AP质粒及其应用、PAP I酶的PACE定向进化系统及PAP I酶突变体

摘要

本发明提供一种AP质粒，其特征为：所述质粒表达gIII‑neg蛋白，且在其核糖体结合位点后部插入了一个或多个SEQ ID No.1所示的RyhB结合序列。还公开了其在PAP I酶的PACE定向进化中的应用及PAP I酶的PACE定向进化系统。并公开了筛选得到的PAP I酶突变体、编码基因、原核表达载体及原核表达系统。本发明在PACE定向进化方法中引入了大肠杆菌非编码RNA RyhB sRNA，抑制gIII‑neg蛋白的翻译，解除gIII‑neg蛋白对子代噬菌体包装的不利影响。聚腺苷化活性越强的PAP I，越能延长RyhB的半衰期，促进后者对gIII‑neg蛋白的翻译抑制作用。噬菌体在多次传代后形成种群优势并被分离测序，最终获得活力显著提升的PAP I。

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种AP质粒及其应用、PAP I酶的PACE定向进化系统及PAP I酶突变体、编码基因、原核表达载体和原核表达系统，属于生物技术领域。

背景技术

PAP I为大肠杆菌Poly(A)聚合酶I(Poly(A)polymerase I)，负责RNA分子3’端聚腺苷化，可作用于胞内绝大多数mRNA转录本进而降低mRNA的半衰期。PAP I存在明显的细胞毒性，因此细胞内的PAP I水平与细胞的生长速率成反比，过量的PAP I会导致细菌生长缓慢。这种毒性是由于PAP I会将成熟的tRNA的3’末端聚腺苷化，从而妨碍酰胺基-tRNA合成酶的酰胺基化，最终影响蛋白质的合成和细胞生长。正因为上述原因，过表达PAP I的细胞通常生长缓慢，并且PAP I的表达水平较低。鉴于PAP I为模板非依赖型RNA聚合酶，它可被用于体外RNA加尾实验，一方面可以稳定RNA，另一方面可为反转录提供接头结合区域。

除了影响mRNA和tRNA，PAP I也被报道可作用于sRNA的3’末端，延长sRNA的半衰期。sRNA是细菌表达的一类非编码RNA，长度范围通常在20nt-400nt之间，依赖局部碱基的互补配对调节靶mRNA的翻译。大多数情况下，sRNA的作用需要Hfq蛋白的参与，以提升sRNA的稳定性或sRNA与mRNA结合的亲和力。由于特定二级结构的存在，同一sRNA与不同靶点的结合区域序列存在一定的保守性。根据Dhriti Sinha的报道，PAP I对大肠杆菌RyhB sRNA的稳定和功能发挥有重要作用。RyhB的聚腺苷化可显著提升稳定性，进而促进其与靶点的作用，加速部分靶mRNA的降解使翻译流产。

PACE是一种依赖于噬菌体快速繁殖而实现蛋白定向进化的系统，与目标蛋白酶学性能相偶联的噬菌体包装蛋白gIII的表达水平越高，子代噬菌体的丰度越高。在体内诱变系统的作用下，伴随着噬菌体传代目标突变体的DNA序列即子代噬菌体被富集。PACE的负筛选体系则取决于功能缺陷的gIII-neg的蛋白浓度，gIII-neg浓度越低，子代噬菌体越容易繁殖。该策略与sRNA的翻译负调节作用可实现兼容，用于搭建一套独特的蛋白进化系统。考虑到PAP I可用于体外RNA修饰，但野生型PAP I不够理想，这一种进化体系可用于提高PAPI的酶学性能。

发明内容

本发明的目的是提供一种高活性重组热敏型UDG突变体，相比野生型UDG，其热失活温度明显降低。

本发明提供了一种AP质粒，其特征为：所述质粒表达gIII-neg蛋白，且在其核糖体结合位点后部插入了一个或多个SEQ ID No.1所示的RyhB结合序列，AP质粒中RyhB-gIII-neg的序列可以如SEQ ID No.5所示。

本发明还公开了上述的AP质粒在PAP I酶的PACE定向进化中的应用。

本发明还公开了一种PAP I酶的PACE定向进化系统，其特征在于包括：上述的AP质粒、DP质粒和SP质粒、宿主菌，所述DP质粒携带野生型gIII基因和野生型PAP I表达基因，所述SP质粒为M13噬菌体基因组，其中gIII基因被野生型PAP I表达基因取代。

优选的，所述AP质粒和DP质粒含有不同的抗性基因，其中DP含氯霉素抗性基因，AP为羧苄青霉素抗性基因。

优选的，所述宿主菌为大肠杆菌，优选的为S1030感受态细胞。

本发明还公开了采用上述方法获得的PAP I酶突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

上述的PAP I酶突变体的编码基因，其特征在于其核酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述的PAP I酶突变体的原核表达载体。

上述的PAP I酶突变体的原核表达载体，其特征在于：载体采用pET21b(+)质粒。

上述的PAP I酶突变体的原核表达系统，其特征在于：将上述的原核表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。

本发明改进了负向筛选的PACE定向进化方法，并用该方法获得了一种体外聚腺苷化活性增强的PAP I酶。PACE定向进化方法中引入了大肠杆菌非编码RNA-RyhB sRNA，用于抑制gIII-neg蛋白的翻译，从而解除gIII-neg蛋白对子代噬菌体包装的不利影响。聚腺苷化活性越强的PAP I，越能延长RyhB的半衰期，促进后者对gIII-neg蛋白的翻译抑制作用。高活性的PAP I的编码序列则被包装进入子代噬菌体，噬菌体在多次传代后形成种群优势并被分离测序，最终获得活力显著提升的PAP I。

抑制gIII-neg蛋白翻译的实现，是通过在gIII-neg基因的5’-UTR引入RyhB的结合位点，优选在核糖体结合位点附近引入一个或多个RyhB结合序列来实现的。所述RyhB的结合序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明得到的活力显著提升的PAP I酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，相较于如SEQ ID NO.3所示的野生型PAP I具有以下突变：G68R、P198A、T227S；编码上述氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示。

附图说明

图1为PAP I酶进化方案示意图。a为酶进化PACE系统所用的DP、AP、SP质粒，DP质粒提供野生型gIII蛋白和诱变基因；AP质粒可表达gIII-neg蛋白，其核糖体结合位点后部插入了RyhB结合序列；SP质粒为改造后的M13噬菌体基因组，gIII基因被PAP I表达基因pcnB取代。b为PAP I蛋白、RyhB sRNA、gIII neg mRNA相互作用示意图。

图2为AP质粒的结构示意图。

图3为SP质粒的结构示意图。

图4为PAP I酶的纯化结果。S代表超声上清液，Ft为流穿液，W为洗涤液，A1为洗脱液。

图5为变体PAP I酶及竞品PAP I酶体外聚合结果电泳图。Control为竞品poly(A)polymerase I组，PAP I为纯化后的变体蛋白组。

具体实施方式

实施例1：

噬菌体制备：

1、按图1所示的结构构建所需AP、DP、SP质粒，其中DP含氯霉素抗性基因，AP为羧苄青霉素抗性基因；DP载体货号Addgene plasmid#140446，SP载体货号NEB N4040S；

2、分别取50ng DP和SP质粒加入100μL大肠杆菌S1030感受态细胞(Addgeneplasmid#105063)，冰水浴中孵育30min后转移至42℃水浴中孵育2min，向混合物中加入900μL预冷的LB液体培养基，37℃、250rpm复苏1h；

3、将复苏后的培养液接种至9mL LB培养基，并添加终浓度为200ng/mL的脱水四环素诱导gIII蛋白表达，以及终浓度为25μg的氯霉素，37℃、250rpm培养过夜；

4、取1mL培养液，4℃、8000×g离心10min后分离上清液并用0.22μm滤膜过滤；

5、取100μL滤液，用新鲜LB梯度稀释至10

6、分别取100μL 10

7、计算半固体平板中噬菌斑个数，并挑取1-2个噬菌斑接种至OD

宿主细胞制备：

8、将AP、DP质粒共转化至大肠杆菌S1030感受态细胞，复苏后取100μL培养液涂布于氯霉素、羧苄霉素双抗平板，37℃导致培养过夜；

9、取单克隆接种至5mL氯霉素、羧苄霉素双抗LB培养基中，37℃、250rpm培养过夜；

10、按1％比例接种，至AP&DP/S1030生长至OD

PAP I进化：

11、将200μL步骤7中的上清液接种至步骤10的菌液中，除添加氯霉素、羧苄霉素两种抗生素以维持质粒稳定外，添加终浓度为0.02％的L-阿拉伯糖和200ng/mL的脱水四环素分别诱导诱变基因和gIII蛋白表达，37℃、250rpm培养8h；

12、取1mL培养液，4℃、8000×g离心10min后分离上清液并用0.22μm滤膜过滤；

13、重复11-12步约10-20次，每轮接种后剩余的上清液可冻存于-20℃冰箱；

14、取100μL滤液，用新鲜LB梯度稀释至10

15、分别取100μL 10

16、取平板中噬菌斑进行测序，获得丰度较高的噬菌体内的目标序列，序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

实施例2：热敏UDG酶突变体纯化

1、将获得的优选PAP I氨基酸序列根据大肠杆菌密码子的偏好性进行优化，最终DNA序列如SEQ NO.4所示；

2、合成上述DNA序列并将其连接至pET21b(+)载体，取10ng连接好的质粒加入到100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰水浴中孵育30min后转移至42℃水浴中孵育2min，向混合物中加入900μL预冷的LB液体培养基，37℃、250rpm复苏1h；

3、取50μL连接液涂布于羧苄青霉素抗性平板，37℃倒置培养过夜；

4、挑取单克隆接种于含羧苄青霉素抗性的液体培养基中，37℃、250rpm培养过夜；

5、按1％比例接种菌液至800mL 2×YT培养基，37℃、250rpm培养至OD

6、37℃、250rpm培养4h后收集菌体，用PBS洗涤两次后用100mL PBS重悬菌体；

7、于冰水浴中60％功率、2s ON/2S OFF条件下超声30min破壁，4℃、12000×g离心30min后分离上清；

8、将上清液用0.22μm孔径滤膜过滤，用TOSOH 5mL Heparin柱纯化，结果如图2所示，PAP I纯度大于90％；

9、测定E.coli poly(A)聚合酶(NEB M0276S)及纯化后的PAP I蛋白的浓度，按0.1μg、0.2μg、0.4μg、0.8μg的质量分别取两种酶投入反应，反应体系如下表：

RNA模板序列：5’-AUGACCAGGAUGCCAUUGCUGUGG-3’；

10、将反应体系置于37℃反应40min，随后将各反应管加热至90℃以终止反应；

11、制备2％的琼脂糖凝胶，上样后200V电泳10min，结果如图3所示：相同浓度下PAP I的产物浓度显著高于对照组，且各梯度下产物条带长度也大于对照组。表明本发明进化获得的PAP I酶学性能更优。

序列表

<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司

<120> AP质粒及其应用、PAP I酶的PACE定向进化系统及PAP I酶突变体

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 1

aagaacagca tgtgggcg 18

<210> 2

<211> 465

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 2

Met Phe Thr Arg Val Ala Asn Phe Cys Arg Lys Val Leu Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Ser Glu Ala Glu Gln Ala Val Ala Arg Pro Gln Val Thr Val Ile

20 25 30

Pro Arg Glu Gln His Ala Ile Ser Arg Lys Asp Ile Ser Glu Asn Ala

35 40 45

Leu Lys Val Met Tyr Arg Leu Asn Lys Ala Gly Tyr Glu Ala Trp Leu

50 55 60

Val Gly Arg Gly Val Arg Asp Leu Leu Leu Gly Lys Lys Pro Lys Asp

65 70 75 80

Phe Asp Val Thr Thr Asn Ala Thr Pro Glu Gln Val Arg Lys Leu Phe

85 90 95

Arg Asn Cys Arg Leu Val Gly Arg Arg Phe Arg Leu Ala His Val Met

100 105 110

Phe Gly Pro Glu Ile Ile Glu Val Ala Thr Phe Arg Gly His His Glu

115 120 125

Gly Asn Ile Ser Asp Arg Thr Thr Ser Gln Arg Gly Gln Asn Gly Met

130 135 140

Leu Leu Arg Asp Asn Ile Phe Gly Ser Ile Glu Glu Asp Ala Gln Arg

145 150 155 160

Arg Asp Phe Thr Ile Asn Ser Leu Tyr Tyr Ser Val Ala Asp Phe Thr

165 170 175

Val Arg Asp Tyr Val Gly Gly Met Lys Asp Leu Lys Asp Gly Val Ile

180 185 190

Arg Leu Ile Gly Asn Ala Glu Thr Arg Tyr Arg Glu Asp Pro Val Arg

195 200 205

Met Leu Arg Ala Val Arg Phe Ala Ala Lys Leu Gly Met Arg Ile Ser

210 215 220

Pro Glu Ser Ala Glu Pro Ile Pro Arg Leu Ala Thr Leu Leu Asn Asp

225 230 235 240

Ile Pro Pro Ala Arg Leu Phe Glu Glu Ser Leu Lys Leu Leu Gln Ala

245 250 255

Gly Tyr Gly Tyr Glu Thr Tyr Lys Leu Leu Cys Glu Tyr His Leu Phe

260 265 270

Gln Pro Leu Phe Pro Thr Ile Thr Arg Tyr Phe Thr Glu Asn Gly Asp

275 280 285

Ser Pro Met Glu Arg Ile Ile Glu Gln Val Leu Lys Asn Thr Asp Thr

290 295 300

Arg Ile His Asn Asp Met Arg Val Asn Pro Ala Phe Leu Phe Ala Ala

305 310 315 320

Met Phe Trp Tyr Pro Leu Leu Glu Thr Ala Gln Lys Ile Ala Gln Glu

325 330 335

Ser Gly Leu Thr Tyr His Asp Ala Phe Ala Leu Ala Met Asn Asp Val

340 345 350

Leu Asp Glu Ala Cys Arg Ser Leu Ala Ile Pro Lys Arg Leu Thr Thr

355 360 365

Leu Thr Arg Asp Ile Trp Gln Leu Gln Leu Arg Met Ser Arg Arg Gln

370 375 380

Gly Lys Arg Ala Trp Lys Leu Leu Glu His Pro Lys Phe Arg Ala Ala

385 390 395 400

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<211> 465

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cgtaaagaca tctctgaaaa cgctctgaaa gttatgtacc gtctgaacaa agctggttac 180

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ctggttggtc gtcgtttccg tctggctcac gttatgttcg gtccggaaat catcgaagtt 360

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cgtgacttca ccatcaactc tctgtactac tctgttgctg acttcaccgt tcgtgactac 540

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tctcgtcgtc agggtaaacg tgcttggaaa ctgctggaac acccgaaatt ccgtgctgct 1200

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tatgtatgtg tttagcacct ttgcgaacat tctgcgcaac aaagaaagct aa 1492