一种神经内分泌肿瘤生物标志物在制备神经内分泌肿瘤诊断试剂中的应用

摘要

本发明公开了一种神经内分泌肿瘤生物标志物在制备神经内分泌肿瘤诊断试剂中的应用，所述神经内分泌肿瘤生物标志物为血清中的GPRASP1。本发明通过研究发现GPRASP1这种分子标志物在神经内分泌肿瘤患者中的差异表达，通过检测血清中GPRASP1的表达水平，可以判断受试者是否患有神经内分泌肿瘤，为神经内分泌肿瘤的诊断提供分子手段。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种神经内分泌肿瘤生物标志物在制备神经内分泌肿瘤诊断试剂中的应用。

背景技术

神经内分泌癌(Neuroendocrine carcinoma,NEC)是一种低分化的神经内分泌肿瘤(Neuroendocrine neoplasm)，是机体内一类起源于神经内分泌细胞或伴有神经内分泌分化的恶性肿瘤，因神经内分泌细胞广泛分布的特性，神经内分泌癌可发生在身体的多种器官和组织。此种恶性肿瘤同时具有神经内分泌的功能，可以分泌多肽类激素和神经介质，可分为大细胞神经内分泌癌、类癌、小细胞癌等，其中小细胞癌的恶性度高，预后生存更差。神经内分泌癌作为一种相对罕见但异质性极高的肿瘤，近年来发病率不断上升。大多数神经内分泌肿瘤发病初期恶性度不高，在常规检查中易被忽视，这类肿瘤也被称为类癌(carcinoid)。所以大部分患者被确诊时已处于分化较差的G2/G3期，此时已进展为神经内分泌癌(NEC)，肿瘤生长迅速且大部分已发生转移，由于缺少早期有效的筛查手段和特异性治疗靶点，在一定程度上导致了中晚期患者一旦确诊几乎面临无药可医的状态。

G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCRs)是一类细胞膜表面的受体超家族，目前大约有800成员以上，超过2％的人类基因组用来编码G蛋白偶联受体，几乎所有的人类疾病都与GPCRs结构和功能异常有关，包括神经内分泌性肿瘤。长期以来，研究人员过多关注细胞内信号分子转导以及核内受体家族和转录因子水平变化，而忽视细胞膜表面受体的变化。神经内分泌癌症的发病机制目前尚不清楚，特别是缺乏有效的治疗靶点和预警诊断标志物。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种神经内分泌肿瘤生物标志物在制备神经内分泌肿瘤诊断试剂中的应用，通过检测神经内分泌肿瘤生物标志物的表达水平可以判断受试者是否患有神经内分泌肿瘤的风险。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种神经内分泌肿瘤生物标志物在制备神经内分泌肿瘤诊断试剂中的应用，所述神经内分泌肿瘤生物标志物为血清中的GPRASP1。

所述的应用，其中，当血清中的GPRASP1表达水平上调时，受试者患有神经内分泌肿瘤。

所述的应用，其中，所述神经内分泌肿瘤为肺癌或支气管癌。

有益效果：本发明通过研究发现血清中的GPRASP1这种分子标志物在神经内分泌肿瘤患者中的差异表达，通过检测血清中GPRASP1的表达水平，可以判断受试者是否患有神经内分泌肿瘤，为神经内分泌肿瘤的诊断提供分子手段。

附图说明

图1为GPRASP1在神经内分泌肿瘤和细胞系中表达水平图，其中，A为Oncomine数据库中RNA-seq结果显示小细胞肺癌GPRASP1表达水平高于其他类型的肺癌；B为CCLE数据库结果显示不同细胞系中GPRASP1表达水平。

图2为ELISA方法检测小细胞肺癌患者血清中GPRASP1表达水平结果图。

图3为不同组织芯片的IHC染色结果图，其中，左上图为小细胞肺癌组织(T2aN1M0)，右上图为肺腺癌组织(T1N0M0)，左下图为肺鳞癌组织(T3N0M0)，右下图为正常肺组织。

具体实施方式

本发明提供一种神经内分泌肿瘤生物标志物在制备神经内分泌肿瘤诊断试剂中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

由于神经内分泌癌临床确诊较晚，可供选择的治疗策略少，使得患者预后生存极其困难。此外，影像学诊断和生物标志物的诸多局限，也给临床治疗和诊断带来极大的挑战。目前临床上用于诊断神经内分泌癌的生物标志物包括血清嗜铬素A(CgA)、神经元特异性烯醇化酶(NES)、胰多肽、前胃泌素，以及物质P和神经激肽A等。这些因子可以用来协助诊断，但不足以确诊。理想的神经内分泌癌分子标志物，应该能敏感且特异性的区分NEC和其他肿瘤，并在一定程度上满足生物标志物对维度的需求，即能够提供肿瘤转移能力的信息以及预测评估治疗效果。而临床上作为神经内分泌癌症确诊的生物标志物不具备这些特性，与肿瘤负荷、分级与良恶性程度关系也不确定，并且特异性不够稳定，易出假阳性结果等。同时，由于神经内分泌癌的高度异质性，当前用于胃肠胰NEC诊断的生物标志物并不适合与支气管与肺部，并且目前尚无能用于诊断支气管与肺神经内分泌癌症的特异性循环生物标志物。因此，一种能用于准确诊断以及预测疗效的神经内分泌肿瘤特异性生物标志物是临床上目前迫切需求的。

本发明通过研究发现了G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(G-protein coupledreceptor-associated sorting protein 1,GPRASP1)这分子标志物在神经内分泌肿瘤患者中的差异表达，因此，本发明提供了一种神经内分泌肿瘤生物标志物在制备神经内分泌肿瘤诊断试剂中的应用，所述神经内分泌肿瘤生物标志物为血清中的GPRASP1。当患者血清中的GPRASP1表达水平上调时，受试者患有神经内分泌肿瘤。本实施例中，所述神经内分泌肿瘤为肺癌或支气管癌。

具体来讲，本发明通过研究发现并鉴定了一种潜在的神经内分泌肿瘤的生物标志物-GPRASP1，为了保证细胞外信号向细胞内传递时，其能够在强度以及时间空间上保持一定的特异性，GPCR的活性、数量和分布都会受到精准的调控。而对GPCR的调控的主要手段是保持位于细胞膜表面的受体数量及细胞受体总量的动态平衡。作为参与这一过程的主要调控分子，GPRASP1主要参与激动剂与膜表面的受体分子持续作用后的受体分子数量调控。在这一过程中，受体分子经由内吞作用进入细胞质并导致信号脱敏，GPRASP1负责帮助内吞到胞浆的GPCR进行命运抉择，一方面进入再循环重新回到细胞膜，使得受体复敏；另一方面，内吞后的受体被转运到溶酶体，在溶酶体内降解，引起受体总量和传递信号效率长时间下降。据此，本发明进一步探究了GPRASP1在神经内分泌性肺癌发生发展中的作用，同时探寻其在神经内分泌分化和去势性抵抗中所参与的信号网络以及直接调控的膜受体和下游靶基因，分析内分泌激素信号及其膜受体对细胞内蛋白因子网络的调控，并对其高度特异性做出合理的判断，为其生物标志物的功能提供理论支撑。

本发明通过对Oncomine数据库和CCLE数据库中的临床数据分析，主要选取肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌等)的数据集(包括肺腺癌139例，肺类肿瘤20例，小细胞肺癌6例，鳞状细胞癌21例)，分析GPRASP1在患者组织样本的DNA芯片和RNA-seq的数据中表达量。通过分析细胞系的RNA-seq数据，筛选并评估小细胞肺癌(神经内分泌表型肿瘤)细胞系中GPRASP1的表达水平，结果如图1所示，从图1可以看出神经内分泌性肿瘤细胞中GPRASP1也呈现高表达现象。

进一步地，收集肺癌患者的血清样本及对照样本，样本来自河北大学附属医院，其中小细胞肺癌患者血清25例，非小细胞肺癌患者血清14例，正常对照组25例，检测其中GPRASP1血清中的含量，为临床检测应用提供实验依据。本发明针对人源GPRASP1蛋白特异性的短肽序列设计特异性抗体，建立竞争性ELISA检测方法，对液体样本中GPRASP1含量进行定量检测，结果如图2所示。从图2可以看出SCLC患者血清中GPRASP1水平明显高于正常对照组，与肺腺癌患者血清含量相比也具有统计学意义(如图2中a所示)；如果将SCLC和NSCLC患者血清GPRASP1水平合并与正常对照组相比较，肺癌患者血清中的水平明显高于对照组(如图2中b所示)。结果提示，患者血清中GPRASP1水平有望作为肺癌，特别是小细胞肺癌的诊断标志物。

最后通过免疫组织化学(IHC)染色方法，对临床肺癌组织样本的组织芯片(购自西安艾莉娜生物科技有限公司，包括腺癌31例，鳞状细胞癌30例，腺鳞癌2例，小细胞癌4例，大细胞癌2例，神经内分泌癌1例)，采用特异性抗体进行检测，结果如图3所示，其中图3中左上角为小细胞肺癌组织样本染色结果图；右上角为肺腺癌组织样本染色结果图，左下角为肺鳞癌组织样本染色结果图，右下角为正常肺组织样本染色结果图。从图中可以看出神经内分泌癌(小细胞肺癌)患者组织样本中GPRASP1显著高表达。

本发明通过大数据分析、患者血清学检测、以及临床肿瘤组织的IHC结果三个方面均证实GPRASP1在神经内分泌癌中高表达，为此，本发明提出GPRASP1是一种潜在的新型神经内分泌肿瘤的生物标志物，该生物标志物可用于制备神经内分泌肿瘤诊断试剂。

现有的神经内分泌癌症诊断标志物，大多数无法通过血清含量的变化来检测，而需要通过穿刺活检的方法进行免疫组织化学检测。与之相比，血清中物质含量的检测具有取样方便，操作简单，患者创伤小，检测效率高等优点，本发明的实验结果证明了这项发明的可靠性，以及其作为生物标志物的灵敏度和特异性，为临床诊断神经内分泌癌症提供新的潜在的检测标志物，为实现神经内分泌肿瘤的早期诊断提供了新的思路。

小细胞肺癌也是一种神经内分泌肿瘤，临床上目前尚无有效的生物标志物进行早期诊断，为此，患者确诊时往往都已进到中晚期，面临手术困难，肿瘤进展快，易发生转移等。因此探寻早期可靠的临床检测手段具有极其重要的意义。本发明将神经内分泌肿瘤生物标志物血清中的GPRASP1用于制备神经内分泌肿瘤诊断试剂，将该神经内分泌肿瘤诊断试剂具有高效、准确、特异性强、灵敏度高等特点。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。