光甘草定眼用药物的制备及其在真菌性角膜炎治疗中的应用

摘要

本发明提供光甘草定眼用药物的制备及其在真菌性角膜炎治疗中的应用，涉及制药技术领域。该光甘草定眼用药物，以光甘草定为有效成分，光甘草定的浓度为16μg/mL，能有效杀伤真菌性角膜炎的致病真菌，同时不会损伤角膜上皮产生不良效果；该光甘草定滴眼液能作为真菌性角膜炎治疗药物应用：通过抑制真菌孢子黏附宿主细胞来抑制真菌生长，并且降低炎症反应因子白细胞介素‑1β(IL‑1β)，肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达，减轻角膜炎反应，促进组织的修复，大大有益于真菌性角膜炎患者的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及制药技术领域，具体为光甘草定眼用药物的制备及其在真菌性角膜炎治疗中的应用。

背景技术

真菌性角膜炎是一种由致病真菌引起的角膜炎症疾病；起病缓慢、病程较长，可出现眼红眼痛、视物模糊、畏光流泪及眼睑痉挛等症状，治疗不及时可引发严重的视力损害，甚至眼内感染。植物性外伤、隐形眼镜不恰当使用以及广谱抗生素和糖皮质激素的长期使用均导致其发病率逐年增加。曲霉菌和镰刀菌是真菌性角膜炎的主要致病菌。真菌感染角膜后会产生强烈的免疫反应：角膜血管扩张、炎症细胞被募集至损伤部位、免疫活性物质级联释放。炎症反应有利于病原菌的清除，但过度的炎症反应会造成角膜组织损伤加剧、愈合延迟，甚至失明。目前，临床上治疗真菌性角膜炎的常见药物有那他霉素、伏立康唑及两性霉素，但在用于治疗真菌性角膜炎时，存在生物利用度不高、真菌耐药等缺点的限制，因此寻找新型有效的抗真菌药物是目前真菌性角膜炎治疗的一项艰巨的任务。

光甘草定，是一种从传统中药材光果甘草中提取的黄酮类物质，具有抗细菌、抗真菌、抗氧化、抗炎、免疫调节以及神经保护作用。甘草这种中药的使用在中国传统医学已具有悠久历史，也是世界上使用最为广泛的草药之一。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了光甘草定眼用药物的制备及其在真菌性角膜炎治疗中的应用，解决了现有药膏抗菌效果不佳的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：光甘草定滴眼液，包括光甘草定、溶剂和灭菌注射用水；

所述溶剂为能与眼睛接触的且能溶解光甘草定的溶剂。

优选的，所述溶剂为二甲基亚砜，其体积浓度小于等于0.5％。

优选的，所述光甘草定的浓度为16μg/mL。

光甘草定眼膏，包括光甘草定和赋形剂。

优选的，所述光甘草定的浓度为16μg/mL。

优选的，所述赋形剂为液体石蜡、羊毛脂和黄凡士林中的一种或两种以上。

光甘草定滴眼液的制备方法，将光甘草定充分溶解于二甲基亚砜中，获得光甘草定溶液，将光甘草定溶液加入到灭菌注射用水中，混合均匀即可。

光甘草定滴眼液应用于真菌性角膜炎的治疗。

光甘草定眼膏应用于真菌性角膜炎的治疗。

(三)有益效果

本发明提供了光甘草定眼用药物(光甘草定滴眼液)，具备以下有益效果：

1.在此浓度(16μg/mL)条件下，能有效杀灭真菌性角膜炎的致病菌，同时不会损伤角膜上皮、产生眼部损害；且能通过破坏真菌细胞结构抑制真菌生长(减少99.9％的真菌数量)；并且还能通过降低炎症因子IL-1β、TNF-α和HMGB1的表达减轻角膜炎症反应，这将大大有益于真菌性角膜炎患者的预后。

2.作为真菌性角膜炎治疗药物，合理使用不会对眼表造成毒害损伤，能有效杀伤致病真菌，明显减轻角膜炎症反应，促进组织的修复，大大有益于真菌性角膜炎患者的预后。

3.原料易获得、配方简单、成本低廉，制备方法简单易控制，使用方法简单，具有巨大的市场前景。

附图说明

图1为本发明光甘草定滴眼液的细胞毒性实验结果图；

图2为本发明光甘草定滴眼液的最小抑菌实验和抑制真菌程度结果图；

图3为本发明光甘草定滴眼液应用后孢子粘附实验结果图；图中，黑色箭头指示细胞表面粘附的透明的小米粒状的烟曲霉分生孢子；

图4为本发明光甘草定滴眼液在小鼠真菌性角膜炎的应用后小鼠角膜裂隙灯检查图；

图5为本发明光甘草定滴眼液在小鼠真菌性角膜炎的应用后临床评分结果图；图中，黑色正方形代表感染对照组，白色圆形代表光甘草定滴眼液治疗组；

图6为本发明光甘草定滴眼液在小鼠真菌性角膜炎的应用后角膜PAS染色图；图中，红色箭头指示角膜基质中菌丝的分布情况；

图7为本发明光甘草定滴眼液在小鼠真菌性角膜炎的应用后角膜组织炎症因子基因表达情况。

上述图中，“*”对应p<0.05，说明有统计学差异，“**”对应p<0.01，说明有显著统计学差异，“***”对应p<0.001，说明有极其显著的统计学差异。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

取16μg光甘草定粉末充分溶解于二甲基亚砜中，获得光甘草定溶液，将光甘草定溶液加入到1mL灭菌注射用水中，混合均匀后即得光甘草定滴眼液，其中，灭菌注射用水为指符合中国药典注射用水项下规定的水。

将上述光甘草定滴眼液作为真菌性角膜炎治疗药物应用时，其用法用量：点眼，每日3-6次，每次给药量大于等于结膜囊容量即可。人结膜囊的容量通常为20μL，给药量大于20μL时，多余滴眼液会溢出，过多会造成浪费。

实施例二：

取16μg光甘草定粉末与1mL液体石蜡、羊毛脂和黄凡士林充分混合，即可获得光甘草定眼膏。其中，液体石蜡、羊毛脂和黄凡士林可以按照任意比例混合。

将上述光甘草定眼膏作为真菌性角膜炎治疗药物应用时，其用法用量：将大约1厘米长的药膏直接施用于下睑结膜囊，每日2次，多余眼膏会溢出，过多会造成浪费及睁眼不便。

细胞毒性实验：

将人角膜上皮细胞悬液(1×104/mL)接种于96孔板中，每孔100μL，培养约12小时(37℃,5％CO2)至细胞贴壁。将光甘草定以0、1、2、4、8、16、32μg/mL的终浓度加入培养基中。培养24小时后，向每孔中加入10μl CCK-8试剂，继续孵育2小时，用酶标仪(450nm)测量吸光度值(OD)。

图1结果显示，不超过16μg/mL的光甘草定溶液对人角膜上皮细胞无毒性作用，不影响其存活率。判断依据：浓度小于等于16μg/mL光甘草定孵育后，角膜上皮细胞对450nm波长光的吸光度值较正常对照组无明显差异。

最小抑菌浓度测定：

根据临床实验室标准化协会(CLSI)微量肉汤稀释法(M38-A2文件)检测光甘草定对烟曲霉菌最小抑菌浓度。调整孢子悬液浓度，在530nm波长处用分光光度计法将悬液调节至0.09至0.13范围内的吸光度值(OD)。取一96孔板，第2列至第8列每孔加入100μLSabouroud液体培养基，第9列每孔加入200μL终浓度为64μg/mL的Sabouroud液体培养基配制的光甘草定溶液。从第9列每孔用移液器取100μL溶液加入第8列对应孔，实现光甘草定溶液的梯度微量稀释。值得注意的是，从第4列取出的100μL液体弃之即可。第3列至第9列每孔中加入2μL已制备好的孢子悬浮液。第2列设为空白对照组，第3列设为感染对照组。轻轻混匀后，置于培养箱37℃环境孵育36小时。酶标仪(620nm)测量每个孔的OD值。

图2结果显示，大于等于16μg/mL光甘草定溶液处理后OD值显著降低，最小抑菌浓度为16μg/mL。图3结果显示，与未处理对照组相比，浓度为2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL，64μg/mL的光甘草定对真菌的抑制程度分别是8.44％，20.08％，59.22％，99.9％，99.98％，99.95％。

孢子粘附实验：

将人角膜上皮细胞接种于带腔室的载玻片过夜，至细胞贴壁生长。孢子悬液与光甘草定溶液混合后至孢子浓度为1×105/mL和光甘草定的终浓度为16μg/mL，37℃孵育3小时。载玻片用PBS轻轻冲洗，洗去未粘附的真菌孢子。采用HE染色的方式对每个腔室的细胞进行染色制成成片。通过明视野显微镜观察拍摄。计数100个HCECs表面粘附的孢子的数目，平均值表示粘附能力。

结果如图3显示，烟曲霉菌感染后，光甘草定处理的人角膜上皮细胞表面粘附的烟曲霉分生孢子明显减少，说明光甘草定能够降低真菌孢子的粘附能力，从而发挥抑菌作用。

小鼠真菌性角膜炎模型的建立：

给予小鼠腹腔麻醉(8％水合氯醛、0.4ml/kg)。在眼科手术显微镜下，用30G一次性注射器针头在瞳孔缘对应的角膜做一点状划痕，用10μLHami lton微量注射器将2μL孢子悬液(1×107/mL)注射至小鼠右眼中央角膜基质，左眼不予处理，作为空白对照组。完成基质内注射约4小时，给予小鼠气体麻醉于裂隙灯下观察小鼠右眼角膜混浊区域为小于25％，雾状混浊，眼表稍粗糙，此时，实验组右眼开始给予16μg/mL光甘草定滴眼液滴眼治疗，对照组右眼同时给予等量PBS治疗，两组左眼均不给予处理。滴眼治疗为五日疗程，一日三次。而且于建模后第一日和第二日晚上给予小鼠右眼10μL相应药物结膜下注射治疗。根据评分分级(表1)，每日于裂隙灯下密切观察小鼠角膜病情变化并评估临床评分，如图5和图6所示。于指定时间处死小鼠，收取小鼠角膜或眼球进行后续实验。

结果表明，与感染对照组相比，16μg/mL光甘草定滴眼液可明显减轻角膜溃疡面积，减轻角膜的炎性损伤，降低临床评分，改善角膜炎的预后。

表1小鼠真菌性角膜炎模型炎症分级

小鼠角膜高碘酸-希夫(PAS)染色实验：

收集感染后第3天的小鼠眼球并用OCT包埋剂包埋，液氮速冻后，冰冻切片机下将眼球切成10μm组织切片并用丙酮固定。按照PAS染色试剂盒说明书要求进行染色，中性树胶封片。使用光学显微镜观察并拍照。

图6结果显示，与感染对照组相比，16μg/mL光甘草定滴眼液治疗3天后，小鼠角膜基质中的菌丝分别明显减少，角膜厚度明显恢复正常，基质纹理较整齐。

光甘草定抗炎作用实验：

收集上述小鼠真菌性角膜炎模型中各组角膜，RT-PCR检测IL-1β、TNF-α和HMGB1的mRNA相对表达水平。

图7结果显示，经过1天治疗，光甘草定能够发挥降低以上炎症因子基因表达的作用，而且这种抑制作用持续至治疗第3天和第5天。对于未感染的角膜(N)，两治疗组之间未检测到以上炎症相关分子表达的差异。以上结果说明，光甘草定滴眼液可显著下调真菌诱导细胞产生的促炎因子水平。

另外，采用同等浓度的光甘草定眼膏代替光甘草定滴眼液，对小鼠真菌性角膜炎进行上述抗炎功能实验。实验结果表明：相同浓度的光甘草定眼膏和光甘草定滴眼液对促炎因子的抑制效果相当。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。