一种牡蛎多糖的提取方法及其应用

摘要

本发明公开了一种牡蛎多糖的提取方法，本发明还公开了一种牡蛎多糖的提取方法获得的牡蛎多糖及其在抑菌剂和抗氧化剂中的应用。本发明OPS的OPS‑1的平均分子量分别为623.24 kDa和954.32 kDa，分子量较大。在对OPS和OPS‑1进行单糖组成分析时发现这两种多糖均主要由葡萄糖构成。刚果红实验表明OPS和OPS‑1与刚果红混合液的紫外吸收波长会随着NaOH溶液的浓度升高而增大，分子内具有三股螺旋结构。扫描电镜分析表明OPS结构主要呈现出表面疏松多孔，表面有珊瑚状突起；而OPS‑1的表面结构致密，粗糙带有方形的细小颗粒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种牡蛎多糖的提取方法及其应用，属于多糖技术领域。

背景技术

在我国，牡蛎资源十分丰富，且在水产养殖产业中，牡蛎养殖产业十分发达。牡蛎在我国广泛分布于南海，东海，黄海及渤海等海域。牡蛎中的基本营养素包括蛋白质、脂肪、糖原(碳水化合物)、水和灰分。鲜牡蛎软体部中水分的质量分数为70.91％-88.24％，与其他水产品相近，蛋白质为6.14％～11.29％，为牛奶的2～3倍。人体必需的氨基酸、亚麻酸和亚油酸等多不饱和脂肪酸在牡蛎中含量丰富，钙、铁、锌、硒的含量高于禽畜肉类。

牡蛎是一种富含蛋白质、必需氨基酸、必须脂肪酸、糖原和微量元素的功能性药食同源食品。牡蛎多糖作为牡蛎提取物中的重要活性成分，拥有调节免疫力、抗肿瘤、降血糖和抑菌等生物活性。

多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抑菌、降血糖、免疫调节等方面的活性。目前对于牡蛎多糖活性的研究都聚焦在抗肿瘤、保护肝损伤、降血糖活性上，而牡蛎多糖的抑菌能力以及流变学特性、乳化特性这些加工适用性上不明确。本发明对提取和层析的牡蛎多糖进行结构表征，以及对体外抗氧化活性和抑菌活性、流变特性和乳化特性进行研究。本研究结果一方面可以为牡蛎多糖开发新型的抗氧化剂和抑菌剂奠定基础，另一方面对牡蛎多糖在食品、化工等行业的运用具有指导意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种牡蛎多糖的提取方法，该法采用热水浸提法对牡蛎提取出多糖OPS，使用DEAE-纤维素对OPS纯化，最终获得了牡蛎多糖中的中性多糖OPS-1(84.58±1.98)％为主要组分，且OPS-1的纯度显著高于OPS。

同时，本发明提供一种牡蛎多糖，该牡蛎多糖的平均分子量为954.32kDa，粒度为101.80±1.20nm电位为15.87±0.66mV；OPS-1中的总糖含量大于84％；OPS-1中所含各单糖的百分比值为葡萄糖:甘露糖:核糖:鼠李糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖:岩藻糖

＝97.412:0.237:0.079:0.025:0.070:0.267:0.780:0.037。

同时，本发明提供一种牡蛎多糖的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种牡蛎多糖的提取方法，包括以下步骤：

取新鲜牡蛎肉适量，经粉碎后形成匀浆，加入去离子水，去离子水的加入量相当于新鲜牡蛎肉重量的10～15倍，并将pH调节至10～10.5，在55～60℃下水浴3～4h进行提取，过滤后进行离心；弃去离心产生的沉淀后，将上层清液通过减压进行浓缩，获得浓缩液，浓缩液的重量相当于新鲜牡蛎肉的0.5～1倍量，加入相当于浓缩液3～4倍体积的无水乙醇，醇沉至少24h；离心20～30min，取沉淀，用95％乙醇、无水乙醇、丙酮分别进行至少两次洗涤；再在沉淀中加入10～15倍体积水溶解，调pH至5～5.5，获得溶解液，加入相当于溶解液体积的0.2～0.3％的菠萝蛋白酶，50～55℃酶解3～5h，再调pH至8.5～9，再加入相当于溶解液体积的1％的碱性蛋白酶，50～55℃酶解4～5h，获得酶解液；将酶解液于85～90℃水浴10～15min，灭活菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶；再在酶解液中加入sevag液，sevag液中四氯化碳和正丁醇的体积比为4:1，sevag液的加入体积相当于酶解液的1/3～1/4倍量，震荡15～20min，离心弃去沉淀，重复多次至不再产生白色絮状沉淀，于35～37℃烘箱烘干，即得牡蛎粗多糖OPS；

称取适量DEAE-纤维素干粉，预处理后装入层析柱并进行柱平衡，制备上样液，上样至DEAE-纤维素层析柱，依次以0、0.05、0.1、0.3mol/L NaCl溶液进行洗脱2.5～3个柱体积；通过自动接样器以流速为1～1.2mL/min，每10～13min一管，对馏分进行收集；将所收集的馏分采用苯酚-硫酸法进行监测，合并490nm时吸光度大于1.5的管，透析至少24h后，冷冻干燥，获得OPS-1样品粉末。

DEAE-纤维素干粉的预处理方法为：将DEAE-纤维素干粉置于去离子水中溶胀至少12h，DEAE-纤维素干粉与去离子水的质量体积比为1:2.5，去除杂质与悬浮颗粒后以湿法装入层析柱中。

层析柱的径高比为1:25。

柱平衡的方法为：待装柱完成后用去离子水以1.0～1.5mL/min的流速对层析柱进行2.5～3个柱体积洗脱，以对层析柱进行平衡。

上样液的制备方法为：将牡蛎粗多糖OPS充分溶解于去离子水中，牡蛎粗多糖OPS的用量为DEAE-纤维素干粉重量的1.5/1000～3/1000，牡蛎粗多糖OPS与用于溶解的去离子水的质量体积比为5:1，单位为mg:mL，在转速为5000～6000r/min的条件下离心10～15min，将不溶性沉淀去除，再将上层清液过0.45μm滤膜，制得上样液。

OPS-1的平均分子量为954.32kDa，粒度为101.80±1.20nm电位为15.87±0.66mV；OPS-1中的总糖含量大于84％；OPS-1中所含各单糖的百分比值为葡萄糖:甘露糖:核糖:鼠李糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖:岩藻糖＝97.412:0.237:0.079:0.025:0.070:0.267:0.780:0.037。

在OPS-1溶液浓度为5.0mg/mL时，OPS-1的ABTS自由基清除率为(63.39±0.66)％，亚铁离子螯合率为(70.84±0.56)％，羟基自由基清除率为(74.26±0.20)％，在OPS-1溶液浓度为0.5mg/mL时DPPH自由基清除率为(78.14±0.95)％。

牡蛎多糖在抑菌剂中的应用。

牡蛎多糖在抗氧化剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过热水浸提出牡蛎多糖OPS的浓度为69.21±0.97％。使用DEAE-纤维素层析柱对牡蛎多糖进一步纯化，纯化出OPS-1、OPS-2、OPS-3三个组分。而牡蛎多糖中中性多糖OPS-1(84.58±1.98％)为主要组分，且OPS-1的纯度显著高于OPS(P<0.05)。

2、本发明通过采用紫外光谱扫描进行纯度鉴定，表明在OPS和OPS-1中不含有核酸和蛋白质。通过红外光谱和核磁共振波谱分析，得出OPS和OPS-1中的结构为β-吡喃多糖。OPS的OPS-1的平均分子量分别为623.24kDa和954.32kDa，分子量较大。在对OPS和OPS-1进行单糖组成分析时发现这两种多糖均主要由葡萄糖构成。刚果红实验表明OPS和OPS-1与刚果红混合液的紫外吸收波长会随着NaOH溶液的浓度升高而增大，分子内具有三股螺旋结构。扫描电镜分析表明OPS结构主要呈现出表面疏松多孔，表面有珊瑚状突起；而OPS-1的表面结构致密，粗糙带有方形的细小颗粒。

3、OPS和OPS-1均具有很好的热稳定性。

4、对OPS和OPS-1进行体外抗氧化实验，通过对测定对DPPH自由基清除能力，ABTS自由基的清除能力，亚铁离子螯合能力和羟基自由基清除能力来表现多糖抗氧化能力。OPS和OPS-1的抗氧化能力会随着溶液浓度增大而升高。OPS的DPPH自由基清除率，ABTS自由基的清除率，亚铁离子螯合率和羟基自由基清除率的IC

附图说明

图1为本发明的提取方法的流程图；

图2为本发明利用DEAE-纤维素离子交换柱方法对牡蛎多糖各组分进行分离的多糖洗脱曲线图；

图3为葡萄糖的标准曲线图；

图4为蛋白质标准曲线图；

图5为紫外波长扫描曲线图；

图6为HPGPC分析图谱；

图7为单糖标准品的PMP-HPLC谱图；

图8为牡蛎多糖酸水解单糖的PMP-HPLC谱图；

图9为牡蛎多糖的红外光谱图；

图10为OPS和OPS-1的

图11为OPS和OPS-1的

图12为牡蛎多糖的粒度分布图；

图13为两种多糖OPS和OPS-1的扫描电子显微镜图；

图14为牡蛎多糖的三股螺旋结构分析图；

图15为OPS的热重分析图；

图16为OPS-1的热重分析图；

图17为牡蛎多糖的DPPH自由基清除能力图；

图18为牡蛎多糖的ABTS自由基清除能力图；

图19为牡蛎多糖的亚铁离子螯合能力图；

图20为牡蛎多糖的羟基自由基清除能力图；

图21为牡蛎多糖的抑菌圈测定图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1

1、材料与方法

1.1、试验材料与设备

1.1.1、原料与试剂：近江牡蛎，产地福建省漳州市漳浦县。

大肠杆菌(ATCC 25922)、鼠伤寒沙门氏菌(C 77-31)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)均为本实验室保藏。

1.2、试验方法

1.2.1、牡蛎多糖的制备

如图1所示，取新鲜牡蛎肉50g，经粉碎后形成匀浆，加入去离子水500mL，并将pH调节至10，在55℃下水浴3h进行提取，过滤后进行离心。弃去离心产生的沉淀后，将上层清液通过减压进行浓缩至25mL，加入四倍体积无水乙醇，醇沉24h。3500r/min离心20min，取沉淀，用95％乙醇、无水乙醇、丙酮(过夜)分别进行两次洗涤。再在沉淀中加入十倍体积水溶解，调pH至5.5，加入0.2％菠萝蛋白酶，50℃酶解3h，再调pH至8.5，加入1％碱性蛋白酶，55℃酶解4h。将水溶液90℃水浴10min，灭活菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶。在酶解液中加入体积比为4:1的四氯化碳、正丁醇(sevag液)，sevag液的加入体积相当于酶解液的1/3倍量，震荡15min，离心弃去沉淀，重复多次至不再产生白色絮状沉。于37℃烘箱烘干，即得牡蛎粗多糖(OPS)。

1.2.2、牡蛎多糖的纯化

称取40.0g DEAE-纤维素干粉置于100mL去离子水中溶胀12h。去除杂质与悬浮颗粒后以湿法装入16×400mm层析柱中，待装柱完成后以1.0mL/min的流速对层析柱进行3个柱体积洗脱以对层析柱进行平衡。将60mg OPS充分溶解于12mL去离子水中，在转速为5000r/min的条件下离心10min，将不溶性沉淀去除，再将上层清液过0.45μm滤膜，制得上样液。将上清液上样至DEAE-纤维素层析柱(16×400mm)，以0、0.05、0.1、0.3mol/LNaCl溶液进行洗脱。通过AKTApurifierTM 10(瑞典GE公司)以流速为1mL/min，每10min一管，对馏分进行收集。将所收集的馏分采用苯酚-硫酸法进行监测。将多糖组分透析24h后进行冷冻干燥以样品粉末。

1.2.3、多糖的化学组成测定

采用苯酚-硫酸法对总糖含量进行测定。取2.0mL葡萄糖标准溶液(0-100mg/mL)，加入5％苯酚溶液，摇匀。于暗室中反应20min后于490nm下测其吸光度，绘制出标准曲线。再取0.1mg/mL样品溶液2.0mL替代葡萄糖标准溶液与去离子水混合液，重复先前过程，并根据其于490nm处吸光度值计算总糖含量。

采用考马斯亮蓝法对蛋白质含量进行测定。将0.1g考马斯亮蓝G-250、50mL乙醇和100mL 85％磷酸溶液加入至1000mL容量瓶中并定容。取1mL BSA(牛血清白蛋白)标准溶液(0.00-0.10mg/mL)与5.0mL配制的考马斯亮蓝溶液混合均匀，并测其于595nm处波长，绘制标准曲线。取1.0mL样品溶液替代BSA标准溶液测其于595nm处吸光度值，并计算其蛋白含量。

1.2.4、多糖的紫外吸收峰检测：在5.0mL去离子水中充分溶解5.0mg牡蛎多糖样品，配制成1.0mg/mL多糖水溶液，使用去离子水进行调零后，在T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)上于200-600nm波长进行紫外波长扫描。

1.2.5、多糖的分子量测定：通过高效液相凝胶渗透色谱(HAGPC)对牡蛎多糖的分子量进行分析。色谱条件：日本Shimadzu(岛津)公司LC20高效液相色谱泵；检测器：日本Shimadzu(岛津)公司RID-20示差折光检测器；色谱柱：日本TOSOH(TSK东曹)公司TSKgelGMPWXL水相凝胶色谱柱；进样器：美国Rheodyne7725i手动六通阀进样器(定量环20μL)；流动相：0.1M NaNO

采用窄分布PEO(聚乙二醇)(分子量：903000，580000，146000，44200，1000，600)进样得到色谱图，以PEO相对分子质量的对数lg Mw为纵坐标，保留时间t为横坐标绘制标准曲线，对曲线进行回归拟合，得出葡聚糖校正曲线方程。将多糖样品进样后测得保留时间，根据曲线方程计算纯化后不同品种枸杞多糖样品的相对分子质量。

1.2.6、多糖的单糖组成测定

(1)多糖样品酸水解

向5.0mg样品中加入3.0mL 2mM三氟乙酸(TFA)混匀，并在120℃环境下酸解1min。冷却后使用氮气吹干。在向其中加入甲醇后，使用氮气纯干，重复3次将残留的TFA去除干净。再加入3.0mL超纯水复溶多糖样品的酸水解产物，备用。

(2)单糖PMP衍生

单糖标准品的衍生：配制混合单糖标准对照溶液(1.0mL中各含50ug甘露糖，核糖，鼠李糖，葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，N-乙酰-氨基葡萄糖，葡萄糖，N-乙酰-氨基半乳糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖，岩藻糖)，吸取250μL混合单糖标准对照溶液，依次加入250uL 0.6mol/LNaOH、500uL 0.4mol/L PMP-甲醇溶液摇匀，将混合液于70℃环境下进行水浴，水浴时间1h，加入500uL 0.3mol/L HCl进行中和后，再加入1.0mL氯仿进行漩涡，以除去残留的PMP。3000r/min离心10min后，取上清液用于测定。

(3)样品的衍生：取多糖样品酸水解产物250μL，依次加入250uL 0.6mol/L NaOH，500μL0.4mol/L PMP-甲醇溶液，摇匀后步骤与单糖标准品衍生方法相同。

(4)衍生物的测定：采用高效液相色谱法对衍生物进行测定，测试条件为：仪器(岛津LC-20AD)；色谱柱(Xtimate C18 4.6×200mm 5μm)；柱温(30℃)；流速(1.0mL/min)；检测波长(250nm)；进样量(20μL)；流动相(0.05mol/mL磷酸二氢钾溶液(用氢氧化钠溶液调pH为6.70)-乙腈＝83-17)。

依据各单糖标准品对应衍生物色谱图的峰面积和各单糖标准品的摩尔浓度，依据多糖水解样品衍生物在色谱中的出峰时间判断其单糖组成，依据多糖水解样品衍生物在色谱中的峰面积和计算得出的各单糖含量百分比。

1.2.7、多糖的扫描电镜分析：使用双面胶将少量牡蛎多糖样品粉末固定在样品台上后进行喷金处理，使用钨丝灯扫描电子显微镜S-3400N(日本日立公司)，在加速电压为5.00kV放大1000倍和5000倍进行牡蛎多糖表面图像采集。

1.2.8、多糖的粒径和Zeta电位测定：配制1mg/mL多糖样品溶液，在25℃环境下，于粒度及电位分析仪中NANO ZS90(英国马尔文仪器有限公司)进行粒径和Zeta电位的测定。

1.2.9、多糖的傅里叶红外变换光谱分析：先使用不含多糖的KBr粉末得到基线，再称取2mg牡蛎多糖样品与200mg KBr(光谱级)充分研磨成细腻粉末，多糖-KBr粉末混合均匀后，将混合粉末使用压片机压制成质密透明薄片，通过傅里叶变换红外光谱仪Nicoletis50(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)在波长400-4000cm

1.2.10、多糖的核磁共振光谱分析：将5.0mg牡蛎多糖样品溶于0.5mL氘水中，加入于核磁管中密封，加上转子后于核磁共振仪Bruker AVANCEⅢ(德国布鲁克公司)中(频率：600MHz；温度：25℃)进行核磁共振氢谱和碳谱的测定。

1.2.11、多糖的三股螺旋结构分析：取1.0mL 1.0mg/mL牡蛎多糖样品溶液，依次加入等体积0.2mM刚果红溶液和2.0mL NaOH溶液(0-0.5mol/L)。将混合液混合均匀后静置10min，进行紫外全波长扫描，波长范围：400-600nm。分别采集并记录在不同浓度NaOH溶液中的最大吸收波长。

1.2.12、多糖的热重分析：取10mg牡蛎多糖，以N

1.2.13、多糖的体外抗氧化：

DPPH自由基清除活性测定：将牡蛎多糖溶液(0-0.5mg/mL)与0.2mM DPPH-无水乙醇溶液等体积混合并摇晃均匀，放置于暗室中反应30min。用紫外分光光度计测其517nm处波长，以无水乙醇作为空白对照。DPPH自由基清除能率计算公式如下：

DPPH自由基清除率(％)＝(1-(A

A

ABTS自由基清除活力测定：以2.45mM K

ABTS自由基清除率(％)＝(1-(A

A

羟基自由基清除能力测定：将牡蛎多糖溶液(0-5.0mg/mL)中加入等体积FeSO

羟基自由基清除率(％)＝(1-(A

A

亚铁离子螯合能力测定：2.0mL牡蛎多糖溶液(0-5.0mg/mL)中依次加入0.1mL 2mMFeCl

亚铁离子螯合能力(％)＝(1-(A

A

1.2.14、多糖的抑菌活性：在高压蒸汽灭菌锅中于121℃温度下对LB液体培养基灭菌20min，将灭菌后的LB液体培养基中分别加入0.1mL大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏局、金黄色葡萄球菌菌液并混匀。将接种后的培养基置于摇床中在转速为180r/min，温度为37℃条件下培养12h，将菌液浓度培养至10

结果判断：抑菌圈直径≥20mm为高度敏感，10-19mm为中度敏感，<10mm为不敏感。

1.2.15、统计分析：所有试验均重复三次，试验结果以“平均值±标准差”来表示。使用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，采用独立样本T检验和Duncan检验进行单因素方差分析(ANOVA)，并用Origin 2019软件绘图。

2、结果与分析

2.1、牡蛎多糖的纯化

DEAE-纤维素层析柱会对带有负电荷的多糖具有吸附作用。在使用不同浓度的NaCl溶液对多糖进行洗脱时，会降低层析柱对多糖的吸附能力，使得带有较弱负电荷的多糖先被洗脱下来。利用DEAE-纤维素离子交换柱方法对牡蛎多糖各组分进行分离的结果见图2。

由图2可知，在牡蛎多糖OPS中的主要组分有OPS-1、OPS-2和OPS-3。OPS-1(管1-30)、OPS-2(管31-60)、OPS-3(管61-90)分别为经过去离子水、0.05mol/L、0.1mol/LNaCl溶液洗脱后所收集的馏分。使用每一梯度浓度NaCl溶液进行洗脱时，在第60-100min时多糖会被大量洗脱出来，且在牡蛎粗多糖中中性多糖OPS-1的含量最多。进过冷冻干燥后可以计算出OPS-1、OPS-2、OPS-2的干物质与牡蛎粗多糖的比重为37.4％、3.1％、0.2％。OPS-1为主要多糖，因此，选取OPS-1为主要研究对象。

2.2、化学组成

葡萄糖的标准曲线为：y＝15.5590x+0.1100，其线性范围为：R

蛋白质的标准曲线为：y＝29525x+0.2245，其线性范围为：R

OPS以及OPS-1的总糖量以及蛋白质含量如表1所示，在分离和纯化的过程中，总糖的含量会随之显著上升(P<0.05)，而蛋白质的含量会显著减少(P<0.05)，这说明DEAE-纤维素层析柱会达到分离纯化的目的。

表1 OPS和OPS-1的总糖含量和蛋白质含量

注：不同字母项代表具有显著性差异(P<0.05)；相同字母项代表无显著性差异(P>0.05)。

2.3、紫外全波长扫描分析

420、280和260nm处，多肽、蛋白质和核酸具有紫外吸收峰，因此可以根据紫外吸收峰的检测来反应多糖的纯度。OPS以及OPS-1的紫外吸收全波长扫描结果如图5所示。

由图5可以看出，在紫外光谱波长为260nm、280和420nm时，OPS以及OPS-1不具有紫外吸收峰。这说明，在OPS以及OPS-1中不含有核酸、蛋白质以及多肽，这一结果与图4中分析的蛋白质含量结果相符合。

2.4、多糖的分子量

在多糖流经凝胶色谱柱时，不同分子量的多糖所需要的时间不同，分子量大的多糖会率先流出。以不同分子量PEO标准品得到的洗脱标准曲线为：LgMw＝-0.7078716x+15.33183，其线性范围为：R

由图6可知，两种多糖的分布并不均匀，特别是对于OPS具有多个非常宽的峰，还有几个小峰互相重叠在一起，分子量范围为：0.405-1141.543kDa，这样的结果与先前的研究相似。而OPS-1中只存在两个对称单一峰，这两个峰的平均分子量为1261.82kDa和4.701kDa，且OPS-1的洗脱峰与OPS的部分洗脱峰相重叠，这是由于OPS-1是从OPS中纯化出来的结果。对比OPS和OPS-1的出峰时间，计算得到OPS和OPS-1的平均分子量分别为623.24kDa和954.32kDa。本发明中的OPS和OPS-1多糖分子具有更高的分子量。分子量较高的多糖往往具有较好的生物活性。因此，OPS和OPS-1具有很大的应用潜力。

2.5、单糖组成分析

多糖在酸解成单糖后，可以通过将单糖甲基化，从而在流经液相色谱柱后被检测出来。通过将PMP衍生化OPS和OPS-1后，与单糖标准品PMP衍生化后过HPLC系统所得的图谱(图7，图8)比较可以得出表2结果。

表2牡蛎多糖的单糖组成

由表2可以看出OPS和OPS-1主要为葡萄糖构成。在OPS中葡萄糖含量为95.350％，而其他单糖的含量均不足1％，其中甘露糖:核糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖:岩藻糖＝0.309:0.496:0.299:0.256:0.542:0.391。在OPS-1中其葡萄糖含量为97.412％，其中甘露糖:核糖:鼠李糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖：岩藻糖＝0.237:0.079:0.025:0.070:0.267:0.780:0.037。在OPS中检测到葡萄糖醛酸的含量为2.018％。因此，OPS和OPS-1都是以葡萄糖为的主干，且为葡萄糖构成的。而在OPS中，半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸所占总单糖的比例均高于OPS-1中所占各单糖的比例。

2.6、红外图谱分析

多糖中不同化学键的振动频率在红外光谱可以体现出来，红外的特征吸收峰会对应多糖中不同的单糖、官能团、以及糖苷键类型。OPS和OPS-1在400-4000cm

由图9以看出，OPS-1在400-4000cm

OPS在400-4000cm

OPS和OPS-1具有相似的红外吸收峰，证明这两种多糖有着相似的单糖组成，这一结果验证了单糖组成结果。

2.7、核磁共振图谱分析

通过核磁共振中的氢信号和碳信号可以对多糖的糖苷键类型、键合位置、糖环构型等进行确定。因此，核磁共振波谱可以将复杂的多糖结构详细的展示出来。本研究中OPS和OPS-1的

在

在

2.8、粒度与电位分析

本研究中OPS与OPS-1的粒度分布如图12所示。

从图12中可以看出OPS与OPS-1的粒度呈双峰分布。由表3可知，OPS的粒度为(81.22±7.45)nm，OPS-1的粒度为(101.80±1.20)nm，且OPS-1的粒度显著大于OPS的粒度(P<0.05)。结合OPS与OPS-1的分子量可以看出，多糖的分子量越大，多糖的粒度也会越大。OPS的电位为(-2.66±0.46)mV，OPS-1溶液Zeta电位为(15.87±0.66)mV，OPS-1溶液带有正电荷，这是由于在OPS-1为中性多糖，因而溶液中呈现正电位，具有得电子的能力。

表3牡蛎多糖的粒度和电位

注：不同字母项代表具有显著性差异(P<0.05)；相同字母项代表无显著性差异(P>0.05)。

2.9、扫描电镜分析

扫描电子显微镜可以通过二次电子成像对多糖的表面微观构象进行表征。本研究中扫描电子显微镜对OPS和OPS-1固体粉末的表面微观结构如图13所示，其中，A、B为OPS-1，C、D为OPS，A、C放大数为1000倍，B、D放大倍数为5000倍。

由图13A可以看出，经过1000倍放大后可以观察到OPS-1的整体呈块状，表面粗糙，具有少量的层片堆叠，边缘整齐。同时，由图13B可以看出，在对OPS-1放大5000倍后观察可以发现，OPS-1的表面有许多细小颗粒，且这些颗粒多数为结构规则的方形。由图13C可以看出，在1000倍镜下，牡蛎多糖的表面粗糙，带有碎屑物。由图13D可以看出，在经过5000倍放大后可以观察到牡蛎多糖的表面比较疏松，呈珊瑚状结构，这种结构可以极大地增加牡蛎多糖颗粒的表面积。

2.10、三股螺旋结构分析

具有三股螺旋的多糖会与刚果红在碱性环境中生成络合物，从而导致紫外吸收波长的增加。因此，可以根据在碱性溶液中牡蛎多糖与刚果红混合液是否会有红移现象的产生，进而判断三股螺旋结构否具存在于多糖中。OPS和OPS-1与刚果红混合液的最大紫外吸收波长随NaOH溶液浓度的变化如图14所示。

由图14可以看出，在氢氧化钠溶液浓度小于0.4mol/L时，多糖与刚果红混合液的紫外吸收波长会随着NaOH溶液的浓度升高而增大，在这一NaOH溶液浓度范围内，随着溶液的碱性增强，多糖的三股螺旋结构为有序的状态，且多糖的三股螺旋结构会与刚果红络合，λmax会升高，OPS和OPS-1与刚果红混合液会产生红移现象。而当NaOH的浓度超过0.4mol/mL时，λmax略有降低，这可能是因为由于氢键的断裂，OPS-1分子间的氢键作用力减弱，三螺旋特征逐渐转化为无规卷曲。因此，可以证实OPS和OPS-1具有三股螺旋结构。许多三螺旋多糖具有不同的生物活性，包括抗癌、免疫调节和抗氧化活性。一些研究表明，三螺旋构象是报道的健康益处的主要原因。

2.11、热稳定性分析

随着温度的升高，多糖会发生水分的损失，结构的破坏，糖链的断裂，这些改变往往会伴随着多糖质量的改变。OPS和OPS-1的质量随温度升高的热重分析见图15，图16。

由图15可知，OPS主要有三个热损失阶段。第一个损失阶段温度在25-200℃，质量损失大约达10％左右，此处有一个明显的失热重峰，大约在80℃左右，这可能是由于OPS水分的散失造成质量损失。第二个损失阶段温度在200-450℃，质量损失达55％，此降解阶段的损失是由于OPS的化学结构降解，包括糖环脱水、解聚，以及水和二氧化碳的形成。第三个阶段在450-800℃，质量损失大约达7％左右，此阶段的损失这可能由于OPS样品碳化导致的。

由图16可知，OPS-1主要有三个热损失阶段，第一个降解阶段温度在25-200℃，质量损失大约达10％左右，此处有一个明显的失热重峰，大约在80℃左右。第二个损失阶段温度在200-450℃，质量损失达58％。第三个阶段在450-800℃，质量损失大约达7％左右。由此可以看出OPS和OPS-1具有相似的热稳定性。

2.12、抗氧化活性

DPPH自由基清除能力：DPPH是一种稳定的以氮为中心的自由基，这种自由基具有不成对电子。在DPPH自由基在暴露于质子自由基清除剂时，DPPH自由基的数量很容易减少，根据这一原理来对DPPH自由基清除能力进行检测。DPPH自由基在517nm处有强吸收，OPS-1与DPPH发生反应后会使其在517nm处的紫外吸收产生减色效应。检测多糖抗氧化能力的众多指标中，DPPH自由基的清除能力的检测最为常用。OPS和OPS-1的DPPH自由基清除能力如图17所示，a，b等不同字母代表同种物质在不同浓度下具有显著性差异(P<0.05)；A，B等不同字母代表不同种物质在相同浓度下具有显著性差异(P<0.05)。由图17可以看出，OPS-1具有很强的DPPH自由基清除能力。在0-0.5mg/mL浓度范围内，DPPH自由基的清除能力会随着OPS和OPS-1浓度的升高而显著增强(P<0.05)，OPS-1的DPPH自由基清除能力显著大于OPS的自由基清除能力(P<0.05)。当溶液的浓度为0.5mg/mL时，OPS的DPPH自由基的清除能力最高为(63.10±0.18)％，OPS-1的DPPH自由基的清除能力最高为(78.14±0.95)％。OPS和OPS-1清除DPPH自由基的IC 50分别为0.36mg/mL，0.23mg/mL。

ABTS自由基清除能力：ABTS自由基清除能力是应用广泛的一种检测抗氧化能力的方法。ABTS(2，2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)是一种以氮为中心的合成自由基阳离子，它是用过硫酸钾氧化ABTS生成的。抗氧化剂成分可以通过提供电子将ABTS转化为其非自由基形式。这种抗氧化试验可以根据在734nm下含有ABTS根阳离子的蓝绿色溶液的还原来测量。近年来，从天然来源中提取的多糖显示了相当大的ABTS自由基清除活性。OPS和OPS-1的ABTS自由基清除能力如图18所示。由图18可以看出，在OPS-1溶液浓度为0-5.0mg/mL，ABTS自由基清除率会随溶液浓度显著提升(P<0.05)，在OPS溶液浓度为0-4.0mg/mL，ABTS自由基清除率会随溶液浓度显著提升(P<0.05)。当溶液的浓度为5mg/mL时，OPS和OPS-1的ABTS自由基的清除能力最高，其ABTS自由基的清除能力分别为(61.60±0.29)％、(63.39±0.66)％。OPS清除ABTS自由基的IC 50为2.71mg/mL，OPS-1清除ABTS自由基的IC50为2.96mg/mL。OPS-1的ABTS自由基的清除能力高于OPS，且OPS-1的ABTS自由基的清除能力的IC 50值小于OPS。OPS和OPS-1的DPPH自由基清除能力以及ABTS自由基清除能力的IC50均小于Getachew等人报道的9.60mg/mL以及13.52mg/mL，这可能是因为OPS-1具有更大的分子量从而表现出更强的抗氧化能力。

亚铁离子螯合能力：亚铁离子抗氧化的机制不是对自由基进行直接的清除，而是通过螯合离子间接抑制自由基的产生。过渡金属离子可以催化超氧化物和过氧化氢发生芬顿反应产生极其活泼的羟基自由基，而自由基的生成可以加速脂质的氧化以及DNA的损伤，将多糖与亚铁离子等过渡金属进行螯合能降低自由基的产生。OPS和OPS-1的亚铁离子螯合能力如图19所示。由图19可以看出，在OPS和OPS-1浓度在0-5.0mg/mL，亚铁离子的螯合能力会随着溶液浓度的升高显著增强(P<0.05)，OPS-1的亚铁离子螯合能力显著高于OPS的亚铁离子螯合能力(P<0.05)。在溶液浓度为5.0mg/mL时，亚铁离子螯合能力最高，分别为(60.52±0.77)％、(70.84±0.56)％。OPS亚铁离子螯合能力的IC 50为4.15mg/mL，OPS-1亚铁离子螯合能力的IC 50为2.33mg/mL。而Xu等人从camellia seed cake中分离出的多糖的最高亚铁离子能力为54.9％，OPS-1具有更强的亚铁离子螯合能力。

羟基自由基清除能力：由于高活性的OH自由基可以与一些生物分子快速发生反应，这些反应可能会导致邻近的组织或器官造成严重的损害。因此，寻找具有清除OH自由基能力的生物活性物质是增强肌体抗氧化防御的必要条件。研究发现，多糖能够抑制及清除羟基自由基，从而达到阻碍羟基自由基与生物活性分子结合的目的。OPS和OPS-1的羟基自由基清除能力如图20所示。由图20可以看出，OPS和OPS-1均具有较强的羟基自由基的清除能力，且在溶液浓度为0-5.0mg/mL，羟基自由基的清除能力会随着溶液中OPS-1的浓度增高而显著增高(P<0.05)，在溶液浓度为0-4.0mg/mL，羟基自由基的清除能力会随着溶液中OPS-1的浓度增高而显著增高(P<0.05)，OPS-1的羟基自由基清除能力显著高于OPS(P<0.05)。当溶液的浓度为5mg/mL时，OPS和OPS-1都表现出最强的羟基自由基的清除能力，其羟基自由基的清除能力最高分别为(64.37±1.45)％、(74.26±0.20)％。OPS和OPS-1对于羟基自由基清除能力的IC

2.13、抑菌能力：多糖OPS和OPS-1会具有有益菌作用，因此会在平板上出现一个没有微生物生长的透明圆圈，见图21，其中，A为OPS-1，B为OPS，C为青霉素钠，D为去离子水。

通过测量平板中培养基上的抑菌圈的直径来确定OPS和OPS-1对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及金黄色葡萄菌的生长繁殖的抑制能力。如表4所示，OPS和OPS-1对这三种菌株表现出不同的抑菌活性，OPS的抑制效果为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>鼠伤寒沙门氏菌，OPS对大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(10.9±0.6)、(10.7±1.0)、(11.1±0.9)mm。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌对OPS中度敏感。OPS-1的抑制效果为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>鼠伤寒沙门氏菌，OPS-1对大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(14.2±0.3)、(13.8±1.0)、(14.4±0.9)mm。大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均对OPS-1中度敏感。OPS和OPS-1均小于阳性对照对大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径。但OPS-1的抑菌能力显著高于OPS的抑菌能力(P<0.05)。

表4牡蛎多糖的抑菌能力

注：a，b等不同字母代表不同种物质对相同菌株的抑菌圈直径具有显著性差异(P<0.05)；A，B等不同字母代表同种物质对不同菌株的抑菌圈直径具有显著性差异(P<0.05)。

实施例2

一种牡蛎多糖的提取方法，包括以下步骤：取新鲜牡蛎肉50g，经粉碎后形成匀浆，加入去离子水750mL，并将pH调节至10.5，在60℃下水浴4h进行提取，过滤后进行离心；弃去离心产生的沉淀后，将上层清液通过减压进行浓缩，获得浓缩液，浓缩液的重量为50g，向浓缩液无水乙醇150mL，醇沉30h；4000r/min离心30min，取沉淀，用95％乙醇、无水乙醇、丙酮(丙酮过夜洗涤)分别进行3次洗涤；再在沉淀中加入15倍体积水溶解，调pH至5获得溶解液，加入相当于溶解液体积的0.3％的菠萝蛋白酶，55℃酶解5h，再调pH至9，再加入相当于溶解液体积的1％的碱性蛋白酶，50℃酶解5h，获得酶解液；将酶解液于85℃水浴15min，灭活菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶；再在酶解液中加入sevag液，sevag液中四氯化碳和正丁醇的体积比为4:1，1/4倍量，震荡20min，离心弃去沉淀，重复多次至不再产生白色絮状沉淀，于35℃烘箱烘干，即得牡蛎粗多糖OPS；

称取40.0g DEAE-纤维素干粉，预处理后(DEAE-纤维素干粉的预处理方法为：将DEAE-纤维素干粉置于去离子水中溶胀18h，DEAE-纤维素干粉与去离子水的质量体积比为1:2.5，去除杂质与悬浮颗粒后以湿法装入层析柱中)装入层析柱(径高比为1:25)并进行柱平衡，待装柱完成后用去离子水以1.5mL/min的流速对层析柱进行2.5个柱体积洗脱，以对层析柱进行平衡。制备上样液，将牡蛎粗多糖OPS 120mg充分溶解于24mL去离子水中，在转速为6000r/min的条件下离心15min，将不溶性沉淀去除，再将上层清液过0.45μm滤膜，制得上样液。上样至DEAE-纤维素层析柱，依次以0、0.05、0.1、0.3mol/L NaCl溶液进行洗脱3个柱体积。通过自动接样器以流速为1.2mL/min，每13min一管，对馏分进行收集；将所收集的馏分采用苯酚-硫酸法进行监测，合并490nm时吸光度大于1.5的管，透析36h后，冷冻干燥，获得OPS-1样品粉末。OPS-1中的总糖含量大于84％。

牡蛎多糖在抑菌剂中的应用。

牡蛎多糖在抗氧化剂中的应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。