一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法

摘要

本发明属于动物给药模型技术领域，涉及一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法。所述的建立方法包括如下步骤：(1)麻醉与固定；(2)备皮；(3)定位钻孔；(4)三点式固定；(5)脑室套管植入；(6)术后。利用本发明的小鼠侧脑室给药模型的建立方法，能够操作简单、重现性好、费用低的建立小鼠侧脑室给药模型。

说明书

技术领域

本发明属于动物给药模型技术领域，涉及一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法。

背景技术

侧脑室位于大脑半球的深部，左、右各一，呈“C”形室腔，腔内充满脑脊液。脑脊液不断产生又不断被吸收回流至静脉，在中枢神经系统起着淋巴液的作用，它供应脑细胞一定的营养，运走脑组织的代谢产物，调节着中枢神经系统的酸碱平衡，并缓冲脑和脊髓的压力，对脑和脊髓具有保护和支持作用。

在临床工作中，侧脑室脑脊液引流置换术是治疗重症脑室炎的重要方法；在动物科学研究中，侧脑室插管注射药物或毒物是研究学习记忆障碍的重要途径。

目前，在动物实验中所采用的侧脑室注射方法不一，多数采用大鼠进行侧脑室注射的方法研究。而小鼠和大鼠体型相差悬殊，成年大鼠的体重约为小鼠的10倍，小鼠的侧脑室模型较难实施，使得只能在小鼠上开展的研究有所限制。而将大鼠的侧脑室定位方法进行比例缩小后在小鼠头部进行操作，这样进行造模后的小鼠成活率低，生存状态差，不利于后续实验的开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，以能够操作简单、重现性好、费用低的建立小鼠侧脑室给药模型。

为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，所述的建立方法包括如下步骤：

(1)麻醉与固定：腹腔注射麻醉剂麻醉小鼠后将小鼠固定在立体定位仪上；

(2)备皮：在小鼠头颅的正中部位术野处剪皮备皮；

(3)定位钻孔：以小鼠右侧侧脑室为注射靶区，前卤部位为原点，定位于前卤后0.2-0.4mm，右侧旁开0.8-1.2mm处，在拟埋管及固定螺钉处用牙钻钻孔，直径为0.4-0.6mm，共钻4孔；

(4)三点式固定：用消毒棉球止血，干燥术野，将3个直径1.0mm的小螺丝拧入孔中，保证螺丝高于颅骨表面；

(5)脑室套管植入：将脑室套管垂直固定于立体定位仪的纵向坐标上，精确定位于前囟后0.25-0.35mm，旁开0.9-1.1mm处，再次干燥术野，使用牙科水泥将脑室套管、螺丝、颅骨紧密粘合，待牙科水泥固定后，轻轻悬起；

(6)术后：将小鼠从立体定位仪上解除固定后放回笼子，单笼饲养，待其手术恢复正常后即可用于实验研究。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，其中步骤(1)中，所述的腹腔注射麻醉剂麻醉小鼠是注射4-6wt％的水合氯醛以350-450mg/kg的剂量麻醉小鼠。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，其中步骤(1)中，所述的将小鼠固定在立体定位仪上是将已麻醉的小鼠水平并以俯卧的姿势置于立体定位仪的上方，并使水平方向上的左右2根钢针的尖端刚好对准耳蜗，先将牙齿卡好，然后慢慢的旋紧水平钢针，使之尖端缓缓的伸进耳蜗，直至松紧适宜，整个头颅水平固定，不能摇动为止。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，其中步骤(1)中，小鼠头部的固定标准为：前后囟在同一水平，鼻对正中，头部不动，提尾不掉。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，其中步骤(2)中，所述的备皮的具体操作为：在头颅的正中部位术野处剪毛，用酒精棉球搽拭，消毒后，以左右耳蜗的连线为基线，以头颅中轴为方向，沿头部用刀片切开0.5-1.0cm小切口，先只需切开皮肤，切勿伤及颅骨，用棉签蘸去流出的少量血液，然后用眼科镊轻轻挑起并剪开皮下筋膜，并稍微做钝性分离，直至暴露颅盖，用棉签蘸去流出的少量血液，再用棉签蘸取适量的8-12wt％H

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，其中步骤(3)中，埋管的孔钻透但不伤及脑实质。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，其中步骤(4)中，所述的小螺丝拧入孔中1-2圈即可。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，其中步骤(5)中，所述的将脑室套管、螺丝、颅骨紧密粘合的凝固时间为5-10min。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，其中步骤(6)中，所述的手术恢复正常的时间为10-17天。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小鼠侧脑室给药模型的建立方法，其中所述的小鼠为7-9周龄雄性未成年C57BL/6小鼠。

本发明的有益效果在于，利用本发明的小鼠侧脑室给药模型的建立方法，能够操作简单、重现性好、费用低的建立小鼠侧脑室给药模型。

本发明的方法定位准确、固定方式牢固、操作过程简便，且造模后死亡率低，小鼠的生存状态较好。本发明所建模型可用于急性、亚急性、慢性染毒实验和给药实验，也可用于研究发病机制等。

附图说明

图1为本发明的小鼠侧脑室给药模型的建立方法的固定位点与注射位点的示意图。

图2为实施例1中得到的逃避潜伏期折线图。

图3为实施例1中得到的不同组别小鼠学习期游泳轨迹示意图。

图4为实施例1中得到的不同组别小鼠记忆期游泳轨迹示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。

实施例1：小鼠侧脑室给药模型的建立

一、材料及方法

1、实验材料

(1)实验动物及分组

C57BL/6小鼠，SPF级，雄性，7-9周龄，21只，由中国食品药品检定研究院提供，生产许可证号：SCXK(京)2014-0013，合格证号：11400500012380。动物经6天检疫后，按照体重随机分为对照组、手术组、染毒组，每组各7只。

(2)主要仪器

Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)、侧脑室微量注射套管、导管、内芯、螺帽、螺丝、颅骨钻(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；脑立体定位仪(Narishige)。

2、实验方法

(1)动物建模建立方法

称量小鼠体重，小鼠腹腔注射5wt％水合氯醛400mg/kg麻醉小鼠，并将其置于脑立体定位仪上。小鼠头顶局部常规备皮，所用剪刀、镊子等均采用碘伏消毒，正中矢状切开头皮约1.0cm。使用3wt％H

(2)体重称量

记录小鼠术前体重、术后14天体重、术后21天体重、术后28天体重，以判断小鼠生存状况。

(3)动物染毒

术后14天对染毒组进行染毒，每次染毒前用5wt％的水合氯醛对小鼠进行腹腔麻醉，将已麻醉的小鼠水平并以俯卧的姿势置于立体定位仪的上方。将套帽旋出，将连接微量注射器的消毒的内针插入，缓慢将毒物(5mmol/L的麦芽酚铝，一种可致动物认知功能障碍的化学试剂)推入(2μl/2min)，注射完毕后留针2-3min，保证溶液充分进入侧脑室。将内针拔出，盖上套帽。每只小鼠隔天注射一次，每次2μl，共14天，有效7天。整个染毒期间，动物室以自然节律采光，温度20-25℃,相对湿度45-55％，所用动物饲以普通饲料，自由饮水和进食。

(4)Morris水迷宫试验

术后28天进行Morris水迷宫试验，Morris水迷宫由黑色内壁圆柱形水池和一个位置可移动和高度可调节的塑料站台组成。直径100cm，高50cm，池内水深30cm，加热器将水加热在(21±2)℃。水池标有东、南、西、北四个入水点，并将水池分为东北(NE)、东南(SE)、西北(NW)、西南(SW)四个象限，在SE象限正中距池边缘10cm处放一逃避平台，平台高29cm,直径为5cm，此平台表面有凸起便于动物站立，池中水没过平台0.5cm左右，水池内池壁有各种图案为动物提供空间参照线索，便于小鼠定位平台，水迷宫上方放置摄像机，计算机内安装软件对小鼠游泳轨迹进行跟踪记录，完成后对三组实验动物数据进行统计分析。

(a)定位航行实验

定位航行实验，在正式实验开始前一天将小鼠放入未放置平台的水池中自由游泳1min，熟悉实验环境。定位航行实验周期为4天，每天训练1个时段，每个时段训练4次，分别从4个象限的4个入水点入水，训练前将平台放在SE象限中，将小鼠面向池壁从入水点放入池中，对小鼠的游泳轨迹进行跟踪记录，并记录其从入水到爬到平台(四肢均在平台上)的时间，此时间即为逃避潜伏期。让小鼠在平台上休息数秒后放回笼中。如果大鼠在1min内未找到平台，则由实验人员将其引至平台，其逃避潜伏期记为60s。每一时间段内4次逃避潜伏期的算数均数作为这一时间段的成绩，并进行统计。

(b)空间搜索实验

空间搜索实验在定位航行实验后进行，即第5天撤去平台，任选一个入水点将大鼠放入池中，记录1min内大鼠的游泳轨迹并进行分析。观察分析其穿过原平台所在位置的次数，记录大鼠在原平台象限停留时间、平台象限游泳距离及穿越平台次数，以检测大鼠的空间记忆能力。

(5)统计学方法

所有数据采用SPSS 22.0统计分析软件进行分析，全部数据均以均数±标准差(means±SD)表示。

二、结果

1、体重指标变化

不同组别小鼠术前体重、术后14天体重、术后21天体重、术后28天体重如表1所示，三组小鼠术前体重相差不大，术后28天体重均有增加，说明建模手术的实施并未对小鼠的生存状况有影响。

表1不同组别小鼠体重指标变化情况

2、Morris水迷宫实验结果

4天的定位航行实验结果如图2，从图中可以看出，三组间的比较时间因素(day)有统计学意义(P<0.05)，说明逃避潜伏期有随时间变化的趋势；但时间和分组的交互作用没有统计学意义(P>0.05)，说明时间因素的作用不随着分组的不同而不同。个体间变异部分的计算结果显示，对照组与手术组的差异没有统计学意义(P>0.05)，说明手术并未对小鼠的学习记忆产生影响；染毒组与手术组的差异有统计学意义(P<0.05)，说明使用该方法进行的染毒实验有效。

表2不同组别小鼠Morris水迷宫定向导航实验结果

注：*与手术组比较P<0.05。

第5天空间搜索实验结果如表3所示，对照组与手术组的差异没有统计学意义(P>0.05)染毒组较其余各组原平台象限停留时间显著缩短、穿越平台次数显著减少、原平台象限游泳距离显著缩短(均P<0.05)，各组小鼠游泳轨迹记录见图3、图4。

表3不同组别小鼠Morris水迷宫空间探索实验结果

注：*与手术组比较P<0.05。

三、结论

采用上述建模方法，成功构建了小鼠侧脑室给药模型。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。