一种铜钴双金属有机框架纳米酶及其有机磷比色传感器的比色分析方法

摘要

本发明涉及一种铜钴双金属有机框架纳米酶及其有机磷比色传感器的比色分析方法，首先，以CTAB为软模板，以2‑甲基咪唑为有机配体，以三水合硝酸铜为铜源，六水合硝酸钴为钴源，去离子水作为溶剂合成铜钴双金属有机框架纳米酶（CuCo‑ZIF）。本发明所合成的CuCo‑ZIF纳米酶具有规则立方体结构使其具有较大的比表面积，高孔隙率和高稳定性，该纳米酶的过氧化物酶活性大大提高。再以该纳米酶构建比色传感器，进行比色分析以直接可视化检测有机磷，可快速简便且可视化地实现对有机磷的高灵敏检测，并且具有稳定性好，检测限低，灵敏度高和特异性好等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及比色分析技术领域，特别涉及一种铜钴双金属有机框架纳米酶及其有机磷比色传感器的比色分析方法。

背景技术

有机磷农药作为最常见的农药之一被广泛应用于农业，畜牧业和公共花园等多个场景。同时，多场合有机磷农药的滥用也造成了对水资源、水果、蔬菜和加工食品的污染，这对生态环境和人体健康造成极大破坏。因此，高效灵敏地检测环境中有机磷含量显得尤为重要。比色传感器以其高灵敏度、快速的测定速度和高的稳定性以及低成本而引起了人们对样品中有机磷浓度检测的极大兴趣。传统的有机磷比色检测普遍使用乙酰胆碱酯酶；然而，乙酰胆碱酯酶作为一种天然酶，其活性范围和抗干扰性受到极大的限制。现有技术中，鲜有机磷直接比色检测的相关报告。

近年来，人工纳米模拟酶由于其呈现出类似天然酶的催化效率和酶促反应动力学，且比天然酶稳定，因其在强酸碱或较大温度范围内，仍能保持高的催化活性而受到了广泛的关注。金属有机框架（MOFs）具有高孔隙率、大比表面积、高稳定性、孔径可调和特殊的催化活性等优越性能而被广大研究人员开发作为纳米酶。此外，双金属MOF纳米酶被广泛应用于催化、癌症治疗及传感器领域。到目前为止，研究人员已经用溶剂热溶法、化学沉积法、超声辅助方法等合成方法合成了不同形貌的双金属MOF纳米酶。

本发明结合软模板策略与一锅合成法，利用三水合硝酸铜作为铜源，六水合硝酸钴作为钴源，制备新型的铜钴双金属有机框架纳米酶（CuCo-ZIF）。利用有机磷（OPs）对CoCu-ZIF双金属纳米酶在3,3',5,5-四甲基联苯胺(TMB) -过氧化氢 (H

发明内容

本发明针对现有技术中，利用天然酶进行有机磷比色检测存在的活性范围小，抗干扰能力差的问题，首先提供一种铜钴双金属有机框架纳米酶，利用其金属有机框架复合材料界面比表面积大，良好的稳定性和较好的催化性，以表现出优异的类酶催化性能。

本发明的目的是这样实现的，一种铜钴双金属有机框架纳米酶，其特征在于，以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为软模板，以2-甲基咪唑为有机配体，以硝酸铜为铜源，硝酸钴为钴源，去离子水作为溶剂合成了铜钴双金属有机框架纳米酶（CuCo-ZIF），其粒径为450～550 nm。

铜钴双金属有机框架纳米酶的具体合成方法包括如下步骤：

第一步，将摩尔比为20～25：30～35：1的硝酸铜、硝酸钴、CTAB溶于超纯水中，将体系超声振动10 min形成A液；按0.75～0.8M的浓度，将2～甲基咪唑溶于超纯水，超声振动10min形成B液；

第二步，在搅拌状态下将B液加入A液中，于常温下混合搅拌1 h，随后，以8000 rpm离心分离固相并用乙醇洗涤三次，最后将所得固体于真空烘箱中烘干得到铜钴双金属有机框架纳米酶。

进一步地，A液中硝酸铜的浓度为为4～5 mM， 所述A液与B液混合后，混合液中2～甲基咪唑、硝酸铜、硝酸钴、CTAB的摩尔比为2500～3000：20～25：30～35：1。

再进一步地，第二步中，真空烘干的温度为60～70℃，烘干时间为10～12 h。

本发明的铜钴双金属有机框架纳米酶，结合软模板策略与一锅合成法，利用三水合硝酸铜作为铜源，六水合硝酸钴作为钴源，制备新型的铜钴双金属有机框架纳米酶（CuCo-ZIF）。一方面其具有金属有机框架材料高孔隙率、大比表面积、高稳定性、孔径可调和特殊的催化活性等优点。另一方面，具有两个金属中心的双金属有机框架复合材料，拥有更多的催化活性位点和吸附位点。因此，本发明合成的铜钴纳米粒子的金属有机框架复合材料界面具有大的比表面积，良好的稳定性，较好的催化性，表现出优异的类酶催化性能，良好的稳定性及耐受性，基于该纳米酶的优良性能，可以很好的应用在比色传感器领域。

本发明还提供一种基于上述铜钴双金属有机框架纳米酶的有机磷比色传感器的比色分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将上述铜钴双金属有机框架纳米酶超声分散于去离子水，得到分散浓度为1～2 mg/mL的均匀分散液；

（2） 取步骤（1）中的铜钴双金属有机框架纳米酶分散液若干份，分别加入磷酸缓冲溶液和定量体积的不同浓度的有机磷溶液，震荡分散得到均匀的混合液；

(3)分别向步骤（2）的混合液中加入TMB溶液和H

（4）以根据步骤（3）中各溶液吸光度的峰值变化与对应的有机磷溶液浓度关系绘制线性曲线，作为有机磷比色检测的标准曲线。

进一步地，所述磷酸缓冲溶液由0.1 M的 Na

进一步地，步骤（3）中，所述TMB溶液浓度为20 mM，加入体积步骤2中混合液体积的11.0%～11.5%，所述H

本发明的基于铜钴双金属有机框架纳米酶的有机磷比色传感器的比色分析方法的检测原理为：利用有机磷（OPs）对CoCu-ZIF双金属纳米酶在TMB-过氧化氢反应体系中的催化活性的抑制作用，CuCo-ZIF纳米酶可以在有H

附图说明

图1为实施例1制备铜钴双金属有机框架纳米酶的电镜图。

图2为本发明的铜钴双金属有机框架纳米酶的有机磷比色传感器及比色分析方法原理示意图。

图3为本实施例3中的铜钴双金属有机框架纳米酶的有机磷比色分析方法的可行性研究图。

图4为实施例3中的铜钴双金属有机框架纳米酶的比色检测已知浓度的有机磷标准样品的线性曲线。

图5为实施例5中的铜钴双金属有机框架纳米酶的比色检测已知浓度的有机磷（敌敌畏）标准样品的线性曲线。

图6为实施例6中基于钴锌双金属有机框架纳米酶的比色检测有机磷标准样品的线性曲线。

具体实施方式

实施例1

本实施例首先制得铜钴双金属有机框架纳米酶。

通过软模板一锅法合成铜钴双金属有机框架纳米酶:取一个反应器A，按摩尔比为20：30：1分别称取三水合硝酸铜、六水合硝酸钴、CTAB，再按三水合硝酸铜0.045mmol/mL的浓度称量超纯水，将前述各组分投入反应器A中，超声混合10min，使其混合均匀后得到淡粉色A溶液；再另取一反应器B，按0.79M的浓度配制2-甲基咪唑与超纯子的溶液B，再按2-甲基咪唑与三水合硝酸铜的摩尔比为2750：20的比例，将A溶液滴加入反应器B中，常温下快速搅拌1小时，反应后，静置15min，将溶液以8000 rpm离心，并用无水乙醇洗涤3次，最后于60

如图1所示，为本实施例的铜钴双金属有机框架纳米酶的电镜图，由图1a、1b可清晰看出铜钴双金属有机框架纳米酶为立方状，其粒径约为500 nm，且分散均匀。

实施例2

通过软模板一锅法合成铜钴双金属有机框架纳米酶:取一个反应器A，按摩尔比为25：35：1分别称取三水合硝酸铜、六水合硝酸钴、CTAB，再按三水合硝酸铜0.04mmol/mL的浓度称量超纯水，将前述各组分投入反应器A中，超声混合10min，使其混合均匀后得到淡粉色A溶液；再另取一反应器B，按0.75M的浓度配制2-甲基咪唑与超纯子的溶液B，再按2-甲基咪唑与三水合硝酸铜的摩尔比为2500：25的比例，将A溶液滴加入反应器B中，常温下快速搅拌1小时，反应后，静置15min，将溶液以8000 rpm离心，并用无水乙醇洗涤3次，最后于70

实施例3

本实施例按图2所示铜钴双金属有机框架纳米酶的有机磷比色传感器及比色分析方法原理示意图以实施例1制备的铜钴双金属有机框架纳米酶为活性成份，进行有机磷比色传感器的比色分析方法的研究。

本实施例将制备的铜钴双金属有机框架纳米酶1 mg超声分散于1 mL去离子水，得到均匀的分散液；然后，取分散液0.2 mL加入到由0.1 M Na

如图3所示，为基于本实施例的上述比色检测方法进行的铜钴双金属有机框架纳米酶的有机磷比色分析方法的可行性研究图。分别进行了四种测试液的比色分析研究。图3A中显示不同浓度的有机磷溶液在0.1 M pH=4.0的 PBS缓冲溶液中的吸光度曲线。曲线a是有机磷不存在情况下，CuCo-ZIF纳米酶在TMB- H

如图4为按本实施例第二段所述的分析方法按表1所述的固定体积的不同已知浓度的有机磷（甲基嘧啶磷）标准样品的线性曲线。如表1所述的22个不同已知浓度有机磷（甲基嘧啶磷）的分析检测，具体浓度值和对应的吸光度值如表1所述，其中浓度的单位为μM。

表1

按表1的机机磷浓度值和紫外分光光度计检测的各溶液的吸光曲线如图4A所示，以不同已知的浓度值为横坐标，以将不存在有机磷时溶液的652 nm处吸光度值减去图4A中各有机磷浓度下溶液的652 nm处吸光度值，得到吸光度差值（ΔA），以各ΔA值为纵坐标，得到图4B的标准曲线，根据前述分析检测和图4B 的标准曲线，可以看到对应的ΔA随着有机磷浓度成线性增加，线性范围达到了0.0006 μM～ 0.03 μM和0.03 μM ～3 μM, 在此浓度区间内CuCo-ZIF纳米酶有较高的活性且对有机磷有较好的线性响应范围，检出限（LOD）可低至0.151 nM，特别是在0.0006 μM～ 0.03 μM的底浓度范围内表现的检测灵敏度更高，有机纳米酶的活性更强。

实施例4

为考察实施例3的纳米酶传感器的实际应用的可靠性，按实施例3的比色检测方法进行了实际样品的加标检测，各检测样本的有机磷的加标浓度如表2。与现有参考方法检测含量相比，本发明方法检测的相对误差小于10 % ，说明该传感器在实际样本中可以准确检测有机磷含量，如表2所示：

表2.机磷（甲基嘧啶磷）的加标测定

实施例5

本实施例为基于铜钴双金属有机框架纳米酶的有机磷（敌敌畏）比色分析方法，包括如下步骤：

将1 mg铜钴双金属有机框架纳米酶（实施例2所得CuCo-ZIF纳米酶）超声分散于1mL去离子水，得到均匀的分散液；然后，取分散液0.2 mL加入到pH值为4.5，由0.1 M Na

表3

按实施例3的中绘制图4的方法，根据各浓度的敌敌畏溶液对应的吸光度峰值绘制如图5所示的检测有机磷（敌敌畏）标准样品的线性曲线。本实施例的中，有机磷（敌敌畏）检测的线性范围为0.006 μM～3 μM，检出限（LOD）为1.32 nM。由此可知，基于铜钴双金属有机框架纳米酶的有机磷比色传感器对敌敌畏也有很好的检测性，实际的有机磷农药检测应用范围广。

实施例6（对比例）

本实施例首先制备一种钴锌双金属有机框架纳米酶，然后再进行基于该钴锌双金属有机框架纳米酶的有机磷比色传感器及比色分析方法。

首先制备钴锌双金属有机框架纳米酶的有机磷比色传感器及比色分析方法，包括如下步骤：将1.455 g六水合硝酸钴、1.487 g 六水合硝酸锌溶解在4 mL去离子水中。然后，将其与40 mL 浓度为1.25 mM 的2～甲基咪唑水溶液混合，超声处理5 min，在室温下静置反应6 h。反应结束后，将溶液以8000 rpm离心15 min，并用无水乙醇洗涤3次，最后于50 ℃条件下干燥12 h得到CoZn-ZIF纳米酶。

再将上述1 mg钴锌双金属有机框架纳米酶超声分散于1 mL去离子水，得到均匀的分散液；然后，取分散液0.2 mL加入到由0.1 M Na

如图6分析可得，该基于钴锌双金属有机框架纳米酶检测有机磷标准样品的线性范围为0.15 μM～4 μM，检出限（LOD）为61 nM，与实施例3（线性范围为0.0006 μM～ 0.03 μM和0.03 μM ～3 μM，检出限为0.151 nM）对比可知，基于铜钴双金属有机框架纳米酶的有机磷比色传感器具有更宽的线性范围和更高的灵敏度。