一种CpGODN佐剂及其在抗体生产中的应用

摘要

本发明涉及一种CpG ODN佐剂及其在抗体生产中的应用，属于多克隆抗体生产技术领域。所述CpG ODN佐剂在抗体生产中的应用为按照CpGODN‑1、CpG ODN‑2、CpG ODN‑3、CpG ODN‑4、CpG ODN‑5、CpG ODN‑6、CpGODN‑7、CpG ODN‑8、CpG ODN‑9和CpG ODN‑10序列中的一种或几种进行合成后，然后混合，再与阳离子脂质体试剂等体积混合，作为CpG ODN混合佐剂用于抗体生产。使用本发明提供的为CpG ODN混合佐剂，可将常规的动物免疫周期由10周缩短至4周。生产的多克隆抗体产品效价明显高于对照组，抗体产量也比对照组高。

说明书

技术领域

本发明属于多克隆抗体生产技术领域，具体地，涉及一种CpG ODN佐剂及其在抗体生产中的应用。

背景技术

多克隆抗体指用包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。在体外诊断试剂中，免疫比浊法试剂可以使用单克隆抗体或多克隆抗体，使用单克隆抗体成本较高，因为只能识别有限表位，不能保证对样本中靶蛋白的完全识别。因此，目前市场上免疫比浊试剂大都采用多克隆抗体。多克隆抗体成本较低，可以批量生产，但对生产周期、抗体效价、批间差异等都有着很高的要求。多克隆抗体一般制备流程为抗原制备、动物免疫、效价检测、血清采集与处理，抗体纯化。其中动物免疫主要是使用合适的佐剂配合抗原接种动物，按照一定的免疫方案进行多次接种，使其尽可能快速、高效、大量的产生特异性抗体。

CpG ODN佐剂是一种含有非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的脱氧核苷酸序列，可以增强抗原的加工递呈，诱导体液免疫。CpG ODN通过激活TLR9信号，可以与B细胞抗原受体信号协同促进初始B细胞、已诱发B细胞和记忆性B细胞的激活，并进一步分化为分泌抗体分子的浆细胞。TLR9主要由浆细胞和B细胞表达，暴露于TLR9激动剂中的B淋巴细胞更容易被抗原激活以反映它们作为免疫增强剂的效用。一般来说，由于初始B细胞不具备表达TLR9的能力，所以其对于CpG ODN的激活作用并无响应，因此必须事先用抗原刺激初始B细胞以确保其被CpG ODN激活后可分化成浆细胞。CpG ODN能够人工合成，可应用于多种抗原，以冻干粉保存，状态稳定，便于运输，为其作为免疫佐剂产业化提供了有力的基础支持。

现有技术公开了CpG ODN佐剂在多种人类疫苗、动物疫苗中的具体序列、制备和应用方法，可以明显增强疫苗的效果。而在多克隆抗体的生产过程中，选择合适的CpG ODN佐剂，设计合理的方案，配合传统的免疫技术，发挥其免疫增强剂的作用，使得多克隆抗体的生产的周期更短，抗体效价更高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CpG ODN佐剂及其在抗体生产中的应用，以解决背景技术中的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种CpG ODN佐剂，具体序列如表1所示。

表1

合成上述10项序列中的一种或几种序列，混合后，再与阳离子脂质体试剂混合，作为CpG ODN混合佐剂用于抗体生产。

进一步地，所述阳离子脂质体试剂为本领域技术人员熟知的试剂，如Lipofectamine阳离子脂质体试剂、PPL Fectin阳离子脂质体试剂等。

优选地，该种CpG ODN佐剂在抗体生产中的应用的具体包括以下步骤：

步骤一、抗原准备；

步骤二、CpG ODN混合佐剂准备：合成表1中的序列，然后进行等质量混合，并与阳离子脂质体试剂等体积混合，静置30min后，待用；

步骤三、免疫试验以及抗体提取：

i.使用弗氏完全佐剂进行基础免疫，3天后对动物注射CpG ODN混合佐剂；

ii.7天后使用弗氏不完全佐剂进行第一次加强免疫，同时给动物注射CpG ODN混合佐剂；

iii.14天后使用步骤ii中的操作进行第二次加强免疫；

iv.21天后使用步骤ii中的操作进行第三次加强免疫；

v.28天后进行血清终放采集，并检测效价，抗体纯化。

本发明的有益效果：

使用CpG ODN混合佐剂按照本发明进行多克隆抗体生产，可将常规的动物免疫周期由10周缩短至4周。生产的多克隆抗体产品效价明显高于对照组(对照组1-2)，抗体产量也比对照组(对照组1-2)高。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

CpG ODN佐剂在抗体生产中的应用试验

步骤一、抗原准备：

使用大肠杆菌重组表达的人降钙素原(PCT)重组蛋白作为免疫原，抗原浓度1mg/mL；基础免疫抗原为500ul重组PCT蛋白，与500ul弗氏完全佐剂(Sigma，F5881)混合，进行1分钟超声乳化，重复3次；加强免疫抗原为500ul重组PCT蛋白，与500ul弗氏不完全佐剂(Sigma，F5506)混合，进行1分钟超声乳化，重复3次；

步骤二、CpG ODN混合佐剂准备：

合成CpG ODN-1、CpG ODN-2、CpG ODN-3、CpG ODN-4、CpG ODN-5、CpG ODN-6、CpGODN-7、CpG ODN-8、CpG ODN-9、CpG ODN-10。使用ddH2O溶解为5mg/mL母液，各取0.1mL混合，涡旋混匀；使用前，CpG ODN与Lipofectamine 2000(Thermo,11668019)按照体积比1:1混合，静置30分钟后使用；

步骤三、免疫试验以及抗体提取：

3.1免疫方案：常规周期组：基础免疫后每隔两周进行一次加强免疫，五免结束后两周进行采血。基础免疫使用弗氏完全佐剂与抗原乳化后接种，3天后单独注射CpG ODN混合佐剂。加强免疫使用弗氏不完全佐剂与抗原乳化后接种，同时单独注射CpG ODN混合佐剂。

3.2、免疫过程

3.2.1动物准备：挑选健康的8周大小的新西兰大白兔8只，常规周期组与优化周期组各4只，组内实验组与对照组各2只。

3.2.2预采血(作阴性参照用)

将兔子小心地放入固定的架中，小棉球沾酒精涂抹血管部位，使血管膨胀。用注射器从耳静脉抽取约10mL血液，适当按压伤口以免流血，然后用酒精棉球消毒伤口。将收集的血液置于37℃灭活30min，最后置于4℃过夜使其凝结释放血清。凝结好的血液在10000R/min离心10min，收集上清。

3.2.3动物接种

注射两只兔子的抗原为1mL,小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位，背部和大腿根部均可，每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm，注射完后停留数秒以防止抗原外流。CpG ODN混合佐剂单独注射，每只兔子免疫4个部位，每个部位125ul，错开抗原注射位置。按照分组免疫方案中的周期进行接种。

3.2.4血清处理与抗体纯化

3.2.4.1血清处理：免疫完成后进行采血，将收集的血液置于37℃灭活30min，最后置于4℃过夜使其凝结释放血清。凝结好的血液在10000R/min离心10mi，收集上清。

3.2.4.2抗原亲和柱的制备：取适量的NHS-Activated Beads 4FF，用1mM HCl溶液抽滤清洗三次，用偶联液清洗一次。溶解好的样品加入至清洗好的NHS-Activated Beads4FF中，NHS-Activated Beads 4FF：样品溶液体积比较1：1；28℃振荡反应3h或者4度过夜。反应完后收集偶联样品，以便检测偶联效率。去离子水清洗填料，加2倍柱体积的封闭液，28℃振荡反应1h；将上述反应体系取出，流干其中的封闭液，用3倍柱体积的去离子水清洗树脂，清洗液1、去离子水、清洗液2和去离子水重复冲洗2次，然后保存在等体积的保护液中，于2℃-8℃保存。

3.2.4.3抗原亲和纯化：取出待处理的各批次血清，用除菌0.22um膜过滤。再取出偶联好的抗原亲和层析柱，将柱子中的填料吸入血清中，放于混旋仪中4℃过夜孵育或者室温混匀2小时；将孵育后的血清进行过柱子，控制流速，收集流出液作FT，然后用1×PBS pH7.4清洗层析柱，收集流出液作W0，最后用0.1M甘氨酸缓冲液洗层析柱，收集洗脱液液作E,E中均匀的加入平衡液使其pH恢复中性；再根据蛋白多少决定是否再一次过柱，直到无蛋白为止。

3.2.4.4样品处理：纯化后的洗脱样按20mL对1-2L 1×PBS中透析；透析好的样品用50KD的浓缩管进行超滤，浓缩后的样品取样进行测定抗体浓度及分装放入防冻裂的管子中，做好标记，放于-20℃保存。

3.2.5效价检测

配制1X CBS，用CBS将抗原稀释至1ug/mL，加入酶标板中，每孔100ul，4℃放置过夜。弃去酶标板中样品，洗板2次，加入封闭液，每孔150ul，37℃孵育2h。弃去酶标板中封闭液，放入拍板机离心甩干，4℃放置备用。用抗体稀释液将血清按1:1000稀释后，取稀释板加210ul稀释血清加入第一孔，后面每孔加入140ul的抗体稀释液，从第一孔吸取70ul至第二孔混匀后，再从第二孔吸入70ul至第三孔混匀，以此类推进行倍比稀释，直至第七孔，保留第八孔为抗体稀释液阴性对照，将稀释好的抗体转板至包被板，将包被板放入37℃恒温箱中孵育40min。弃去酶标板中样品，放入洗板机中，用0.05％TWEN20洗涤液洗板5次后，放入拍板机离心甩干。将HRP标记的山羊抗小鼠1gG(H+L)用抗体稀释液按1:10000稀释后，每孔加入100ul，将酶标板放入37℃恒温箱中孵育40min。弃去酶标板中样品，放入洗板机中，用0.05％TWEN20洗涤液洗板5次后，放入拍板机离心甩干。配制TMB工作液(将TMB A、B液等体积混合，现用现配)，每孔加入100ul，37℃恒温箱中孵育10min，每孔加入50ul终止液。选择450nm波长，酶标仪测定OD值，记录数据。

实施例2

CpG ODN佐剂在抗体生产中的应用试验

与实施例1相比，将步骤三中的免疫方案提换成以下方案，其他步骤相同：

优化周期组：基础免疫后每隔一周进行一次加强免疫，四免结束后一周进行采血。基础免疫使用弗氏完全佐剂与抗原乳化后接种，3天后单独注射CpG ODN混合佐剂。加强免疫使用弗氏不完全佐剂与抗原乳化后接种，同时单独注射CpG ODN混合佐剂。

对比例1(即对照组1)

抗体生产：

与实施例1相比，将CpG ODN混合佐剂中使用ddH2O等量替代，其余相同。

对比例2(即对照组2)

抗体生产：

与实施例2相比，将CpG ODN混合佐剂中使用ddH2O等量替代，其余相同。

实施例3

结果分析：

1.效价对比：实施例1-2和对比例1-2所得抗体的效价数据如表2所示。

表2

从表2中的数据，可以看出实施例1-2获得的抗体效价结果优于对比例1-2获得的抗体，且实施例2获得的抗体效价优于实施例1获得的抗体效价结果。

2.产量对比：实施例1-2和对比例1-2所得抗体的效价数据如表3所示。

表3

从表3中的数据可以看出实施例2所生产的抗体产量要高于实施例1、对比例1-2生产的抗体产量。

实施例4

CpG ODN佐剂在抗体生产中的应用试验：与实施例2相比，替换CpG ODN合成序列，其余与实施例2相同；

具体合成序列如表4所示。抗体生产结束后，进行111ng/mL抗原浓度包被酶标板测定抗体效价(以OD值标示)，同时测量抗体产量，具体如表4所示。

表4

从表4中可以看出，实施例4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15、4-16、4-17、4-18所得的序列应用到抗体生产中，所得抗体效价和产量均优于对比例2抗体生产试验效果。

在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。