粪菌移植法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型、评价及应用

摘要

本发明涉及一种动物模型的构建方法，具体涉及发明属于一种动物模型的构建方法，具体涉及一种运用粪菌移植法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型、评价方法及应用。本发明通过制备高血压阴虚证和/或非阴虚证患者的粪菌液、小鼠灌服和饮水方式服用四联抗生素药物后移植制备的粪菌液，得到相应的高血压阴虚证和/或非阴虚证动物模型，同时采用多种方法进行动物模型评价，确认模型建立是否成功。本发明提供一种稳定性高、易于推广、重复性好、成功率高，经济实用的高血压阴虚证和/或非阴虚证动物模型，为中医药治疗高血压研究提供基础，为实现阴虚证模型评价的标准化与规范化提供思路。

说明书

技术领域

本发明属于一种动物模型的构建方法，具体涉及一种运用粪菌移植法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型、评价及应用。

背景技术

高血压是临床常见病、多发病，是心脑血管病的发病基础。约95％以上患者， 其病因不明称为“原发性高血压”，原发性高血压又称高血压病，是以体循环动 脉血压增高为主要表现的临床综合征；由多基因遗传、环境及多种危险因素相互作用所致的全身性疾病。其中，除了高血压病本身血压增高有关症状外，长 期高血压还可以影响心、脑、肾的功能，最终可导致这些器官功能衰竭，降低 患者的生活、工作质量，严重者可危及生命。尤其是我国正步入老龄化阶段， 高血压病的发病率呈逐年上升趋势，致残率、病死率极高，对患者生命健康带 来严重威胁。临床中如何选择降压效果好、毒副反应小、改善症状明显、有靶 器官保护作用、价格合理的治疗措施，是临床医生及患者都关注的问题。

肠道菌群是一个复杂且庞大的群体，在一个健康的成年人体内，肠道菌群总重量可达约1 -2千克，其中包含的细胞数量高达1013 -1014个，约是人体细胞数目的10倍，肠道微 生物编码基因组数目约为人体编码基因数目的100倍，因此也被称为“第二基因组”。

粪菌移植”（Fecal microbiota transplantation，FMT），其定义是，将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建新的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗，粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT) 作为重建肠道菌群的有效手段。

目前，粪便移植试验的小鼠模型不仅构建繁琐、模型效果较差、难以反映真实情况；且未发现通过粪便移植方法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型相关报道。

发明内容

本发明的目的克服了现有技术的不足，提供了一种建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型方法、评价方法和应用。

本发明由如下技术方案实现的。

第一方面。

本发明提供一种运用粪菌移植法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型的方法，具体包括如下步骤：

（1）制备粪菌液：将来源于临床确诊为高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证患者的粪便制成粪菌液；

（2）小鼠灌服和饮水方式给药四联抗生素药物，所述的四联抗生素为氨苄青霉素、万古霉素、新霉素、甲硝唑；

（3）模型建立：步骤2中小鼠分别移植步骤1制备的粪菌液，得到高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证模型。

进一步的，一种运用粪菌移植法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型的方法，所述步骤(1)具体包括如下步骤：

A:配置0.9%生理盐水内含10%甘油、0.1%L-半胱氨酸混合溶液，作为粪便保护液，高压灭菌锅内115℃煮熟20 min，粪便样本置入装有粪便保护液中，混匀；

B: 将步骤A得到的混匀粪便的粪便保护液过滤，得到滤液进行离心处理，弃上清液，所得沉淀为收集到的菌体；

C:使用粪便保护液重悬步骤B所得沉淀菌体；

D:根据需要分装粪菌液，-80℃保存。

优选的，上述动物模型构建方法步骤B中通过无菌200目尼龙网进行过滤；离心条件为4000rpm 10min。

优选的，上述动物模型构建方法步骤B、C、D均在厌氧工作站内完成。

进一步的，所述的一种运用粪菌移植法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型的方法，步骤(2)具体包括如下步骤：

步骤1：小鼠选取阶段，选取SPF级雄性C57BL/6小鼠，鼠龄6周；

步骤2：小鼠分类阶段，将C57BL/6小鼠分类，分为健康菌液组（C组）、高血压阴虚证菌液组（TY组）、高血压非阴虚证菌液组（TNY组）；

步骤3：清除菌群阶段，步骤2所述小鼠于第1周灌胃给药四联抗生素，第2周通过饮水给药四联抗生素；

步骤4：造模阶段，步骤3所述小鼠分别移植健康志愿者、高血压阴虚证患者及非阴虚患者粪菌液。

优选的，上述证动物模型构建方法，所述步骤(3)灌胃给药量为氨苄青霉素5mg/只，万古霉素5mg/只，新霉素5mg/只，甲硝唑4mg/只，饮水给药四联抗生素量为氨苄青霉素1g/L，万古霉素0.5g/L，新霉素1g/L，甲硝唑1g/L

优选的，上述证动物模型构建方法，所述步骤(4)移植粪菌液量为200μL/只/天，每隔天1天加强接种1次，持续5周。

第二方面。

一种运用粪菌移植法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型评价方法，通过旷场实验、易激惹评分、体温、饮水量、唾液流率、粪便含水量、皮肤含水量、体质量、24h尿量、尿胆素原和胆红素、心脏指数、摄食量、收缩压、舒张压及心率进行评价。

进一步的，上述运用粪菌移植法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型评价方法，所述的旷场试验包括小鼠的探索行为、小鼠在正中格停留时间、穿格次数、旷场区运动距离及运动速度。

第三方面。

上述的运用粪菌移植法建立高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型的方法在高血压治疗中的应用，将所述方法构建的高血压动物模型包括用于研发高血压的早期诊断试剂及方法和研发高血压的治疗药物。

本发明的有益效果主要体现在：

本研究采用阴虚证造模方法进行模型构建，创新性结合 “五心烦热、潮热、口干、皮肤干燥、便干、形体消瘦、尿赤”等阴虚证典型表现制定评价指标，探索阴虚证动物模型评价方法，为实现阴虚证模型评价的标准化与规范化提供思路。

本发明提供一种稳定性高、易于推广、重复性好、成功率高，经济实用的高血压阴虚证和/或高血压非阴虚证动物模型，为中医药治疗高血压临床前期研究提供实验基础，为建立中医病证结合人源肠道菌群动物模型提供了新的研究方向。

肠道菌群是介导高血压阴虚证的重要影响因素，研究高血压阴虚证患者特异性肠道微生物及代谢物改变及病理机制有重要意义。

附图说明

图1为三组小鼠旷场实验结果比较。

图2为三组小鼠易激惹评分结果比较。

图3为三组小鼠体温结果比较。

图4为三组小鼠日饮水量比较。

图5为三组小鼠唾液流率结果比较。

图6为三组小鼠粪便含水量结果比较。

图7为三组小鼠皮肤含水量结果比较。

图8为三组小鼠体重比较。

图9为三组小鼠24h尿量结果比较。

图10为三组小鼠尿胆原及尿胆红素验结果比较。

图11为三组小鼠心脏指数比较。

图12为三组小鼠日饮食量比较。

图13为三组小鼠收缩压比较。

图14为三组小鼠舒张压比较。

图15为三组小鼠心率比较。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，但凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1。

一、粪便液收集和制备。

1）、新鲜粪便收集。

配制粪便保护液：配置0.9%生理盐水内含10%甘油、0.1%L-半胱氨酸混合溶液，作为粪便保护液，高压灭菌锅内115℃煮熟灭菌20 min，粪便样本置入装有粪便保护液中，混匀。

在厌氧工作站内进行粪便收集管准备。即取50 ml无菌离心管在厌氧工作站内操作，每管加入30ml灭好菌的粪便保护液，旋紧盖子后用封口膜密封，作为收集管。

收集供体新鲜粪便样本20g（取样部位为粪便中段内部），置于上述收集管内，立即旋紧管盖并用封口膜密封，密封后震荡粪便。粪便与粪便保护液充分混匀后尽快置于冰袋上，用冰袋包裹四周，另外再收集两管用于冻存的粪便，每管2-3g，置于冰上。冰上运输，2h内运输至江苏集萃药康生物科技公司实验室，用于粪菌液制备的粪便立即进行后续粪菌液制备工作，冻存粪便存于-80℃冰箱内。

2）、制备过程。

在集萃公司厌氧工作站内，将收集的人源粪便样本悬浮在配置好的粪菌保护液中，通过无菌200目尼龙网去除食物残渣，重复2次。在厌氧工作站内将离心管管盖旋紧，并且用封口膜密封管盖后拿出厌氧工作站进行离心，4000rpm离心10min收菌。离心结束后再将其转移至厌氧工作站内，去尽上清液，底部沉淀即为收集到的菌体，使用粪便保护液重悬菌体。粪便初始体积：重悬加入粪便保护液得到的终体积比为1:5，使用粪便保护液重悬菌体，分装在后用于移植，粪菌液分装好后立即转移至-80℃冰箱保存。

实验过程使用的厌氧工作站目的为试验提供厌氧环境，厌氧环境下要求O

3、粪便供体信息。

二、动物模型构建

小鼠信息：SPF级6周龄雄性C57BL/6小鼠36只，每组12只，平均体重：20.9±0.9g。购自南京集萃药康生物科技股份有限公司。

36只小鼠适应性喂养3天后，通过Excel2019软件生成随机数字对小鼠根据体质量及小鼠血压随机分组，分为健康对照组（C组）、高血压阴虚证组（HY组）及高血压非阴虚证组（HNY组），每组12只。采用氨苄青霉素、万古霉素新霉素及甲硝唑四联抗生素清扫小鼠肠道微生物2周，抗生素清扫第1周通过抗生素灌胃给药量（氨苄新霉素5mg/只；甲硝唑4mg/只；硫酸新霉素5mg/只；盐酸万古霉素5mg/只），抗生素清扫第2周通过抗生素饮水给药（氨苄新霉素1g/L；甲硝唑1g/L；硫酸新霉素1g/L；盐酸万古霉素0.5g/L）。抗生素清扫结束48h后，进行粪菌移植。通过灌胃接种供体粪菌液，每例供体移植给6只小鼠。健康志愿者供体粪菌液移植给健康对照组小鼠，高血压病阴虚证患者供体粪菌液移植给高血压阴虚证组小鼠，高血压病非阴虚证患者供体粪菌液移植给高血压非阴虚证组小鼠。每只小鼠连续灌胃粪菌液3天，200μL/只/天，接下来在整个实验研究过程中每隔天1天加强接种1次，200μL/只。粪菌移植共计5周。

三、模型评价。

粪菌移植阶段每周检测小鼠摄食量、饮水量、采用Tail-Cuff 法测量各组小鼠收缩压、舒张压及心率。实验最后一周各组进行小鼠旷场实验、易激惹评分；测定小鼠体温变化、唾液流率、粪便含水量、皮肤含水量、24h尿量、尿胆素原和胆红素、心脏指数评价是否出现阴虚证表型。

四、评价结果。

测量结果以

4.1. 旷场实验。

实验于最后1周进行旷场实验。通过旷场实验观察评价小鼠的自主行为，探究其对开阔环境的焦虑行为，评价高血压病阴虚证“烦躁”的程度。实验装置由长×宽×高为25cm×25cm×25cm的无盖立方形装置（北京吉安得尔科技有限公司）组成。旷场装置置于暗光的室内，将数码摄像机置于装置正上方进行摄像和计时。实验前先将小鼠置于实验室内适应10min。实验在安静环境下进行，将小鼠轻柔置于实验箱中央区域，同步录像并计时，观察5min内小鼠活动情况，包括小鼠在正中格停留时间、穿格次数、运动距离、运动速度和排便粒数。

由图1可知，与C组相比，HY组小鼠总跨格次数、中央区跨格次数、粪便颗粒数显著升高（P<0.05或P<0.01），HNY组未见显著性差异（P>0.05）。

4.2. 易激惹评分。

实验最后一周对小鼠进行易激惹评分。通过捉拿小鼠观察小鼠反应状态对小鼠进行易激惹评分，用以评估小鼠“烦躁”。实验在安静环境下进行，左手轻柔提起小鼠尾部置于笼盖上，右手捉持颈部，观察小鼠反应并对其进行级别评分。

1级：指捉持颈部时出现尖叫、惊跳，计1分；

2级：捉持颈部时欲咬人，计2分；

3级：指提拿尾部时即出现尖叫、惊跳甚至咬人或与同笼小鼠频繁打斗，计3分；

无上述情况者为0级，计0分。

由图2可知，与C组比较，HY组易激惹程度评分显著增加（P<0.01 ），与HNY组相比，HY组易激惹程度评分显著增加（P<0.05）。

4.3. 体温。

使用红外测温仪检测小鼠左上肢爪心温度、右上肢爪心温度、左下肢爪心温度、右下肢爪心温度、心前区温度及肛温。将仪器测温探头对准检测四肢爪心、心前区及肛门正中位置，距离约1～2 cm。评价“五心烦热”中“热”的表现。分别于8：30、15：00和20：00检测小鼠四肢爪心温度，评价阴虚证小鼠是否出现“潮热”症状。

由图3可知，与同时间C组相比， HY组15：00双下肢平均温度、双上肢平均温度、心前区温度、肛温显著升高（P<0.01或P<0.01），HY组20：00双下肢平均温度、双上肢平均温度显著升高（P<0.01或P<0.01 ）；与同时间HNY组相比， HY组15：00双下肢平均温度、双上肢平均温度、心前区温度、肛温显著升高（P<0.01或P<0.01），HY组20：00双上肢平均温度显著升高（P<0.05 ）。

4. 饮水量。

饮水量=（每笼新加后水量-24h后剩余水量）/每笼小鼠只数。评价小鼠“口干”情况。

由图4可知，粪菌移植后，每周检测小鼠饮水量，结果提示与C组相比，粪菌移植后第1，3，4，5周HY组小鼠饮水量显著升高（P<0.05或P<0.01）；与HNY组相比，粪菌移植后第1，3，5周HY组小鼠饮水量显著升高（P<0.05或P<0.01）。

4.5. 唾液流率。

皎洁牌中速定性滤纸（型号：102）剪成半径约2 cm、角度为45度的等大扇形，重量差别在10%以下，用镊子夹持探入小鼠口中，在舌面停留5 s后取出，用电子天平称重，检测小鼠唾液流率。唾液流率（mg/s）=（滤纸湿重-滤纸干重）/5 s。评价小鼠 “口干”情况。

于实验最后一周检测各组小鼠唾液流率，由图5可知，与C组相比，HY组唾液流率显著下降（P<0.01）；与HNY组相比，HY组唾液流率显著下降（P<0.05）。

4.6. 粪便含水量。

于实验最后一周检测粪便含水量。提起小鼠尾部，轻轻按摩其肛门部，促使其排便，取刚排出的新鲜粪便30mg（2或3粒）放入快速卤素水分测定仪托盘中，选择自动模式105℃加热烘干，记录粪便含水量数值，评价“大便干燥”程度。

由图6可知，与C组相比，HY组粪便含水量显著下降（P<0.01）；与HNY组相比，HY组粪便含水量未见显著变化（P>0.05）。

4.7. 皮肤含水量。

用剃毛器剔除小鼠背部大小约为1cm×1cm毛发，充分暴露背部皮肤，此为背部皮肤含水量检测区。四肢皮肤含水量检测区为四肢爪心部位。使用便携弹性水分油光皮肤测试仪测定小鼠背部和四肢皮肤含水量，于实验最后一周检测，评价“皮肤干燥”程度。

由图7可知，与C组相比，HY组背部皮肤含水量、四肢皮肤含水量显著下降（P<0.01或P<0.05）；与HNY组相比，HY组背部皮肤含水量、四肢皮肤含水量显著下降（P<0.01或P<0.05）。

4.8. 体质量。

粪菌移植后，电子天平每周测定1次小鼠体重。

由图8可知，各组间小鼠体重未见显著差（P>0.05）。

4.9. 24h尿量。

将小鼠放置于代谢笼内，收集每只小鼠24h尿量。

由图9可知，各组间小鼠24h尿量未见显著差（P>0.05）。

4.10. 尿胆素原和胆红素。

采用尿液干化学分析方法检测尿液中尿胆红素及尿胆原含量。实验最后一周收集小鼠新鲜尿液，将尿液分析试纸条（苏州第壹制药有限公司）充分浸入尿液，在色标上按规定时间内与标准色标进行比色，根据目测法读取结果并记录。检测结果表现为阴性（-）、弱阳性（+）、阳性（++）、强阳性（+++）。通过计算尿胆素原弱阳性率（尿胆素原弱阳性率=尿胆素原弱阳性例数÷总例数×100%）、尿胆红素阳性率（尿胆红素阳性率=尿胆红素阳性例数÷总例数×100%），采用秩和检验统计各组间差异。反映小鼠尿液中尿胆原及尿胆红素水平，评价“尿赤”程度。

由图10可知，C组尿胆素原弱阳性率为83.3%，阳性率为16.7%；HY组尿胆素原弱阳性率为41.7%，阳性率为58.3%；HNY组尿胆素原弱阳性率为63.6%，阳性率为36.4%。与C组比较，HY组尿胆素原显著升高（P<0.05）。C组尿胆红素弱阳性率为41.7%，阳性率为58.3%，强阳性率为0%；HY组尿胆红素弱阳性率为0%，阳性率为25%，，强阳性率为75%；HNY组尿胆红素弱阳性率为36.4%，阳性率为45.6%，强阳性率为18.1%。与C组比较，HY组尿胆红素原显著升高（P<0.01），与HNY组比较，HY组尿胆红素显著升高（P<0.05）。

4.11. 心脏指数。

异氟烷麻醉小鼠后处死，开胸取出心脏，用手术剪将大血管残端、筋膜和脂肪组织剔除，分离出全心，用预先配制好的生理盐水冲洗去残留的血液，用滤纸将水分吸干，在分析天平上称量全心湿质量，并根据以下公式计算心脏指数：心脏指数=全心湿重/小鼠胫骨长度。

由图11可知，HY组、HNY组小鼠心脏指数显著升高（P<0.05或P<0.01）。

4.12. 摄食量。

粪菌移植后，每周检测小鼠摄食量。小鼠每日平均食量=（每笼新加后饲料量-24 h后剩余饲料量）/每笼小鼠只数，评价小鼠是否出现“纳差”表现。

由图12可知，与C组比较，HY组粪菌移植后第1,3周饮食下降（P<0.05或P<0.01），HNY组粪菌移植后第1,3,5周饮食下降（P<0.01）。与HNY组比较，HY组粪菌移植后第5周饮食增多（P<0.01）。

4.13. 收缩压、舒张压及心率。

采用尾压法（Tail-cuff法）测量小鼠收缩压、收缩压及心率（KENT公司CODA血压仪），每周检测一次。将闭塞套套在距离鼠尾根部大约1cm的位置，将容积压力传感器（VPR）套在鼠尾上，到达位置为传感器无法再往鼠尾根部方向推动为止。在闭塞套和VPR传感器中充气，直至闭塞套完全阻断了鼠尾部的血流，开始放气，这时随着放气，鼠尾动脉慢慢打开，至有血流从动脉流入鼠尾，这时鼠尾的容积开始改变，容积压力传感器感受到鼠尾容积开始变大，鼠尾容积开始变化的这一点鼠尾的压力便是收缩压。继续放气，动脉完全打开，静脉也开始打开有回流血经鼠尾。在静脉打开的瞬间，容积压力传感器感应到的鼠尾容积变化的斜率最大，鼠尾容积变化斜率最大时刻鼠尾压便为舒张压。每次每只小鼠测量15-30次左右，取3-10次测量值的平均值。

由图13、图14、图15可知，与C组收缩压相比，FMT后第2、3、4、5周HY、HNY组收缩压、舒张压显著高于C组（**P<0.01），FMT后第3，4，5周HY、HNY组收缩压上升趋于平稳。 HY、HNY组间收缩压、舒张压无显著性差异（P>0.05）。与C组相比，实验最后一周，HY组心率显著升高（P<0.01）。