哈茨木霉施用方式对烟草生长和诱导抗性的应用

摘要

本发明涉及哈茨木霉施用方式对烟草生长和诱导抗性的应用，该应用的具体操作步骤如下：S1、试验材料：供试培养基和菌液制备；S2、试验处理：S2.1对照处理、S2.2浸种处理、S2.3灌根处理和S2.4叶面接种处理；S3、试验测定指标及方法：S3.1生物学性状测定、S3.2生理生化指标测定和S3.3抗病性及诱导抗性指标测定；S4、数据处理；进行数据差异显著性检验；木霉不同施用方式均能促进烟株生长，降低黑胫病发生，其中移栽期灌根处理效果最佳。

说明书

技术领域

本发明涉及烟草生长技术领域，尤其涉及哈茨木霉施用方式对烟草生长和诱导抗性的应用。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物，由于长期连作及过量化肥、农药施用，烟区土壤质量下降、病害发生日益严重、烟叶品质降低，同时对生态环境产生一系列负面影响，烟草黑胫病是由烟草疫霉菌引起的一种土传真菌病害，在我国各烟区普遍发生，病害严重地块烟草黑胫病发病率高达75％以上，是危害烟叶生产的主要病害之一，严重影响了烟叶生产的可持续发展。

发明内容

本发明解决的问题在于提供哈茨木霉施用方式对烟草生长和诱导抗性的应用，哈茨木霉不同施用方式均能促进烟株生长，降低黑胫病发生，其中移栽期灌根处理效果最佳。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

哈茨木霉施用方式对烟草生长和诱导抗性的应用，该应用的具体操作步骤如下：

S1、试验材料：

S1.1供试培养基：

PDA：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g和蒸馏水1000mL，pH自然；

燕麦琼脂培养基OA：60g燕麦仁、20g蔗糖、8g琼脂和蒸馏水1000mL，pH自然；

S1.2菌液制备：

将哈茨木霉CGMCC23294接入PDA平板于27±1℃，培养5～7d后，用无菌水冲洗下孢子，制成1×107cfu/mL哈茨木霉孢子悬浮液备用，将烟草疫霉接入燕麦琼脂OA培养基26±1℃，培养6～7d后，用无菌水冲洗下孢子，并调节为1×105cfu/mL疫霉孢子悬浮液备用；

S2、试验处理：

温室大棚内进行，盆栽土壤采用大田耕层土壤，除去杂草和石子后过1×1cm筛网，按1.83g/kg添加复合肥m(N)：m(P2O5)：m(K2O)＝1：1.5：3，充分混匀，装入内口径20.5cm，高度13.5cm的花盆，每盆装土3kg；

S2.1对照处理：

将烟草种子表面消毒后，播种于装有已灭菌基质的漂浮育苗盘中培育，总计50株；

S2.2浸种处理：

将烟草种子表面消毒后，用哈茨木霉CGMCC23294悬浮液浸种48h，无菌水漂洗干净，播种于装有已灭菌基质的漂浮育苗盘中，待烟苗到达成苗期装盆移栽至温室；

S2.3灌根处理：

消毒后的烟草种子，采用常规漂浮育苗，待烟苗到达成苗期装盆移栽，利用哈茨木霉孢子悬浮液进行灌根处理，每株烟接种20mL，总计50株；

S2.4叶面接种处理：

烟苗长至成苗期后移栽，移栽当天，将哈茨木霉孢子悬浮液均匀喷施在烟苗叶片上直至叶表面布满一层细微水珠而不滴落为止，每株烟均匀喷施20mL，总计50株；

S3、试验测定指标及方法：

S3.1生物学性状测定：

移栽后28d进行生长量指标测定，各处理选取5株，测量株高、茎围、叶片长度和宽度，自上而下第5片叶，计算叶面积，其中叶面积＝0.6345×叶长×叶宽；将盆内土壤倒出，轻轻抖落根部土壤，用清水反复冲洗干净，吸水纸吸干水分称量地上部和地下部鲜重，通过EPSON根系扫描仪将根系完整扫描的图像存入计算机，利用WinRHIZO分析总根长、根表面积、平均根直径、根体积及分枝数，扫描后的根部同地上部在105℃烘箱杀青15min后，70℃烘干测干重及根冠比；

S3.2生理生化指标测定：

移栽后7、14、21、28d，各处理采样，自上而下第4片叶，避开叶脉取0.5g，采用丙酮乙醇提取比色法，测定叶绿素含量，采用TTC法测根系活力，采用活体分光光度法测根系硝酸还原酶活性，每个处理3次重复；

S3.3抗病性及诱导抗性指标测定：

各处理烟苗在移栽后28d，采用灌根接种法，将配制好的烟草疫霉孢子悬浮液1×105cfu/mL均匀接种20mL在烟株根部土壤14d后调查发病率，计算病情指数及防治效果，

取各处理烟株根部测定过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL活性和过氧化氢酶CAT活性，各处理3次重复；

S4、数据处理：

进行数据差异显著性检验。

优选的，所述表面消毒通过75％酒精的消毒1min，然后通过30％双氧水消毒5min。

优选的，所述哈茨木霉孢子悬浮液灌根与叶面喷施处理时间相同，各处理烟株同一时间移栽，且移栽方式与后续管理措施保持一致。

本发明的有益效果是：木霉CGMCC23294菌株对烟草地上部和地下部生物学性状及生物量积累均具有显著促进作用，对叶面积的促进效果优于株高和茎围，整体表现为灌根>浸种>叶面喷施，灌根处理烟苗移栽后28d地上部和地下部鲜重较对照分别增加了84.16％和82.12％，移栽后28d内，3种施用方式处理的烟草根系硝酸还原酶活性、根系活力、叶片叶绿素含量均显著高于对照，灌根处理效果优于浸种和叶面喷施，灌根处理烟草黑胫病发病率和病情指数均显著低于对照和其它处理方式，提高了烟草根系细胞防御性酶PPO、PAL和CAT活性；

木霉不同施用方式均能促进烟株生长，降低黑胫病发生，其中移栽期灌根处理效果最佳。

附图说明

图1为本发明哈茨木霉不同施用方式烟株地上部生物学性状图；

图2为本发明哈茨木霉不同施用方式烟株地下部生物学性状图；

图3为本发明哈茨木霉不同施用方式烟株生物量积累图；

图4为本发明哈茨木霉不同施用方式烟草硝酸还原酶活性和叶绿素含量折线图；

图5为本发明哈茨木霉不同施用方式烟草根系活力柱状图；

图6为本发明哈茨木霉不同施用方式烟草黑胫病拮抗效果图；

图7为本发明哈茨木霉施用方式对烟草诱导抗性的影响图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

下面给出具体实施例。

参见图1～图7，哈茨木霉施用方式对烟草生长和诱导抗性的应用，该应用的具体操作步骤如下：

S1、试验材料：

S1.1供试培养基：

PDA：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g和蒸馏水1000mL，pH自然；

燕麦琼脂培养基OA：60g燕麦仁、20g蔗糖、8g琼脂和蒸馏水1000mL，pH自然；

S1.2菌液制备：

将哈茨木霉CGMCC23294接入PDA平板于27±1℃，培养5～7d后，用无菌水冲洗下孢子，制成1×107cfu/mL哈茨木霉孢子悬浮液备用，将烟草疫霉接入燕麦琼脂OA培养基26±1℃，培养6～7d后，用无菌水冲洗下孢子，并调节为1×105cfu/mL疫霉孢子悬浮液备用；

S2、试验处理：

温室大棚内进行，盆栽土壤采用大田耕层土壤，除去杂草和石子后过1×1cm筛网，按1.83g/kg添加复合肥m(N)：m(P2O5)：m(K2O)＝1：1.5：3，充分混匀，装入内口径20.5cm，高度13.5cm的花盆，每盆装土3kg；

S2.1对照处理：

将烟草种子表面消毒后，播种于装有已灭菌基质的漂浮育苗盘中培育，总计50株，表面消毒通过75％酒精的消毒1min，然后通过30％双氧水消毒5min；

S2.2浸种处理：

将烟草种子表面消毒后，用哈茨木霉CGMCC23294悬浮液浸种48h，无菌水漂洗干净，播种于装有已灭菌基质的漂浮育苗盘中，待烟苗到达成苗期装盆移栽至温室；

S2.3灌根处理：

消毒后的烟草种子，采用常规漂浮育苗，待烟苗到达成苗期装盆移栽，利用哈茨木霉孢子悬浮液进行灌根处理，每株烟接种20mL，总计50株；

S2.4叶面接种处理：

烟苗长至成苗期后移栽，移栽当天，将哈茨木霉孢子悬浮液均匀喷施在烟苗叶片上直至叶表面布满一层细微水珠而不滴落为止，每株烟均匀喷施20mL，总计50株；

哈茨木霉孢子悬浮液灌根与叶面喷施处理时间相同，各处理烟株同一时间移栽，且移栽方式与后续管理措施保持一致

S3、试验测定指标及方法：

S3.1生物学性状测定：

移栽后28d进行生长量指标测定，各处理选取5株，测量株高、茎围、叶片长度和宽度，自上而下第5片叶，计算叶面积，其中叶面积＝0.6345×叶长×叶宽；将盆内土壤倒出，轻轻抖落根部土壤，用清水反复冲洗干净，吸水纸吸干水分称量地上部和地下部鲜重，通过EPSON根系扫描仪将根系完整扫描的图像存入计算机，利用WinRHIZO分析总根长、根表面积、平均根直径、根体积及分枝数，扫描后的根部同地上部在105℃烘箱杀青15min后，70℃烘干测干重及根冠比；

S3.2生理生化指标测定：

移栽后7、14、21、28d，各处理采样，自上而下第4片叶，避开叶脉取0.5g，采用丙酮乙醇提取比色法，测定叶绿素含量，采用TTC法测根系活力，采用活体分光光度法测根系硝酸还原酶活性，每个处理3次重复；

S3.3抗病性及诱导抗性指标测定：

各处理烟苗在移栽后28d，采用灌根接种法，将配制好的烟草疫霉孢子悬浮液1×105cfu/mL均匀接种20mL在烟株根部土壤14d后调查发病率，计算病情指数及防治效果，

取各处理烟株根部测定过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL活性和过氧化氢酶CAT活性，各处理3次重复；

发病率＝[病叶株数/调查总数株数]×100

病情指数＝∑(病级数×该级病株数)/(最高病级数×调查总株树)×100

防治效果(％)＝(未发病株数/调查总株数)×100；

S4、数据处理：

进行数据差异显著性检验。

1、哈茨木霉施用方式对烟草生物学性状的影响

1.1对烟草地上部生物学性状的影响

由图1可知，与对照相比，在移栽后28d，哈茨木霉3种施用方式对烟草地上部生长具有明显促进作用，其中灌根处理对烟草株高和叶面积提高效果最显著，较对照分别增加54.21％和67.42％，P<0.05，显著高于浸种和叶面喷施处理；相较空白对照，3种处理方式对茎围增加均有显著影响，叶面喷施处理增幅最大达到23.40％，P<0.05；

整体来看，哈茨木霉对烟草叶片和株高促进效果优于茎围，即叶片>株高>茎围。

1.2对烟草地下部生物学性状的影响

结合图2可知，3种施用方式对烟草根部各指标均有不同程度促进作用，哈茨木霉灌根处理的烟株在移栽后28d根系更发达，各根系指标均高于浸种和叶面喷施处理，茨木霉灌根处理的烟株平均根直径、根体积和分枝数较空白对照增加显著，增幅分别达87.63％、119.79％和80.46％，P<0.05；浸种处理对烟草根表面积和根体积提高较显著，分别达到49.60％和85.03％，P<0.05，与灌根处理效果相近；叶面喷施对于烟草根表面积、平均根直径及根体积影响不显著，较空白对照增加14.02％、4.12％和17.47％(P<0.05)，木霉施用方式对烟草地上部和地下部生物学性状影响相同，即灌根>浸种>叶面喷施；

1.3对烟草生物量积累的影响

由图3可知，哈茨木霉浸种、灌根和叶面喷施处理的烟株地上部和地下部生物量积累均显著高于空白，其中以灌根处理的促进作用最强，浸种处理居中，叶面喷施较弱，灌根处理的地下部鲜重、地上部鲜重、地下部干重和地上部干重较对照分别增加了84.16％、82.12％、63.29％和64.17％，P<0.05，浸种处理烟草地上部的鲜重和干重提高较为显著，增幅分别为62.49％和58.35％，P<0.05，与灌根之间无显著差异；对照、浸种和灌根处理之间烟草根冠比不存在显著差异，经叶面喷施后烟草根冠比有所下降，说明哈茨木霉能促进烟草地上部和地下部生物量积累。

2、哈茨木霉施用方式对生理特性的影响

2.1对烟草根系硝酸还原酶活性和叶片叶绿素含量的影响

由图4可知，叶绿素含量随移栽时间逐渐增加，各时期含量均表现为灌根>浸种>叶面喷施>对照，其中浸种和灌根处理各时期叶绿素含量与空白之间均呈显著差异，最大增幅为33.70％和51.52％，P<0.05，分别出现在移栽后第7d和14d，移栽后28d两处理之间无显著差异；移栽后14d叶面喷施与空白处理差异不显著，第21d叶面喷施处理叶绿素含量比对照高21.61％，P<0.05；

各时期3种施用方式的烟草根系硝酸还原酶活性与对照之间均呈显著差异，总体变化趋势与叶绿素相同，随移栽时间逐渐增长，灌根处理烟草根系硝酸还原酶活性始终处于较高水平，浸种和灌根处理在移栽后21d增幅达到最大，分别为29.54％和55.72％，P<0.05；叶面喷施处理在移栽后第14d较空白对照差异最显著，增加24.77％，P<0.05，移栽后28d灌根处理烟草根系硝酸还原酶活性最高，浸种与叶面喷施处理之间无显著差异。

2.2对烟草根系活力的影响

由图5可知，木霉菌处理可以不同程度提高烟草根系活力，3种施用方式根系活力随移栽天数增加，呈现先升高后降低的趋势。其中以灌根处理促进作用最强，峰值出现在移栽后第14d，相较空白对照增幅最大，达到41.71％，P<0.05；浸种和叶面喷施处理根系活力峰值均出现在移栽后第21d，较空白分别提高20.35％和12.99％，P<0.05；空白处理根系活力逐渐升高，与各处理间差值随移栽后天数增加呈现缩小趋势，但移栽后28d仍显著低于木霉处理。

2.3哈茨木霉施用方式对烟草诱导抗性的影响

2.3.1对烟草黑胫病拮抗效果的影响

空白处理的发病率和病情指数均显著高于木霉处理，并以灌根处理对烟草黑胫病防治效果最显著，达到75.94％，病情指数由57.74降至13.89，P<0.05；哈茨木霉浸种和叶面喷施两者在烟草黑胫病发病率、病情指数和防治效果方面差异不显著，其防效分别为53.32％和49.48％，P<0.05；

2.3.2对烟草诱导抗性的影响

诱导抗性通常以防御性酶POD、PPO、PAL及CAT活性表示，从图7可看出，哈茨木霉对4种防御性酶活性具有诱导效应；

POD酶活性：3种施用方式均有效提高了烟草根部POD活性，但三者之间无显著差异，灌根处理后烟草POD活性较对照增加28.70％(P<0.05)，略高于浸种和叶面喷施处理；

PPO酶活性：以灌根处理作用效果最显著，较空白提高71.34，P<0.05；浸种与叶面喷施处理之间无显著差异，分别较对照增加33.84％和39.63％，P<0.05；

PAL酶活性：浸种处理后烟草根部PAL活性较空白升高5.87％，P<0.05，与空白间无显著差异；灌根和叶面喷施处理能显著提高PAL活性，分别提高66.75％和32.52％，P<0.05；

CAT酶活性：浸种和灌根处理对CAT活性促进作用最明显，达到80.33％和105.92％，P<0.05，叶面喷施效果显著低于浸种和灌根，仅增加28.7％，P<0.05，与空白之间差异不显著；

综上结果，3种施用方式对烟草根部POD、PPO、PAL和CAT活性均促进作用，其中以灌根处理对各防御性酶活性提高最显著。POD活性受木霉施用方式影响较小，PAL和CAT活性受施用方式影响最大，在受生物胁迫条件下，灌根处理有利于激发烟草根部POD、PPO、PAL和CAT活性，提高烟草诱导抗性。

本研究结果显示3种施用方式对烟株各生理指标促进效果整体表现为灌根>浸种>叶面喷施，经灌根处理后，烟株叶绿素含量更高，加快了叶片光合速率，增加碳水化合物的形成和积累，同时烟株根系活力和硝酸还原酶活性升高，提高土壤水肥吸收和氮素利用效率，从而促进烟株株高、叶面积、根体积扩展和生物量的积累，这也是木霉促进植物生长的机制之一。

植物—木霉—病原菌互作是一个复杂的系统，在植物抗病过程中诱导抗性起着至关重要的作用，它是指在外界因子诱导下，植物启动自身防御系统，包括防御性酶活性、木质化、植保素、病程相关蛋白等多种生理生化因子的合成，增强对病原菌的抗性现象；

POD、CAT是植物体内担负清除活性氧的主要酶，且POD能诱导木质素的合成；PAL作为植保素合成的关键酶，同时与PPO参与将酚类氧化为抗菌性更强的醌类物质的过程，已有大量研究表明木霉菌能诱导植物体内POD、CAT、PPO、PAL等防御性酶活性升高，抵制病原菌入侵，有效降低病害发生，在烟草疫霉胁迫下，经哈茨木霉灌根处理的烟株根系防御性酶活性最高，POD、PPO、PAL和CAT活性分别较对照升高28.70％、71.34％、66.75％和105.92％，同时烟草黑胫病防治效果达到75.94％，显著高于其他处理；

烟草黑胫病的防治效果随烟株体内防御性酶活性升高而提高，说明烟株在哈茨木霉诱导下可以提高抗性相关的酶活性，从而产生醌、木质素、植保素等物质阻止病原菌侵染，增强烟株抗病性，因此，诱导抗性是哈茨木霉CGMCC23294防治烟草黑胫病的重要机制。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。