基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法

摘要

本发明公开了基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法，该方法包括通过多轮DNA连接反应对组织细胞中的DNA、RNA、蛋白质、染色质以及糖类等分析物进行XYZ三维空间编码，再通过测序技术解析相应的空间位置和生物学信息，进而实现组织的三维空间组学分析。本发明基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法具有操作方便、技术门槛低、成本低廉等优点，能够获取完整组织异质细胞的三维空间分布及相应的生物学信息表达，广泛应用于神经科学、病理学、组织发育等方向的研究。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法。具体地，涉及一种通过多轮DNA连接反应间接或直接对组织细胞中的DNA、RNA、蛋白质、染色质以及糖类等分析物进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织细胞中的空间位置和生物学信息，从而实现组织的三维空间组学分析。

背景技术

在多细胞生物体中，不同细胞在组织中存在复杂的空间分布和相互联系，形成一个功能化、结构化以及动态平衡的生态体系。当生命体健康时，组织通过多个细胞的联合作用来维持体内平衡，并在不同的实质细胞和辅助细胞之间进行动态分工。当发生疾病时，伴随着组织细胞的组成和结构发生变化，组织功能障碍的产生通常跨越多种类型的细胞。细胞和分子在不同尺度的组织学形态通常反映了它们的联合功能，解析组织结构和功能之间的关系是组织生物学和病理学的研究基石。

传统的细胞分析方法一般大批量测量多个细胞的基因表达信息，从而掩盖了细胞之间基因表达的差异，丢失关键信息。近年来，单细胞测序技术得到了极大的发展，它可以研究单细胞基因表达异质性，但缺失了细胞空间分布的位置信息。为了解决该问题，空间组学应运而生。研究人员联合分析组织细胞的空间位置和基因表达信息，可以为研究细胞功能、细胞之间相互作用、组织微环境与细胞位置之间的关系提供重要信息。

空间组学技术自发展以来，已在神经科学、病理学、组织发育等方向得到初步应用。目前，空间组学大致分为基于激光捕获显微切割(LCM)、荧光原位杂交(FISH)、荧光原位测序(FISSEQ)和原位捕获等四种类型。具体地，激光显微切割法借助物理激光分割方法获取组织不同位点的细胞，虽然可进行三维空间组学研究，但实验操作复杂，仪器要求高以及分析通量低。荧光原位杂交法是基于多轮杂交成像来确定细胞内的基因信息表达，不过针对的是特定基因序列，因此需要预先合成靶向探针，具有实验流程复杂，耗时长、分析通量有限以及成本高等缺点。相比于荧光原位杂交，荧光原位测序可以使用非靶向探针来结合基因序列以进行原位测序，但依然存在操作复杂，成本高、分析通量有限以及测序读取序列短等问题。自2016年起，基于原位捕获的空间转录组学方法相继出现，其基本原理是使用带有polyT序列的点阵来捕获组织mRNA，结合二代测序技术，实现高通量空间转录组学研究。相比于前三类方法，基于原位捕获的空间组学测序技术操作更为简单，但多用于组织的二维空间组学分析，而不同器官和组织具有独特的三维细胞分布和基因表达图谱，对组织进行便捷、高覆盖率、低成本的三维空间组学研究具有极大的技术挑战性和重要的科学意义。三维空间组学的关键点在于如何突破二维层面的细胞研究，实现组织三维水平上不同细胞的空间分布、相互作用以及基因蛋白质等表达情况的全面解析。因此，本发明提出一种基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法，旨在实现细胞三维空间坐标解析、空间表达模式的基因识别、细胞-细胞交互作用分析，进而推动三维空间组学技术在生物医学领域的应用。

发明内容

本发明设计了一种基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法。通过多轮 DNA连接反应间接或直接对组织细胞中的DNA、RNA、蛋白质、染色质以及糖类等分析物进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间组学分析

本发明通过下述方案实现：

基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法，该方法通过多轮DNA连接反应间接或直接对组织中细胞的分析物进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间组学分析。

所述通过多轮DNA连接反应间接对组织细胞中的分析物进行三维空间编码具体包括以下步骤：

(1)提供L块基片，对基片的表面进行物理或化学修饰，使其产生可以与寡核苷酸5’端连接的基团；

(2)提供L种第一组定位寡核苷酸，命名为Z-DNA，其中Z-DNA的5’端修饰特定基团，与基片表面修饰基团连接；

(3)将L种Z-DNA分别连接到L块基片上，制作L块带有Z-DNA编码的基片；

(4)提供与Z-DNA的3’端杂交的夹板寡核苷酸1；

(5)提供M种第二组定位寡核苷酸，命名为X-DNA，其中X-DNA包含与夹板寡核苷酸1部分基本互补的序列，且5’端修饰磷酸基团，可与Z-DNA的3’端连接；

(6)将M种X-DNA与夹板寡核苷酸1退火杂交，沿X轴方向连接到Z-DNA 的3’端，形成M行X-DNA条形码；

(7)提供与X-DNA的3’端杂交的夹板寡核苷酸2；

(8)提供N种第三组定位寡核苷酸，命名为Y-DNA，其中Y-DNA包含与夹板寡核苷酸2部分基本互补的序列，且5’端修饰磷酸基团，可与X-DNA的3’端连接；

(9)将N种Y-DNA与夹板核苷酸2退火杂交，沿Y轴方向连接到X-DNA 的3’端，形成N列Y-DNA条形码，由此产生L种M*N个的三维空间编码阵列；

(10)取L片连续切割的组织样品分别与上述方法产生的L种M*N个空间编码阵列接触；

(11)释放组织样品中的分析物，与Y-DNA上的捕获域进行特异性结合；

(12)构建测序文库，上机进行二代测序，以鉴定与捕获域特异性结合的分析物及其空间位置信息；

(13)采用对应的生物信息学算法，对获得的测序数据，根据每块基片上 X-DNA编码和Y-DNA编码位置获得二维坐标(x

步骤(1)中所述基片为硅片、玻片、盖玻片、氧化铟锡导电玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯片中的一种。

步骤(1)中对基片的表面进行物理修饰或化学修饰，使其产生可以与寡核苷酸5’端连接的基团，所述物理修饰包括刻蚀、蒸镀、旋涂中的一种，所述化学修饰包括原位合成、共价偶联、分子组装、亲和作用中的一种。

步骤(1)中产生可以与寡核苷酸5’端连接的基团，所述基团包括琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、巯基、氨基、醛基、环氧、大环炔、叠氮其中的一种。

步骤(2)中所述第一组定位寡核苷酸Z-DNA5’端修饰特定基团，与基片表面修饰基团连接，所述基团包括NHS、马来酰亚胺、巯基、氨基、醛基、环氧、大环炔、叠氮其中的一种。

步骤(2)中所述L种第一组定位寡核苷酸Z-DNA包含空间条形码Z和两段恒定序列，所述两段恒定序列包括第一恒定序列和第二恒定序列，不同基片上 Z-DNA的空间条形码Z不同，共有L种空间条形码Z，且第一恒定序列为PCR 扩增接头，第二恒定序列与步骤(4)中所述夹板寡核苷酸1的部分序列互补。

步骤(3)中所述将L种Z-DNA分别连接到L种基片上，所述连接为共价偶联、分子组装、亲和作用中的一种。

步骤(5)中所述第二组定位寡核苷酸X-DNA包含空间条形码X，每一行 X-DNA的空间条形码X相同，形成M行X-DNA条形码。

步骤(5)中所述M种第二组定位寡核苷酸X-DNA还包含两段恒定序列，第三恒定序列和第四序列，第三恒定序列与步骤(4)中所述夹板寡核苷酸1的部分序列互补，第四恒定序列与步骤(7)中所述夹板寡核苷酸2的部分序列互补。

步骤(6)中所述将M种X-DNA与夹板寡核苷酸1退火杂交，沿X轴方向连接到Z-DNA的3’端，连接方法为DNA连接反应，分别连接X-DNA的5’端磷酸基团与Z-DNA3’端的羟基，且需借助微流控芯片、生物点样仪或者微孔阵列将X-DNA添加到对应的位置。

步骤(8)中所述第三组定位寡核苷酸Y-DNA包含空间条形码Y，每一列 Y-DNA的空间条形码Y相同，形成N列Y-DNA条形码。

步骤(8)中所述N种第三组定位寡核苷酸Y-DNA还包含独特分子识别符、一段恒定序列以及捕获域，所述恒定序列与步骤(7)中所述夹板寡核苷酸2的部分序列互补。

步骤(8)中所述Y-DNA的捕获域为特异性序列，优选为polyT。

步骤(9)中所述将N种Y-DNA与夹板寡核苷酸2退火杂交，沿Y轴方向连接到X-DNA的3’端，连接方法为DNA连接反应，分别连接Y-DNA的5’端磷酸基团与X-DNA3’端的羟基，且需借助微流控芯片、生物点样仪或者微孔阵列将Y-DNA添加到对应的位置。

步骤(9)中所述M种X-DNA编码和N种Y-DNA编码实现M*N个二维空间编码，结合L种Z-DNA，最终形成L种M*N个三维空间编码阵列。

步骤(9)中所述M种X-DNA编码和N种Y-DNA编码实现M*N个二维空间编码，空间编码阵列的分辨率为100μm-0.5μm。

步骤(9)中所述L为1-100中的任意整数，M、N为10-1000之间的任一整数。

步骤(10)中所述组织样品为石蜡或者新鲜冰冻组织切片。

步骤(10)中所述L块组织切片的厚度相同，厚度为5μm-50μm，所述组织切片按照上下顺序依次粘附在对应的空间编码阵列基片上。

步骤(11)中所述组织样品中的分析物包括DNA、RNA、蛋白质、染色质以及糖类中的一种或者数种。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，包括使用蛋白酶或表面活性剂透化组织，优选为胃蛋白酶。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位DNA或者染色质开放区域，还需使用转座酶切割DNA双链，插入连接接头，使其与空间编码阵列的捕获域结合。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位RNA，透化组织后，可直接利用空间编码阵列Y-DNA上的polyT与mRNA的3’端polyA尾杂交。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位蛋白质，在透化组织前，可将多种DNA偶联抗体与组织预先孵育，使其与不同种蛋白结合；DNA 偶联抗体由抗体、PCR扩增接头、抗体编码和3’端恒定序列组成，其中恒定序列与步骤(9)中所述Y-DNA的捕获域互补，所述恒定序列为一段特异性DNA 序列。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位蛋白质，在组织与DNA偶联抗体共孵育后，洗去多余DNA偶联抗体，继续透化组织，即可释放DNA偶联抗体，利用空间编码阵列Y-DNA上的捕获域杂交DNA偶联抗体3’端的恒定序列。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位糖类，在透化组织前，可将多种DNA偶联凝集素与组织预先孵育，使其与不同种糖类结合；DNA 偶联凝集素由凝集素、PCR扩增接头、凝集素编码和3’端恒定序列组成，其中恒定序列与(9)中所述Y-DNA的捕获域互补，所述恒定序列为一段特异性DNA 序列。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位糖类，在组织与 DNA偶联凝集素共孵育后，洗去多余DNA偶联凝集素，继续透化组织，即可释放DNA偶联凝集素，利用空间编码阵列Y-DNA上的捕获域杂交DNA偶联凝集素3’端的恒定序列。

步骤(12)中所述构建测序文库，上机进行二代测序，以鉴定与捕获域特异性结合的分析物及其空间位置信息，可以单独进行空间基因组、转录组、蛋白质组、表观遗传组、以及糖组学测序，也可以联合基因组和转录组、转录组和蛋白质组实现空间多组学测序。

步骤(12)中所述构建测序文库，上机进行二代测序，以鉴定与捕获域特异性结合的分析物及其空间位置信息，具体步骤包括组织切片固定、透化释放组织分析物，分析物捕获、逆转录、收集和扩增cDNA、以及使用DNA建库试剂盒建库、上机测序。

步骤(13)中所述开发对应的组织信息学算法，确定分析物在组织样品中的空间位置，重构组织三维空间分析图谱，包括分析测序文库，将测得的ZXY空间条形码与预先设计的空间条形码库比对，根据X-DNA和Y-DNA空间条形码获得二维坐标(xi，yj)，根据Z-DNA空间条形码获得组织不同层空间坐标zk，由此获得组织分析物的三维坐标(xi，yj，zk)；联合DNA文库、cDNA文库、抗体编码以及凝集素编码，实现空间基因组、转录组、蛋白质组、表观遗传组、糖组学以及空间多组学测序分析。

所述通过多轮DNA连接反应直接对组织中细胞的分析物进行三维空间编码，具体包括以下步骤：

(1)组织透明化，原位保留和固定组织中的分析物，去除脂质；

(2)开发正方体“魔方”空间组织测序系统，用于递送DNA编码探针；所述正方体“魔方”的正面、侧面和上面分别集成平行的上样微通道以及对应的样品接口，所述通道内部充满凝胶，用于通道中编码探针的预富集，对应的两面内部包埋微电极，以施加电场推动编码探针在透明化组织中的定向移动；

(3)提供M种第一组定位寡核苷酸，命名为X-DNA，其中X-DNA的3’端为捕获域，用于结合组织分析物，5’端修饰磷酸基团，用于DNA连接反应；

(4)将M种X-DNA与凝胶混合，分别预富集到正方体“魔方”前面不同的上样微通道中，一种X-DNA对应一条上样微通道；

(5)提供与X-DNA5’端杂交的夹板寡核苷酸1，5’端包含与X-DNA部分基本互补的序列；

(6)提供N种第二组定位寡核苷酸，命名为Y-DNA，其中Y-DNA包含与夹板寡核苷酸1部分基本互补的序列，且5’端修饰磷酸基团；

(7)预先退火杂交N种Y-DNA与夹板寡核苷酸1，将退火杂交产物与凝胶混合，分别预富集到正方体“魔方”侧面不同的上样微通道中，一种Y-DNA对应一条上样微通道；

(8)提供与Y-DNA的5’端杂交的夹板寡核苷酸2，5’端包含与Y-DNA部分基本互补的序列；

(9)提供L种第三组定位寡核苷酸，命名为Z-DNA，其中Z-DNA包含与夹板寡核苷酸2部分基本互补的序列；

(10)预先退火杂交L种Z-DNA与夹板寡核苷酸2，将退火杂交产物与凝胶混合，分别预富集到正方体“魔方”上面不同的上样微通道中，一种Z-DNA对应一条上样微通道；

(11)采用三轴微通道电泳，分别将X-DNA、Y-DNA和夹板寡核苷酸1杂交产物、Z-DNA和夹板寡核苷酸2杂交产物沿通道方向精准递送进入凝胶透明化处理的三维组织中，其中，X-DNA通过捕获域与组织分析物结合，Y-DNA在 DNA连接酶的作用下，依次沿固有方向连接在X-DNA的5’端，Z-DNA在DNA 连接酶的作用下，依次沿固有方向连接在Y-DNA的5’端，组合形成独特的XYZ 三坐标空间编码；

(12)构建测序文库，上机进行二代测序，以鉴定与捕获域特异性结合的分析物及其空间位置信息；

(13)开发对应的生物信息学算法，对获得的测序数据，根据X-DNA、 Y-DNA、Z-DNA编码位置获得分析物的三维坐标(xi，yj，zk)，从而确定分析物在组织样品中的空间位置，重构组织三维空间分析图谱。

步骤(1)中所述组织透明化包括油性、基于水凝胶和水性的3种组织透明化方法。

步骤(1)中所述组织透明化，原位保留和固定组织中的分析物，去除脂质，包括采用形成水凝胶的反应物溶液对样品进行浸泡，使得组织中的生物分子由甲醛介导连接到凝胶单体，实现组织分析物的保留和固定；同时对组织进行热启动引发凝胶聚合，再通过电泳清除组织中的脂类成分实现组织透明化；所述形成水凝胶的反应物包括丙烯酰胺，双丙烯酰胺，甲醛和热触发剂。

步骤(2)中所述开发正方体“魔方”空间组织测序系统，用于递送DNA编码探针，包括模具浇筑、金属冲压、塑胶成型以及3D打印。

步骤(2)中所述正方体“魔方”的正面、侧面和上面分别集成平行的上样微通道以及对应的样品接口，正面、侧面以及上面分别设置为对应组织的X轴、Y 轴和Z轴，分别用于X-DNA、Y-DNA以及Z-DNA的上样。

步骤(2)中所述正面、侧面和上面集成平行的上样微通道，分别具有M、 N和L个通道，且M、N、L分别是5-1000之间的任一整数。

步骤(2)中所述正面、侧面和上面集成平行的上样微通道，通道宽度为100 μm-0.5μm。

步骤(2)中所述通道内部充满凝胶，用于通道中编码探针的预富集，所述凝胶包括琼脂糖水凝胶、明胶水凝胶、糖类水凝胶、透明质酸水凝胶、葡聚糖水凝胶、共聚物水凝胶。

步骤(3)中所述M种第一组定位寡核苷酸X-DNA包含空间条形码X、一段恒定序列和捕获域，不同通道中X-DNA的空间条形码X不同，共有M种空间条形码X，恒定序列与(5)中所述夹板寡核苷酸1的部分序列互补，捕获域为特异性序列或polyT序列，优选为polyT。

步骤(4)中所述第一组定位寡核苷酸X-DNA包含空间条形码X，每一行 X-DNA的空间条形码X相同，形成M行X-DNA条形码。

步骤(6)中所述N种第二组定位寡核苷酸Y-DNA包含空间条形码Y和两段恒定序列，一段恒定序列与步骤(5)中所述夹板寡核苷酸1的部分序列互补，另一段恒定序列与步骤(8)中所述夹板寡核苷酸2的部分序列互补。

步骤(7)中所述第二组定位寡核苷酸Y-DNA包含空间条形码Y，每一列 Y-DNA的空间条形码Y相同，形成N列Y-DNA条形码。

步骤(9)中所述L种第三组定位寡核苷酸Z-DNA包含空间条形码Z、一段恒定序列和PCR扩增接头，恒定序列与(8)中所述夹板寡核苷酸2的部分序列互补。

步骤(10)中所述第三组定位寡核苷酸Z-DNA包含空间条形码Z，每一纵 Z-DNA的空间条形码Z相同，形成L纵Z-DNA条形码。

步骤(11)中所述采用三轴微通道电泳，分别将X-DNA、Y-DNA和夹板寡核苷酸1杂交产物、Z-DNA和夹板寡核苷酸2杂交产物沿通道方向精准递送进入凝胶透明化处理的三维组织中；M种X-DNA在电压驱动下沿X轴进入组织中，其3’端捕获域与分析物结合，N种Y-DNA和夹板寡核苷酸1杂交产物在电压驱动下沿Y轴进入组织中，3’端羟基通过T4DNA连接酶与X-DNA的5’端磷酸基团连接，L种Z-DNA和夹板寡核苷酸2在电压驱动下沿Z轴进入组织中，3’端羟基通过T4DNA连接酶与Y-DNA的5’端磷酸基团连接。

步骤(11)中所述M种X-DNA编码、N种Y-DNA编码和L种Z-DNA的正交连接实现M*N*L种三维空间编码。

步骤(11)中所述组织为新鲜或者新鲜冰冻组织。

步骤(11)中所述组织厚度为50-5000μm。

步骤(11)中所述组织样品中的分析物，包括DNA、RNA、蛋白质、染色质以及糖类中的一种或者数种。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位DNA或者染色质开放区域，还需使用转座酶切割DNA双链插入接头，使其与X-DNA的捕获域结合。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位RNA，可直接利用X-DNA上的polyT与mRNA的3’端polyA尾杂交。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位蛋白质，可将多种DNA偶联抗体与组织预先孵育，使其与不同种蛋白结合；所述DNA偶联抗体由抗体、PCR扩增接头、抗体编码和3’端恒定序列组成，其中所述恒定序列与步骤(3)中所述X-DNA的捕获域互补，中所述恒定序列为一段特异性DNA 序列或polyA。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位蛋白质，在组织与DNA偶联抗体共孵育后，洗去多余DNA偶联抗体，电压驱动X-DNA进入组织中，利用X-DNA上的捕获域杂交DNA偶联抗体3’端的恒定序列。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位糖类，可将多种 DNA偶联凝集素与组织预先孵育，使其与不同种糖类结合；所述DNA偶联凝集素由凝集素、PCR扩增接头、凝集素编码和3’端恒定序列组成，其中所述恒定序列与步骤(3)中所述X-DNA的捕获域互补，所述恒定序列为一段特异性DNA 序列或polyA。

步骤(11)中所述释放组织样品中的分析物，如需空间定位糖类，在组织与 DNA偶联凝集素共孵育后，洗去多余DNA偶联凝集素，电压驱动X-DNA进入组织中，利用X-DNA上的捕获域杂交DNA偶联凝集素3’端的恒定序列。

步骤(12)中所述构建测序文库，上机进行二代测序，以鉴定与捕获域特异性结合的分析物及其空间位置信息，不仅可以单独进行空间基因组、转录组、蛋白质组、表观遗传组以及糖组学测序，还可以联合基因组和转录组、转录组和蛋白质组等实现空间多组学测序。

步骤(12)中所述构建测序文库，上机进行二代测序，以鉴定与捕获域特异性结合的分析物及其空间位置信息，具体步骤包括分析物捕获、逆转录、收集和扩增cDNA、以及使用DNA建库试剂盒建库、上机测序。

步骤(13)中所述开发对应的生物信息学算法，确定分析物在组织样品中的空间位置，重构组织三维空间分析图谱，包括分析测序文库，将测得的XYZ空间条形码与预先设计的空间条形码库比对，根据X-DNA、Y-DNA以及Z-DNA 空间条形码获得三维坐标(xi，yj，zk)；联合DNA文库、cDNA文库、抗体编码以及凝集素编码，实现空间基因组、转录组、蛋白质组、表观遗传组、糖组学以及空间多组学测序分析。

本发明的有益效果为：

现有基于原位捕获的空间组学多用于组织的二维空间组学分析，而不同器官和组织具有独特的三维细胞分布和基因表达图谱，对组织进行便捷、高覆盖率、低成本的三维空间组学研究具有极大的技术挑战性和重要的科学意义。本发明基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法，通过多轮DNA连接反应间接或直接对组织细胞中的DNA、RNA、蛋白质、染色质以及糖类等分析物进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，可简单方便地实现组织的三维空间组学分析。

本发明操作方便、技术门槛低、成本低廉，能够获得组织的三维空间分布及生物学信息，可广泛应用于神经科学、病理学、组织发育方面的应用和研究。本申请的方法保留了细胞在组织中的原始位置信息，并构建完整组织三维空间生物信息的表达文库，实现了高通量、高覆盖率的空间组学测序。该方法可用于细胞三维空间坐标解析、空间表达模式的基因识别、细胞-细胞交互作用分析，对于神经科学、肿瘤微环境研究以及组织器官发育等生物医学领域具有显著意义。

本发明还具有如下优点：

1.通过多轮DNA连接反应制备三维空间编码序列，显著减少了DNA编码序列种类，可有效降低实验成本。

2.DNA条形码种类多样，适用性广，可用于组织细胞mRNA、DNA、蛋白质、染色质以及糖类等分析物的三维编码，从而实现空间基因组、转录组、蛋白质组、表观遗传组、糖组学以及空间多组学测序分析。

3.XYZ空间编码序列的空间条形码已知，相比于slide-seq、slide-seqV2以及stereo-seq等需要预先解码获取空间定位等空间转录组学测序方法，操作更为简单，更容易回溯组织分析物的空间位置。

4.构筑ZXY三维空间编码玻片，间接捕获组织分析物，进行三维空间组学研究，方法简单，操作方便，降低了技术门槛，易于实现流程化、自动化的空间组学研究。

5.基于3D一体化技术打印正方体“魔方”测序平台，兼容组织的凝胶透明化处理以及mRNA、蛋白质、基因组等测序文库构建，同样使空间组织测序实现了自动化、一体化，提高了运行效率。

6.基于三轴微通道电泳技术精准递送X-DNA、Y-DNA以及Z-DNA三类编码探针到组织内部，可有效捕获组织分析物，提高捕获效率，实现高覆盖率的空间组学研究。

附图说明

图1为玻片表面修饰3D氨基基团流程示意图；

图2为组织三维空间定位编码玻片制备示意图；

图3为用于空间编码微流控芯片图和夹具图；

图4为基于两轮DNA连接反应实现ZXY三维编码的点阵结果图；

图5为定位组织mRNA，进行三维空间转录组学测序的流程示意图；

图6为小鼠嗅球组织三维空间转录组学测序结果图；

图7为玻片表面修饰链霉亲和素流程示意图；

图8为定位组织蛋白质和mRNA，同时进行三维空间蛋白质组学和转录组学的流程示意图；

图9为定位组织表面糖类和mRNA，同时进行三维空间糖组学和转录组学的流程示意；

图10为定位组织DNA或染色质开放区域，进行三维基因组学测序的流程示意图；

图11为三维原位编码组织mRNA，进行空间转录组学流程图；

图12为小鼠嗅球组织的凝胶透明化结果图；

图13为基于微流控DNA编码芯片电泳的“魔方”三维编码递送系统示意图；

图14为完整组织转录组单细胞分辨率的三维重构及时空信息分析示意图；

图15为三维原位编码组织蛋白质示意图；

图16为三维原位编码组织糖类示意图；

图17为三维原位编码组织DNA或染色质可及性示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例通过多轮DNA连接反应间接对组织细胞中的RNA进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织细胞的空间位置和基因表达信息，实现组织的三维空间转录组学分析。

(1)玻片表面共价修饰3D氨基基团：玻片表面修饰示意图如图1所示。首先使用水虎鱼溶液(H

(2)连接第一组定位寡核苷酸Z-DNA：首先定制合成5种5’端带有氨基修饰的空间编码序列Z-DNA，5种Z-DNA的空间条形码Z不同。随后在pH＝7.2 的磷酸钠缓冲中配置2.5mM双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)和5μMZ-DNA的混合溶液，将不同的Z-DNA迅速滴加到不同的3D氨基玻片表面，室温反应30 min，使DSS充分交联氨基修饰Z-DNA和玻片表面氨基。最后用2×SSC溶液(含 0.1％SDS)清洗玻片表面，去除未反应和非特异性吸附DNA。Z-DNA的最终修饰面积约为5×5mm

(3)使用微流控芯片正交连接第二组定位寡核苷酸X-DNA和第三组定位寡核苷酸Y-DNA：为避免剩余未反应氨基的非特异性静电吸附，在进行X-DNA 的连接反应前，还需对玻片进行封闭，将剩余氨基转为羧基。具体实验操作为，使用N,N二甲基甲酰胺(DMF)溶剂配置0.1g/ml的丁二酸酐溶液，加入修饰好Z-DNA的玻片，摇晃反应40min。随后定制合成50种X-DNA、50种Y-DNA、夹板寡核苷酸1以及夹板寡核苷酸2。X-DNA和Y-DNA的5’端均带有磷酸基团，用于DNA连接反应，但50种DNA的空间条形码均不相同。使用软光刻技术制备横竖两种各50通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片(微流控芯片X 和微流控芯片Y)，通道直径分为为50μm和15μm两种。使用丙烯酸夹具协助组装PDMS芯片于玻片上。预先退火杂交50种5μMX-DNA和5μM夹板寡核苷酸1。接下来，将DNAT4连接酶与50种X-DNA和夹板寡核苷酸1的杂交产物均匀混合，分别取1μl加入微流控芯片X的不同上样孔中，负压抽样使样品进入不同通道中，与底部玻片上的Z-DNA连接。37℃反应30min后，在上样区域加入2mlPBS溶液，持续负压抽样清洗通道，去除未反应的X-DNA。拆掉夹具，使用2×SSC溶液(含0.1％SDS)清洗玻片表面，彻底去除非特异性吸附X-DNA。最后使用80mM NaOH反应1min，去除夹板寡核苷酸1。Y-DNA的连接与 X-DNA的操作类似。同样，预先退火杂交50种5μM Y-DNA和5μM夹板寡核苷酸2。将DNA T4连接酶与50种Y-DNA和夹板寡核苷酸2的杂交产物均匀混合，分别取1μl加入微流控芯片Y的不同上样孔中，负压抽样使样品进入不同通道中，与底部玻片上的X-DNA连接。37℃反应30min后，在上样区域加入2ml PBS溶液，持续负压抽样清洗通道，去除未反应的Y-DNA。拆掉夹具，使用2× SSC溶液(含0.1％SDS)清洗玻片表面，彻底去除非特异性吸附Y-DNA。最后使用80mM NaOH反应1min，去除夹板寡核苷酸2。组织三维空间定位编码玻片的示意图如图2所示，微流控芯片X和微流控芯片Y以及夹具的结构如图3 所示，最终获得的两种空间分辨率的ZXY三维编码点阵(50μm和15μm)结果如图4所示。

(4)小鼠嗅球组织的三维空间转录组学研究：捕获小鼠嗅球组织mRNA，进行三维空间转录组学的实验流程如图5所示。取小鼠新鲜嗅球组织，使用OTC 包埋剂进行包埋，并放入干冰上迅速冰冻，冰冻后放入-80℃冰箱中进行长久保存。-80℃取出组织，用干冰运送组织到冰冻切片机(-20℃)中，预先平衡冰冻组织30min。使用冰冻切片机连续切片，每片厚度为10μm，依次粘附到上述三维空间编码玻片上。随后将组织切片37℃预热1min，放入冰甲醇溶液中-20℃固定30min。固定后，取出玻片，每片玻片加入～200μl异丙醇溶液均匀覆盖组织表面，脱水处理1min。自然风干异丙醇5min。

之后，对组织进行苏木精-伊红(HE)染色。首先加入苏木精，均匀地覆盖所有玻片上的组织，室温孵育7min。7min后弃去苏木精，按照顺序先后将玻片反复浸入50ml离心管中超纯水清洗5次，反复浸入1L超纯水1中15次，反复浸入1L超纯水2中15次。然后从玻片背后擦去多余的液体，加入反蓝液，均匀覆盖所有组织切片，室温孵育2min。2min后弃去反蓝液，玻片反复浸入1L超纯水2中5次。最后从玻片背后擦去多余的液体，加入伊红稀释液(伊红：乙酸＝1:9)，均匀覆盖所有组织切片，室温孵育1min。1min后弃去伊红稀释液，玻片反复浸入1L超纯水3中清洗15次。从玻片背后擦去多余的液体，风干直至组织不透明后，在37℃下孵育5min，并用HE扫描仪扫描成像，保存HE染色图片。

HE染色后，将组织切片放入孵育盒中，每片组织加入70μl胃蛋白酶溶液， 37℃透化嗅球组织10min。透化结束后，吸走胃蛋白酶溶液，使用100μl0.1×SSC 溶液缓慢清洗3次。每片组织配置100μl逆转录试剂：5×逆转录缓冲20μl、无酶水48μl、2.5mM dNTP 20μl、逆转录酶5μl、RNA酶抑制剂2μl以及模板切换引物TSO 5μl。加入逆转录试剂，42℃反应8h，逆转录mRNA为cDNA。逆转录结束后，吸走逆转录试剂，使用100ul 0.1×SSC溶液缓慢清洗3次。随后，加入75μl 80mM NaOH溶液反应5min，使用100μl EB缓冲清洗3次，去除 mRNA链。接下来，进行二链合成，每片组织配制75μl二链合成混合物：无酶水22.5μl、2.5mM dNTP 30μl、DNA聚合酶7.5μl、二链合成引物7.5μl以及 10×DNA聚合酶缓冲7.5μl。加入二链合成混合物，37℃反应10h。二链合成结束后，吸走二链合成混合物，并使用100μl EB buffer溶液清洗3次。每片组织配制75μl核酸外切酶混合物：无酶水63.73μl、外切酶3.75μl以及外切酶缓冲 7.5μl。加入核酸外切酶混合物，37℃反应45min，剪切剩余未反应单链。反应结束后，吸走核酸外切酶混合物，使用100ul 1×TE buffer清洗3遍。最后加入 35ul 80mM NaOH反应10min，收集cDNA单链，加入5uL 1M Tris-HCl，中和 NaOH。

使用2×Kapa Biosystems HiFi Hotstart Readymix将收集的cDNA单链进行 PCR扩增，反应物包括10μl PCR引物、50μl 2×Kapa Biosystems HiFi Hotstart Readymix、以及40μl cDNA。PCR扩增程序为：98℃3min；98℃20s、67℃20 s、72℃5min，循环X轮(X由qPCR的ct值决定)；72℃5min；4℃∞。扩增后将不同组织切片的cDNA库混合，使用0.6X VAHTSDNA纯化磁珠纯化 cDNA文库，样品回收体积为30μl。最后根据

将测序文库送去公司进行二代测序，获得测序数据。开发对应的生物信息学算法，用于分析测序文库，将测得的空间编码文库中的barcode与barcode库相比对，根据X-DNA编码和Y-DNA编码位置获得二维坐标(x

实施例2

本实施例通过多轮DNA连接反应间接对组织细胞中的RNA进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间转录组学分析。在实施例2中，使用链酶亲和素(SA)玻片替换实施例1 中的3D氨基玻片，除SA修饰方法、Z-DNA的连接方法不同外，其它操作步骤、顺序及条件同实施例1。

(1)玻片表面修饰SA：图7展示了一种在玻片表面修饰SA的方法。首先使用水虎鱼溶液(H

(2)连接第一组定位寡核苷酸Z-DNA：首先定制合成5种5’端带有生物素 (Biotin)修饰的空间编码序列Z-DNA，5种Z-DNA的空间条形码Z不同。随后1×PBS缓冲液中配置2μMZ-DNA的混合溶液，将不同的Z-DNA迅速滴加到不同的SA玻片表面，室温反应30min，使生物素修饰的Z-DNA和玻片表面 SA充分反应。最后用2×SSC溶液(含0.1％SDS)清洗玻片表面，去除未反应和非特异性吸附DNA。Z-DNA的最终修饰面积约为5×5mm

后续步骤同实施例1。

实施例3

本实施例通过多轮DNA连接反应间接对组织细胞中的蛋白质和RNA同时进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间蛋白质组学和转录组学分析。在实施例3中，除额外需要进行DNA偶联抗体的标记、单独纯化制备蛋白质组测序文库外，其它操作步骤、顺序及条件同实施例1。

(1)三维空间定位编码玻片的制备：同实施例1

(2)小鼠嗅球组织的三维空间蛋白质组学和转录组学研究：定位组织蛋白质和mRNA，同时进行三维空间蛋白质组学和转录组学的流程示意图如图8所示。

HE染色及之前步骤同实施例1。

HE染色后，将组织切片放入孵育盒中，每片组织配置70μlDNA偶联抗体溶液：7μlDNA偶联抗体、63μl PBS缓冲溶液。将DNA偶联抗体溶液加入孵育盒，37℃孵育1h。孵育结束后，吸走DNA偶联抗体，使用100μl EB buffer 溶液缓慢清洗3次。每片组织加入70μl胃蛋白酶溶液，37℃透化嗅球组织10min。透化结束后，吸走胃蛋白酶溶液，使用100μl 0.1×SSC溶液缓慢清洗3次。然后进行二链合成，每片组织配制75μl二链合成混合物：无酶水30μl、2.5mM dNTP 30μl、DNA聚合酶7.5μl、10×DNA聚合酶缓冲7.5μl。加入二链合成混合物，37℃反应10h。二链合成结束后，吸走二链合成混合物，并使用100μl EB buffer溶液清洗3次。每片组织配制75μl核酸外切酶混合物：无酶水63.73μl、外切酶3.75μl以及外切酶缓冲7.5μl。加入核酸外切酶混合物，37℃反应45min，剪切剩余未反应单链。反应结束后，吸走核酸外切酶混合物，使用100ul 1×TE buffer清洗3遍。最后加入35ul 80mM NaOH反应10min，收集DNA单链，加入5uL 1M Tris-HCl，中和NaOH。

使用2×Kapa Biosystems HiFi Hotstart Readymix将收集的DNA单链进行 PCR扩增，反应物包括10μl PCR引物、50μl 2×Kapa Biosystems HiFi Hotstart Readymix、以及40μl DNA。扩增程序为：98℃3min；98℃20s、67℃20s、 72℃5min，循环X轮(X由qPCR的ct值决定)；72℃5min；4℃∞。扩增后将不同组织切片的DNA库混合，使用0.6×VAHTS DNA纯化磁珠分选cDNA 测序文库,样品回收体积为30μl。收集上清，使用1.4×VAHTS DNA纯化磁珠分选蛋白质测序文库，样品回收体积也为30μl。最后根据

开发对应的生物信息学算法，用于分析测序文库，将测得的空间编码文库中的barcode与barcode库相比对，根据X-DNA编码和Y-DNA编码位置获得二维坐标(x

实施例4

本实施例通过多轮DNA连接反应间接对组织细胞中的糖类和RNA进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间糖组学和转录组学分析。在实施例4中，除更换DNA偶联抗体为 DNA偶联凝集素外，其它操作步骤、顺序及条件同实施例3。

(1)三维空间定位编码玻片的制备：同实施例1

(2)小鼠嗅球组织的三维空间糖组学和转录组学研究：定位组织表面糖类和mRNA，同时进行三维空间糖组学和转录组学的流程示意图如图9所示。

使用DNA偶联凝集素替换实施例3中DNA偶联抗体，其余实验步骤同实施例3。

将测序文库送去公司进行二代测序，获得测序数据。开发对应的生物信息学算法，用于分析测序文库，将测得的空间编码文库中的barcode与barcode库相比对，根据X-DNA编码和Y-DNA编码位置获得二维坐标(x

实施例5

本实施例通过多轮DNA连接反应间接对组织细胞中的DNA或染色质开放区域进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间基因组学分析。在实施例5中，除DNA或染色质开放区域的捕获不同外，其它操作步骤、顺序及条件同实施例1。

(1)三维空间定位编码玻片的制备：同实施例1

(2)小鼠嗅球组织的空间基因组学或表观遗传学研究：捕获小鼠嗅球组织 DNA或染色质开放区域，进行三维定位及测序的实验流程如图10所示。

HE染色及之前步骤同实施例1。

HE染色后，将组织切片放入孵育盒中，每片组织加入70μl胃蛋白酶溶液， 37℃透化嗅球组织10min。透化结束后，吸走胃蛋白酶溶液，使用100μl 0.1×SSC 溶液缓慢清洗3次。配置125μl Tn5转座酶-接头溶液：1.25μl接头1、1.25ul 接头2、122.5μl Tn5转座酶。每片组织配置100μl Tn5转座酶溶液：25μl Tn5 转座酶、25μl Tn5转座酶-接头溶液、50μlTn5转座酶缓冲溶液。将Tn5转座酶溶液加入孵育盒中，37℃反应1h，反应结束后，吸走Tn5转座酶溶液，使用100 μl 0.1×SSC溶液缓慢清洗3次。每片组织配置70μl夹板寡核苷酸序列溶液：7μl 夹板寡核苷酸序列溶液、63μlPBS缓冲溶液。将70μl夹板寡核苷酸序列加入孵育盒中，37℃反应2h，反应结束后，吸走夹板寡核苷酸序列溶液，使用100μl0.1× SSC溶液清洗3次。每片组织配置70μl DNA T4连接酶溶液：7μl DNA T4连接酶连接酶、63μl DNA T4连接酶连接酶缓冲溶液。将70μl DNA T4连接酶溶液加入孵育盒中，37℃反应1h，反应结束后，使用100μl 0.1×SSC溶液清洗3次。然后进行二链合成，每片组织配制75μl二链合成混合物：无酶水30μl、2.5mM dNTP 30μl、DNA聚合酶7.5μl、10×DNA聚合酶缓冲7.5μl。加入二链合成混合物，37℃反应10h。

后续步骤同实施例1。

将测序文库送去公司进行二代测序，获得测序数据。开发对应的生物信息学算法，用于分析测序文库，将测得的空间编码文库中的barcode与barcode库相比对，根据X-DNA编码和Y-DNA编码位置获得二维坐标(x

实施例6

本实施例通过多轮DNA连接反应直接对组织细胞中的RNA进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间转录组学分析。

(1)组织透明化，原位保留和固定组织中的分析物，去除脂质等障碍物：实验流程如图11所示。首先取1×1×1mm

(2)开发正方体“魔方”空间组织测序系统，递送DNA编码探针：基于微流控DNA编码芯片电泳的“魔方”三维编码递送系统示意图如图13所示。首先通过 3D一体化打印技术制作正方体“魔方”空间组织测序系统，其中正面、侧面和上面分别集成了100个平行的上样微通道，通道宽度为10μm，通道内部充满琼脂糖水凝胶，用于预富集编码探针。通道对应的两面内部包埋微电极，用于电压驱动DNA到组织内部。

(3)组织mRNA的三维空间编码：定制合成100种X-DNA、100种Y-DNA、 100种Z-DNA、夹板寡核苷酸1以及夹板寡核苷酸2。100种DNA序列的空间码各不相同。另外，X-DNA和Y-DNA的5’端均带有磷酸基团，用于DNA连接反应。X-DNA的3’端为polyT序列，用于捕获杂交mRNA的3’端polyA序列。 Z-DNA的5端为PCR扩增序列，用于cDNA的扩增。退火杂交100种Y-DNA 和夹板寡核苷酸1、100种Z-DNA和夹板寡核苷酸2。将100种X-DNA、Y-DNA 和夹板寡核苷酸1的退火杂交产物以及Z-DNA和夹板寡核苷酸2的退火杂交产物分别与加热融化的琼脂糖水凝胶混合，分别注入到正方体“魔方”系统对应的正面、侧面和上面100个平行的上样微通道中。将正方体“魔方”系统置于4℃，快速冷却琼脂糖水凝胶，实现DNA编码探针的预富集。随后将组织样品放入正方体“魔方”系统中，并将正方体“魔方”系统放入电泳槽中。加入电泳缓冲液，电泳缓冲液为在1×TBE，并含有10mM DTT和1M尿素。然后将电线连接到RND 320-KA3005D实验室电源，施加1.5V(10V/cm)电压20min，驱动琼脂糖水凝胶中的DNA进入组织中。为确保各轮序贯杂交的成功，随后将组织样品与6×SSC 高盐浓度缓冲液继续孵育5分钟。孵育结束后，将样品用2×SSC(含0.1％SDS) 洗涤三次，0.1×SSC洗涤三次。随之加入DNA T4连接酶37℃反应1h，实现 X-DNA与Y-DNA、Y-DNA与Z-DNA的连接。反应结束后，再使用0.1×SSC 溶液清洗3次，去除反应试剂。

(4)小鼠嗅球组织的三维空间转录组学研究：逆转录、二链合成、cDNA 扩增以及建库等后续步骤同实施例1。

对测序文库进行二代测序，获得文库中的空间位置信息和生物学信息。开发对应的生物信息学算法，将获得的测序文库进行分析，将测得的空间编码文库中的barcode与barcode库相比对，根据X-DNA编码、Y-DNA编码和Z-DNA编码位置获得组织中细胞的三维坐标(x

实施例7

本实施例通过多轮DNA连接反应直接对组织细胞中的蛋白质进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间蛋白质组学分析。在实施例7中，除额外需要进行DNA偶联抗体的标记、蛋白质测序文库的纯化和建库不同外，其它操作步骤、顺序及条件同实施例6。

(1)组织透明化，原位保留和固定组织中的分析物，去除脂质等障碍物：同实施例6。

(2)开发正方体“魔方”空间组织测序系统，递送DNA编码探针：同实施例 6。

(3)组织蛋白质的三维空间编码：捕获小鼠嗅球组织蛋白质，进行三维空间编码的示意图如图15所示。首先配置210μlDNA偶联抗体溶液：21μlDNA 偶联抗体、189μl PBS缓冲溶液。将DNA偶联抗体溶液加入孵育盒，与组织样本37℃孵育1h。孵育结束后，吸走DNA偶联抗体，使用EB buffer溶液缓慢清洗3次，去除多余试剂。其余步骤同实施例6

(4)小鼠嗅球组织的三维空间蛋白质组学研究：逆转录、二链合成、cDNA 扩增以及蛋白质测序文库的构建等后续步骤同实施例3中三维空间蛋白质组学研究部分。

对测序文库进行二代测序，获得文库中的空间位置信息和生物学信息。开发对应的生物信息学算法，将获得的测序文库进行分析，将测得的空间编码文库中的barcode与barcode库相比对，根据X-DNA编码、Y-DNA编码和Z-DNA编码位置获得组织中细胞的三维坐标(x

实施例8

本实施例通过多轮DNA连接反应直接对组织细胞中的糖类进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间糖组学分析。在实施例8中，除更换DNA偶联抗体为DNA偶联凝集素外，其它操作步骤、顺序及条件同实施例7。

(1)组织透明化，原位保留和固定组织中的分析物，去除脂质等障碍物：同实施例6。

(2)开发正方体“魔方”空间组织测序系统，递送DNA编码探针：同实施例 6。

(3)组织糖类的三维空间编码：捕获小鼠嗅球组织表面糖类，进行三维空间编码的示意图如图16所示。

使用DNA偶联凝集素替换实施例7中DNA偶联抗体，其余实验步骤同实施例7。

(4)小鼠嗅球组织的三维空间糖组学研究：逆转录、二链合成、cDNA扩增以及糖类测序文库的构建等后续步骤同实施例7。

对测序文库进行二代测序，获得文库中的空间位置信息和生物学信息。开发对应的生物信息学算法，将获得的测序文库进行分析，将测得的空间编码文库中的barcode与barcode库相比对，根据X-DNA编码、Y-DNA编码和Z-DNA编码位置获得组织中细胞的三维坐标(x

实施例9

本实施例通过多轮DNA连接反应直接对组织细胞中的DNA或染色质开放区域进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间基因组学或表观遗传组学分析。在实施例9中，除DNA 或染色质开放区域的捕获不同外，其它操作步骤、顺序及条件同实施例6。

(1)组织透明化，原位保留和固定组织中的分析物，去除脂质等障碍物：同实施例6。

(2)开发正方体“魔方”空间组织测序系统，递送DNA编码探针：同实施例 6。

(3)组织DNA或表观遗传学的三维空间编码：捕获小鼠嗅球组织DNA或染色质开放区域，进行三维空间编码的示意图如图17所示。配置125μl Tn5转座酶-接头溶液：1.25μl接头1、1.25ul接头2、122.5μl Tn5转座酶。随后配置 200μl Tn5转座酶溶液：50μl Tn5转座酶、50μl Tn5转座酶-接头溶液、100μl Tn5 转座酶缓冲溶液。将Tn5转座酶溶液加入孵育盒中，与组织样本37℃孵育1h。反应结束后，吸走Tn5转座酶溶液，使用0.1×SSC溶液缓慢清洗3次，去除多余试剂。每片组织配置210μl夹板寡核苷酸序列溶液：21μl夹板寡核苷酸序列溶液、189μl PBS缓冲溶液。将夹板寡核苷酸序列加入孵育盒中，与组织样本37℃反应2h。反应结束后，吸走夹板寡核苷酸序列溶液，使用0.1×SSC溶液清洗3

(4)小鼠嗅球组织的三维空间基因组学或表观遗传学研究：逆转录、二链合成、cDNA扩增以及建库等后续步骤同实施例1。

对测序文库进行二代测序，获得文库中的空间位置信息和生物学信息。开发对应的生物信息学算法，将获得的测序文库进行分析，将测得的空间编码文库中的barcode与barcode库相比对，根据X-DNA编码、Y-DNA编码和Z-DNA编码位置获得组织中细胞的三维坐标(x

尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。