一种耐药性癫痫生物标记物、耐药性癫痫诊断试剂或试剂盒

摘要

本发明公开了一种耐药性癫痫生物标记物、耐药性癫痫诊断试剂或试剂盒，涉及癫痫诊断技术领域。本发明使用血清外泌体蛋白组学技术来拟定耐药性癫痫潜在的生物学标志物，并根据生物标志物筛选结果力争开发快速检测试剂盒。本发明将耐药性癫痫组分别与正常对照组及临床治疗效果良好的癫痫组进行比较，所得到的差异性结果更能代表癫痫病人的耐药性；耐药性癫痫生物学标志物的开发有利于耐药性癫痫的临床早期诊断、早期治疗，也方便了及时调整治疗方案，及时术前评估。

说明书

技术领域

本发明涉及癫痫诊断技术领域，具体而言，涉及一种耐药性癫痫生物标记物、耐药性癫痫诊断试剂或试剂盒。

背景技术

癫痫是中枢神经系统常见疾病，约有三分之一的癫痫患者对抗癫痫药物耐药，最终发展为耐药性癫痫，长期反复的癫痫发作不仅给癫痫患者的身心造成严重影响。尤其是癫痫共患病的现象在耐药性癫痫中尤为常见，其中，耐药性癫痫共病精神障碍性疾病的患病率就可达到40％，给家庭和社会带来沉重的经济负担。癫痫影响着全世界各人种、各年龄和各社会阶层，已成为全球性的公共卫生问题。而耐药性癫痫的发生是多因素的，除了个体本身的基因多态性，脑结构性改变、代谢、感染、免疫等不同病因均可导致耐药性癫痫，此外，临床医生诊断耐药性癫痫主要靠病史，尤其是其既往的诊疗历程，使得耐药性癫痫的诊治具有明显的滞后性。因此探索一种客观、准确、方便的特异性生物学标志物具有重要的临床意义。特异性生物标志物的发现将会有益于耐药性癫痫的临床早期诊断、早期治疗，方便及时调整治疗方案，及时术前评估，由此，可最大程度地避免因耐药性癫痫不能有效治疗，而导致癫痫发作本身和相关共病的发生、发展以及治疗方案不当而导致的不良结局(药物的经济负担、不良反应)。因此，生物标志物的挖掘，将使得耐药性癫痫临床早期诊断成为可能，并可减少耐药性癫痫所引起的社会公共卫生问题。

近年来，临床上对疾病相关的外泌体研究方兴未艾，由于外泌体可以由各种细胞分泌，稳定存在于各种体液中，例如血清、脑脊液等，并可以携带来自亲本细胞的物质，例如蛋白质，microRNAs等，在局部或远距离进行细胞之间信号传导，很多学者提出外周血外泌体及其内容物(蛋白质或microRNAs)可作为某些神经系统疾病的临床诊断生物标志物，以及治疗靶标的可能性。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐药性癫痫生物标记物、耐药性癫痫诊断试剂或试剂盒以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种耐药性癫痫生物标记物，其包括如下生物标记物中的至少一种：

Q15393、P24298、Q9Y281、E9PKG1、F6TLX2、P0DP02、P20702、Q9BZI7、Q71RC9、A0A494C0B4、A0A6I8PL42、B1AHB1、P23083、P09923、A0A075B6J9、A0A6I8PRN4、C9JWV9、A0A2R8YE10、E9PRJ8、P07360、Q8WUJ3、P02748、J3QRU1、O95837、O76074、K7ERP4、Q99653、P30740、C9J2C0、Q9Y5S2、P53004、Q15555、A0A0A0MS54、Q13884、M0R165、Q17RC7、Q2L6G2、P40189、P05141、B5MCX3、O95498、Q9BZQ8和Q9HC35。

发明人选择耐药性癫痫患者、临床治疗效果好的癫痫患者以及健康人群为研究对象，并将三组人群的血清外泌体进行非标记蛋白质组学(labelfree)技术检测，利用生物信息学技术预测相关差异蛋白，并进一步挑出差异及其显著的蛋白。该蛋白可以用于诊断或辅助诊断癫痫。

本发明使用血清外泌体蛋白组学技术来拟定耐药性癫痫潜在的生物学标志物，并根据生物标志物筛选结果力争开发快速检测试剂盒。该技术方案具备以下优势：(1)本发明将耐药性癫痫组分别与正常对照组及临床治疗效果良好的癫痫组进行比较，所得到的差异性结果更能代表癫痫病人的耐药性，即直接对耐药性与否进行诊断或辅助诊断。(2)本发明从外泌体的角度去探索，由于外泌体的稳定性、远距离信号传导性以及可穿越血脑屏障等性质，能最大程度上保证耐药性癫痫所产生病理性特征性的生物学标志物被检测到的可能性。(3)耐药性癫痫生物学标志物的开发有利于耐药性癫痫的临床早期诊断、早期治疗，也方便了及时调整治疗方案，及时术前评估，由此，可最大程度地避免因耐药性癫痫不能有效治疗，而导致癫痫发作本身和相关共病的发生、发展以及治疗方案不当而导致的不良结局(药物的经济负担、不良反应)。因此，本发明生物标记物的提出，具有良好的应用前景。

本发明还提供了一种编码上述耐药性癫痫生物标记物的核酸，其包括如下核酸中的至少一种：

SF3B3、GPT、CFL2、PRMT1、GLOD4、IGHV3-30-3、ITGAX、UPF3B、SMIM5、RAD23A、LARS1、MCM5、IGHV1-2、ALPI、IGLV2-18、GFPT1、TMBIM1、VPS45、CD81、C8G、CEMIP、C9、YES1、GNA14、PDE5A、GPX4、CHP1、SERPINB1、TUBA8、CDC42BPB、BLVRA、MAPRE2、PRKACB、SNTB1、EPS15L1、EXOC3L4、HLA-B、IL6ST、SLC25A5、SEPTIN2、VNN2、NIBAN1和EML4。例如至少任意两两的组合，SF3B3和GPT的组合，或PRKACB、SNTB1和SLC25A5的组合。

上述SF3B3、GPT、CFL2、PRMT1、GLOD4、IGHV3-30-3、ITGAX、UPF3B、SMIM5、RAD23A、LARS1、MCM5、IGHV1-2、ALPI、IGLV2-18、GFPT1、TMBIM1、VPS45、CD81、C8G、CEMIP、C9为上调基因，若样本检测上述上调基因后显示基因表达上调，则为耐药性癫痫；或，若给药后，显示上调基因表达降低，则显示该药物抗耐药性癫痫，可以有效治疗耐药性癫痫。

YES1、GNA14、PDE5A、GPX4、CHP1、SERPINB1、TUBA8、CDC42BPB、BLVRA、MAPRE2、PRKACB、SNTB1、EPS15L1、EXOC3L4、HLA-B、IL6ST、SLC25A5、SEPTIN2、VNN2、NIBAN1和EML4为下调基因。若样本检测上述下调基因后显示基因表达下降，则为耐药性癫痫；或，若给药后，显示下调基因表达升高，则显示该药物抗耐药性癫痫，可以有效治疗耐药性癫痫。

本发明还提供了一种耐药性癫痫生物标记物或上述核酸在抗耐药性癫痫药物筛选中的应用。

本发明还提供了一种耐药性癫痫生物标记物或上述核酸在制备治疗耐药性癫痫药物中的应用。

本发明还提供了一种耐药性癫痫生物标记物或上述的核酸在制备耐药性癫痫诊断试剂或试剂盒中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述生物标记物包括上调生物标记物和/或下调生物标记物；应用用于：根据上调生物标记物表达上调和/或下调生物标记物表达下调判断为耐药性癫痫；

上调生物标记选自如下生物标记物中的至少一种：Q15393、P24298、Q9Y281、E9PKG1、F6TLX2、P0DP02、P20702、Q9BZI7、Q71RC9、A0A494C0B4、A0A6I8PL42、B1AHB1、P23083、P09923、A0A075B6J9、A0A6I8PRN4、C9JWV9、A0A2R8YE10、E9PRJ8、P07360、Q8WUJ3和P02748；若样本检测上述上调生物标记后显示蛋白表达上调，则为耐药性癫痫；或，若给药后，显示上调生物标记的蛋白表达降低，则显示该药物抗耐药性癫痫，可以有效治疗耐药性癫痫。

下调生物标记物选自如下生物标记物中的至少一种：J3QRU1、O95837、O76074、K7ERP4、Q99653、P30740、C9J2C0、Q9Y5S2、P53004、Q15555、A0A0A0MS54、Q13884、M0R165、Q17RC7、Q2L6G2、P40189、P05141、B5MCX3、O95498、Q9BZQ8和Q9HC35。

本发明还提供了一种耐药性癫痫诊断试剂或试剂盒，其包括上述耐药性癫痫生物标记物或核酸。

例如针对上述生物标记物开发相应的检测引物，检测试纸条或试剂盒等。

本发明还提供了一种耐药性癫痫生物标记物的筛选方法，方法为非疾病的诊断或治疗用途，方法包括：分别对耐药性癫痫患者、临床治疗效果良好的癫痫患者和健康人的血清外泌体进行定量蛋白组学分析，通过质谱分析获得耐药性癫痫患者、临床治疗效果良好的癫痫患者和健康人之间的差异性蛋白。

在本发明应用较佳的实施方式中，该方法还包括对差异性蛋白进行生物信息学KEGG、GO富集分析，挑选出与耐药性癫痫相关的差异蛋白。

需要说明的是，当挑出与耐药性癫痫相关的差异蛋白后，也可重新选择耐药性癫痫患者、临床治疗效果好的癫痫患者以及健康人群，并通过抽血提取相应血清外泌体，进行扩大样本量的临床验证(免疫印迹或ELISA或质谱法进行靶向验证)，以寻找候选生物标记物，开发相应的快速检测试剂盒运用于临床耐药性癫痫的早期诊断。

上述癫痫为顽固性癫痫；在本发明应用较佳的实施方式中，顽固性癫痫选自下组：定位相关癫痫，全身癫痫及癫痫综合征。

在本发明应用较佳的实施方式中，定位相关癫痫为皮质性癫痫或颞叶癫痫。

在本发明应用较佳的实施方式中，皮质性癫痫为大脑额叶癫痫、顶叶癫痫或枕叶癫痫。

在本发明应用较佳的实施方式中，癫痫相关综合征为癫痫发作。

本发明具有以下有益效果：

本发明使用血清外泌体蛋白组学技术来拟定耐药性癫痫潜在的生物学标志物，并根据生物标志物筛选结果力争开发快速检测试剂盒。该技术方案具备以下优势：(1)本发明将耐药性癫痫组分别与正常对照组及临床治疗效果良好的癫痫组进行比较，所得到的差异性结果更能代表癫痫病人的耐药性，即直接对耐药性与否进行诊断或辅助诊断。(2)本发明从外泌体的角度去探索，由于外泌体的稳定性、远距离信号传导性以及可穿越血脑屏障等性质，能最大程度上保证耐药性癫痫所产生病理性特征性的生物学标志物被检测到的可能性。(3)耐药性癫痫生物学标志物的开发有利于耐药性癫痫的临床早期诊断、早期治疗，也方便了及时调整治疗方案，及时术前评估，由此，可最大程度地避免因耐药性癫痫不能有效治疗，而导致癫痫发作本身和相关共病的发生、发展以及治疗方案不当而导致的不良结局(药物的经济负担、不良反应)。因此，本发明生物标记物的提出，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为非标(Label-free)蛋白质组定量分析鉴定结果图；

图2为Venn分析结果图和GO、KEGG分析结果图；

图3为43种蛋白的序列索引网址。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了耐药性癫痫生物标记物的筛选方法。

(1)临床患者筛选

项目分组：耐药性癫痫，临床治疗效果好的癫痫患者，以及相匹配的健康人三组，每组10人，纳排标准如下：

耐药性癫痫组纳入标准：

a.符合2010年国际抗癫痫联盟(International League Against Epilepsy，ILAE)定义的耐药性癫痫。

b.入选前有12个月及以上的抗癫痫治疗。

c.患者幼时具有热性惊厥病史。

d.患者年龄在18-40岁之间。

e.获得医院伦理委员会批准，患者知情并同意。

耐药性癫痫组排除标准：

a.心因性癫痫。

b.怀孕或哺乳期。

c.过去2年中酗酒或吸毒的历史。

d.除癫痫病外的任何神经系统疾病。

临床治疗效果好的癫痫组纳入标准：

a.符合2010年ILAE发布的癫痫诊断。

b.患者无发作持续时间达到治疗前最长发作间隔的3倍或1年。

c.患者年龄在18-40岁之间。

d.获得医院伦理委员会批准，患者知情并同意。

临床治疗效果好的癫痫组排除标准：

a.心因性癫痫。

b.怀孕或哺乳期。

c.过去2年中酗酒或吸毒的历史。

d.除癫痫病外的任何神经系统疾病。

(2)血清外泌体收集与鉴定

血清外泌体收集：根据上述纳排标准筛选入组对象，并对每人采取10ml静脉血，4度下放置30-45min后于4度1300g下离心10min分离血清，并于负80度冷冻储存。采用超速离心法提取各组血清外泌体，提取血清外泌体方法如下：首先在37度中速溶血清样本，于4度2000g离心30分钟，将离心后上清液移至新的离心管中，并于10000g，4度条件下离心45分钟以除去较大囊泡。再次取上清，经0.45um滤膜过滤，收集过滤液并移至新的离心管，选择超速转子，在4度，100000g条件下进行70分钟离心，取沉淀并用预冷的PBS重悬，再次在4度，100000g条件下进行70分钟离心，取沉淀并用100ul预冷的PBS重悬。

血清外泌体鉴定：以CD63，CD9,TSG101这三种外泌体标志蛋白为标准对所提取的外泌体进行Western Blot鉴定。并对所提取外泌体在形态学上进行电镜鉴定。

(3)应用非标(Label-free)蛋白质组定量技术对各组提取的血清外泌体进行定量蛋白组学研究，具体方法如下：

a.蛋白提取:样品从-80℃取出，称取适量组织样品至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末。各组样品分别加入粉末4倍体积酚抽提缓冲液(含10mM二硫苏糖醇，1％蛋白酶抑制剂)，超声裂解。加入等体积的Tris平衡酚，4℃，5500g离心10min，取上清并加入5倍体积的0.1M乙酸铵/甲醇沉淀过夜，蛋白沉淀分别用甲醇和丙酮进行洗涤。最后沉淀用8M尿素复溶，利用BCA 试剂盒进行蛋白浓度测定。

b.胰酶酶解:各样品蛋白取等量进行酶解，用裂解液将体积调整至一致，再加入二硫苏糖醇(DTT)使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘乙酰胺(IAA)使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。将烷基化好的样本转移至超滤管，室温12000g离心20min，用8M尿素置换3次，再用置换buffer置换尿素3次，以1:50的比例(蛋白酶：蛋白，m/m)加入胰蛋白酶，酶解过夜。室温12000g离心10min回收肽段，再用超纯水回收肽段一次，合并两次肽段溶液。

c.液相色谱-质谱联用分析:肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用NanoElute超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和100％乙腈溶液。液相梯度设置：0-70min，5％～20％B；70-84min，20％～30％B；84-87min，30％～80％B；87-90min，80％B，流速维持在450nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入Capillary离子源中进行电离然后进timsTOF Pro质谱进行分析。离子源电压设置为1.75kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的TOF进行检测和分析。二级质谱扫描范围设置为100-1700。数据采集模式使用平行累积串行碎裂(PASEF)模式。一张一级质谱采集后进行10次PASEF模式采集母离子电荷数在0-5范围内的二级谱图，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30s秒避免母离子的重复扫描。

(4)通过上述质谱分析寻找各组间差异性蛋白，并进行生物信息学KEGG、GO富集分析，进一步挑选与耐药性癫痫相关的差异蛋白。

实验例1

本实验例提供了血清外泌体蛋白组学鉴定结果。

本实验例对耐药性癫痫组、临床治疗效果良好的癫痫组以及健康人的血清外泌体进行了非标(Label-free)蛋白质组定量分析。鉴定结果如下(图1a):与健康对照组相比，耐药性癫痫组有129种差异表达蛋白；对比临床治疗效果良好的癫痫组，耐药性癫痫组有590种差异表达蛋白。

图1中a为各组间差异蛋白的比较，红色表示上调，蓝色表示下调。图1中b为差异蛋白聚类热图。每一列代表一个样本，每一行代表一个不同的蛋白质。红色代表上调蛋白，绿色代表下调蛋白，颜色越深，差异越大。RE：耐药性癫痫组；SF：临床治疗效果良好的癫痫组；C：健康对照组。

实验例2

本实验例对比正常对照组和临床治疗效果良好的癫痫组，筛选出耐药性癫痫组显著变化的蛋白质并对其进行生信分析。

为了进一步探索在耐药性癫痫中显著变化的血清外泌体蛋白，我们根据各组间的差异蛋白进行了Venn图分析(图2中a)。RE:耐药性癫痫组；SF：临床治疗效果良好的癫痫组；C：健康对照组。

Venn图显示，与健康对照组和临床治疗效果良好的癫痫组相比，在耐药癫痫组中有22种蛋白表达显著上调，21种蛋白表达显著下调。表1显示了这43种不同的蛋白质。

此外，本实验例利用Metascape在线工具对这43种差异蛋白进行GO富集分析和KEGG富集分析(图2中b)，结果显示它们主要富集于免疫反应、细胞粘附分子结合以及氨基酸代谢等方面，这些富集反应均参与癫痫的发病机制。

其联系性在既往研究中均有报道：对于免疫反应，在癫痫患者和癫痫动物模型的脑组织中均观察到了炎症过程的激活。例如：与免疫反应相关的细胞因子：TNF-α和IL-1β。IL-1R/TLR信号可以介导电压和配体门控离子通道翻译后的快速变化，从而增加神经网路的兴奋性，以至于长期降低癫痫发作阈值。另一方面，有研究发现使用IL-1β拮抗剂可以减少动物模型的癫痫发作。总之，多项研究表明无论先天性免疫还是适应性免疫，在耐药性癫痫中都有发生，同时也预示着免疫调节疗法将是耐药性癫痫患者治疗前景。对于氨基酸代谢，有研究发现通过质子磁共振波谱对总n-乙酰天冬氨酸/总肌酸、谷氨酸/总肌酸和肌醇/总肌酸值的测定，氨基酸代谢障碍可能有助于预测癫痫患者耐药性的发生。另外，对于与细胞粘附因子相关的血脑屏障功能障碍在癫痫模型中也有报道。

表1与健康对照组和临床治疗效果良好的癫痫组比，在耐药性癫痫组中显著变化的蛋白质列表。各蛋白的序列参照https://www.uniprot.org/uniprot/以及https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/所示。

43种蛋白的序列参照图3所示的网址。

在后续可临床验证寻找耐药性癫痫潜在生物学标记物，包括如下步骤：

在临床上进一步扩大样本量，临床入组患者分组：耐药性癫痫患者，临床治疗效果好的癫痫患者，以及相匹配的健康人三组，每组50例，首先在前期研究的纳排标准基础上扩大范围，选择如下纳入标准进行对上述43种蛋白进行质谱法验证。

耐药性癫痫组纳入标准：

a.符合2010年国际抗癫痫联盟(International League Against Epilepsy，ILAE)定义的耐药性癫痫。

b.患者年龄在18岁以上。

c.获得医院伦理委员会批准，患者知情并同意。

耐药性癫痫组排除标准：

a.心因性癫痫。

b.怀孕或哺乳期。

c.过去2年中酗酒或吸毒的历史。

d.除癫痫病外的任何神经系统疾病。

临床治疗效果好的癫痫组纳入标准：

a.符合2010年ILAE发布的癫痫诊断。

b.患者无发作持续时间达到治疗前最长发作间隔的3倍或1年。

c.患者年龄在18岁以上。

d.获得医院伦理委员会批准，患者知情并同意。

临床治疗效果好的癫痫组排除标准：

a.心因性癫痫。

b.怀孕或哺乳期。

c.过去2年中酗酒或吸毒的历史。

d.除癫痫病外的任何神经系统疾病。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。