显地影响，蛋白质去除率均在90％以上，多糖回收率均大于80％。

实施例6：pH对蛋白质去除步骤的影响

取部分型别肺炎球菌溶解产物，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％；分别调pH至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，室温静置10分钟；5000g离心10～20分钟，收集上清，调pH至6～8；重复上述处理步骤2次或以上，直至溶液澄清。取样检测型特异糖含量、蛋白质含量，并计算多糖回收率和蛋白去除率。结果如图2所示。

由图2可以看出，在相同脱氧胆酸钠浓度下，蛋白质去除率随pH值的降低而增加，当pH值小于4.5时，蛋白质去除率高于90％。在考察蛋白质去除率的同时观察多糖回收率，发现pH小于3.5时，多糖会发生沉淀，随着溶液pH值的降低，多糖损失量也随之增大。因此，pH值在本发明中起关键作用。综合考虑pH值对蛋白质去除率、多糖回收率的影响，pH最优选为4.0-4.5。

实施例7：离心力对蛋白质去除步骤的影响

取部分型别肺炎球菌溶解产物，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％；调pH至4.3±0.2，室温静置10分钟；分别用1000g、2000g、3000g、4000g、5000g、6000g、6400g离心10～20分钟，收集上清，调pH至6～8；重复上述处理步骤4次。每次脱氧胆酸钠处理后的上清取样检测型特异糖含量、浊度值，并计算多糖回收率。因部分试验条件中离心力过低，即使处理4次后上清液依旧浑浊，蛋白质含量不可能符合要求，所以本试验通过测定浊度值快速地判定试验结果。结果如图3所示。

由图3可以看出，离心力对多糖回收率的影响不大。但当离心力过低时，离心效果无法保证，离心上清浊度值高。随着离心力的增加，上清浊度值随之下降。当离心力3000g以上时，上清浊度值无明显差异。

实施例8：离心时间对蛋白质去除步骤的影响

取部分型别肺炎球菌溶解产物，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％；调pH至4.3±0.2，室温静置10分钟；分别用5000g离心5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟，收集上清，调pH至6～8；重复上述处理步骤4次。每次脱氧胆酸钠处理后的上清取样检测型特异糖含量、浊度值，并计算多糖回收率。

由图4可以看出，离心时间对多糖回收率的影响不大。但当离心时间过短时，离心效果无法保证，离心上清浊度值高。随着离心时间的增加，上清浊度值随之下降。离心10分钟以上，上清浊度值无明显差异。

实施例9：氯化钙浓度对核酸去除步骤的影响

取部分型别肺炎球菌溶解产物，分别加入氯化钙，使其终浓度为0mol/L、0.03mol/L、0.06mol/L、0.12mol/L、0.25mol/L、0.50mol/L、0.75mol/L、1mol/L；调pH至2.5±0.1，室温静置5分钟；5000g离心15～25分钟，收集上清，调pH至6～8。取样检测型特异糖含量、核酸含量，并计算多糖回收率和核酸去除率。

由图5可以看出，当氯化钙浓度为0mol/L时，核酸去除率低于40％，证明了氯化钙存在的必要性。当处理pH为2.5±0.1时，氯化钙浓度在0.03～1mol/L范围内，核酸去除率均在90％以上，多糖回收率大于80％。

实施例10：pH对核酸去除步骤的影响

取部分型别肺炎球菌溶解产物，加入氯化钙，使其终浓度为0.25mol/L；分别调pH至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，室温静置5分钟；5000g离心15～25分钟，收集上清，调pH至6～8。取样检测型特异糖含量、核酸含量，并计算多糖回收率和核酸去除率。

由图6可以看出，在相同氯化钙浓度下，核酸去除率随pH值的降低而增加，当pH值小于3.0时，核酸去除率高于90％。在考察核酸去除率的同时观察多糖回收率，发现pH对多糖回收率没有明显的影响。因此，pH值在本发明中起关键作用。综合考虑pH值对核酸去除率、多糖回收率、多糖稳定性的影响，pH最优选为2.5±0.1。

实施例11：离心力对核酸去除步骤的影响

取部分型别肺炎球菌溶解产物，加入氯化钙，使其终浓度为0.25mol/L；调pH至2.5±0.1，室温静置5分钟；分别用1000g、2000g、3000g、4000g、5000g、6000g、6400g离心15～25分钟，收集上清，调pH至6～8。取样检测型特异糖含量、核酸含量，并计算多糖回收率和核酸去除率。

由图7可以看出，离心力对多糖回收率的影响不大。但当离心力过低时，离心效果无法保证，离心上清浑浊，核酸去除效果不佳。随着离心力的增加，核酸去除率随之上升。当离心力3000g以上时，核酸去除率均高于90％。

实施例12：离心时间对核酸去除步骤的影响

取部分型别肺炎球菌溶解产物，加入氯化钙，使其终浓度为0.25mol/L；调pH至2.5±0.1，室温静置5分钟；分别用5000g离心5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟，收集上清，调pH至6～8。取样检测型特异糖含量、核酸含量，并计算多糖回收率和核酸去除率。

由图8可以看出，离心时间对多糖回收率的影响不大。但当离心时间过短，离心效果无法保证，离心上清浑浊，核酸去除效果不佳。随着离心时间的增加，核酸去除率随之上升。离心15分钟以上，核酸去除率均在90％以上。