抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒及其应用

摘要

本发明提供了一种抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒及其应用，涉及生物技术领域。所述试剂盒包括突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒工作液，其由终投料比0.6ng/(个×mL)突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒、0.3ng/(个×mL)突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒、0.3ng/(个×mL)突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒和缓冲液混合；示踪物标记的抗体工作液，其由示踪物标记的抗人IgM抗体和稀释液组成。本发明试剂盒采用突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒混合，大幅提高灵敏度、特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒及其应用。

背景技术

将天然的波形蛋白中甘氨酸残基突变为精氨酸，精氨酸经由肽酰精氨酸亚氨酶瓜氨酸化后，增加了瓜氨酸这一潜在的蛋白决定簇，波形蛋白结构发生改变，产生了突变型瓜氨酸化波形蛋白。

与抗环瓜氨酸肽抗体相比，抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体在类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)辅助诊断上，特别是类风湿关节炎早期的辅助诊断上，具有较高的灵敏度和特异性。抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体在类风湿关节炎患者血清中出现的阶段早于其他标记物，通过检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的水平变化，可以反映类风湿关节炎患者的疾病程度，可辅助监测类风湿性关节炎患者的疾病治疗过程，对类风湿关节炎的早期诊断具有重要意义。

目前使用突变型瓜氨酸化波形蛋白检测血样中存在的抗突变型抗瓜氨酸化波形蛋白抗体，从而辅助诊断早期类风湿关节炎已是医疗领域的常规方法。然而现有的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体试剂盒中突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原多为市售或自制的突变型瓜氨酸化波形蛋白，而其制备工艺复杂，难以控制，制备出的突变型瓜氨酸化波形蛋白灵敏度、特异性较低，无法满足现阶段抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的检测需要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒及其应用，以解决现有技术存在的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体体外检测试剂灵敏度、特异性低的问题。本发明试剂盒采用三种不同特定序列的突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原与磁微粒偶联，进一步提高了检测结果的灵敏度、特异性。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

在一个方面，本发明提供了一种抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒，包括：突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒工作液，其由突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒和缓冲液组成；示踪物标记的抗体工作液；其由示踪物标记的抗人IgM抗体和稀释液组成；其中，所述突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒由突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒混合制得；所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒中突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1与磁微粒的终投料比为0.6ng/(个×mL)；所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒中突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1与所述磁微粒的终投料比为0.3ng/(个×mL)。

所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒中突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5与所述磁微粒的终投料比为0.3ng/(个×mL)。

与常用的市售突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原不同，本发明试剂盒采用由终投料比0.6ng/(个×mL)突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒、0.3ng/(个×mL)突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒、0.3ng/(个×mL)突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒和缓冲液混合，使得各抗原位点暴露更加充分，并且筛选了突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒的终投料比，经免疫血清学检测技术验证，与使用现有的市售突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原制备出的试剂盒相比，其抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测的灵敏度、特异性更强。

在一个实施方案中，在本发明的试剂盒中，所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1具有如SEQID No.2所示的氨基酸序列；所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5上均修饰有生物素。

因本发明申请中所使用的所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5的氨基酸长度均为17个氨基酸，在采用生物素修饰后，生物素的空间结构较小，不会影响多肽上抗原位点的暴露，也更利于多肽与磁性条码微粒的连接，提升了多肽、磁性条码微粒的利用率。若使用其他方式将多肽与磁性条码微粒连接，则会出现影响抗原表位暴露、多肽无法连接在磁性条码微粒上、多肽利用率低或磁性条码微粒利用率低的情况，进而严重影响试剂盒对抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测的灵敏度、特异性。

在一个实施方案中，所述磁微粒为磁性条码微粒，所述磁性条码微粒上修饰有链霉亲和素。

在一个优选实施方案中，所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒的结构为突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1-生物素-链霉亲和素-磁性条码微粒；所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒的结构为突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1-生物素-链霉亲和素-磁性条码微粒；所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒的结构为突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5-生物素-链霉亲和素-磁性条码微粒。

本申请中采用了先将不同的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽分别与不同的磁性条码微粒偶联，形成不用的突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒，再将不用的突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒以特定终投料比混合形式。较同时将不同的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽在同一液体内与磁性条码微粒偶联，磁性条码微粒上偶联的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽更加均匀，避免了在同一磁性条码微粒上偶联多种突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽时出现空间位阻较大、均匀性较差的情况，进一步提升了试剂盒检测结果的灵敏度、特异性。

在一个优选实施方案中，所述磷酸盐缓冲液中，述突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒工作液中所述突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒与所述缓冲液比例为1000个磁性条码微粒/mL缓冲液。

在一个优选实施方案中，所述缓冲液为1mg/mL牛血清白蛋白、0.05mg/mL氯化钠、0.01mg/mL吐温20、pH为7.0、浓度为0.05moL/L的磷酸盐缓冲液。

在一个的实施方案中所述示踪物为藻红蛋白，所述稀释液为0.2mg/mL牛血清白蛋白、0.1mg/mL氯化钠、0.1mg/mL蔗糖、0.1mg/mL proclin300、pH为6.5、浓度为0.1moL/L的磷酸盐缓冲液。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包括0值对照液、样本稀释液，所述0值对照液、样本稀释液为含有0.05mg/mL牛血清白蛋白、0.05mg/mL氯化钠、0.01mg/mL吐温20、pH为7.0、浓度为0.01moL/L的磷酸盐缓冲液。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒适于检测的样本包括全血、血清或血浆。

在另一个方面，本发明提供了所述试剂盒在用于非疾病诊断目的的体外抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

类风湿性关节炎患者血液中产生的突变型瓜氨酸化波形蛋白为具有针对于不同抗原表位的抗体混合物(多克隆抗体)。不同个体产生的抗体种类及抗体占比不同。人工合成的突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原/基因工程表达的抗原，仅有部分抗原决定簇充分暴露，使用单一抗原进行免疫学检验时极易造成漏检，导致灵敏度低。通过突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5联合使用，尽可能多的涵盖了特异有效的抗原表位。

本发明中提供的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒，采用以突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1与磁性条码微粒终投料比0.6ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1与磁性条码微粒终投料比0.3ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5与磁性条码微粒终投料比0.3ng/(个×mL)替代市售突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒，灵敏度为90.00％，特异性为90.20％，假阳性为9.80％，假阴性为10.00％；市售突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒以终投料比0.3ng/(个×mL)制备的试剂盒，假阳性29.41％，假阴性为30.00％，本发明中提供的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒较其假阳性、假阴性均降低了66.67％，效果显著。进一步提高了对不同患者血清的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测的灵敏度和特异性。

本申请选用的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5均含有不同的抗原决定簇，三个抗原的抗原决定簇与其对应抗体的结合速率常数恒定且各不相同，单个抗原的浓度水平信号值与信号值水平呈正相关，免疫检测方法学通过信号值与预先设定的临界值的比对来判断检测结果的阴阳性。三个抗原对在人群中抗体的检测存在互补关系。三个抗原在同时混合使用时的终投料比尤为重要。只有在将混合后的抗原检测结果调至信号值水平接近时，三个抗原阳性判定值接近，此时灵敏度、特异性最高。某个抗原浓度相对较低时，会导致仅有该抗原能检出的样本信号值低于临界点，误判为阴性，导致漏检，灵敏度下降。同理当某个抗原浓度相对较高，导致整体样本整体信号值拉高，临界点上移，误判为阳性，结果是错检，特异性下降。

本发明试剂盒适用广泛，尤其是将试剂盒用于全自动多重液相芯片免疫分析系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实验自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置校准曲线到测试软件，只需测试样本即可定性或定量检测样本中抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体，使检测更快速、更可靠、更稳定。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请中所述“突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒”指将突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原偶联至磁微粒上。所述突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原指可特异性识别并结合抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的物质，包括但不限于根据背景技术中描述方式制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽、市售的突变型瓜氨酸化波形蛋白。所述磁微粒指具有磁性的固相载体，包括但不限于磁珠、磁颗粒、磁性条码微粒，本实施例中所用磁微粒为磁性条码微粒。

本申请中所述“突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒”指将氨基酸序列如SEQ ID No.1所述的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联至磁微粒上。

本申请中所述“突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒”指将氨基酸序列如SEQ ID No.2所述的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联至磁微粒上。

本申请中所述“突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒”指将氨基酸序列如SEQ ID No.3所述的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联至磁微粒上。

本申请中所述“终投料比”指突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽与磁微粒偶联过程中形成的投料比。例如，突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1与磁微粒的终投料比为0.6ng/(个×mL)表示在单独制备突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒时，磁微粒与突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1的投料后两者真实反应的比例为1mL液体中含有0.6ng突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽与1个磁微粒，在将突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒混合后，根据比例调节单独制备突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1多肽偶联磁微粒的投料比、磁微粒加入量、缓冲液量，使得在进行突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒混合后，突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒工作液中突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒的投料比仍保持0.6ng/(个×mL)。

本申请中“突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1-生物素-链霉亲和素-磁性条码微粒”指修饰有生物素的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1与修饰有链霉亲和素的磁性条码微粒反应，生物素与链霉亲和素连接而形成的复合物。

1.原料：生物素化突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽。

本发明采用的突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原为突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、H1、G5。E1的氨基酸序列为SEQ ID No.1，H1的氨基酸序列为SEQ ID No.2，G5的氨基酸序列为SEQ ID No.3，其中氨基酸序列中的X为瓜氨酸Cit。突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5上均修饰有生物素。

SXPSSSXSYVTTSTXTY(SEQ ID No.1)。

TYSLGSALXPSTSXHLY(SEQ ID No.2)。

NASLAXLDLEXKVESLQ(SEQ ID No.3)。

2.制备链霉亲和素磁微粒工作液:

本实施例中所用磁微粒为偶联有链霉亲和素的磁性条码微粒。一个磁性条码微粒上具有多个条码区。将偶联有链霉亲和素的磁性条码微粒悬浮液中的磁性条码微粒进行磁性分离，获得磁性条码微粒。用pH为7.0、浓度为0.05moL/L的磷酸盐缓冲液将磁性条码微粒重悬至浓度为2×10

3.制备突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒：

将生物素化突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、H1、G5与链霉亲和素磁微粒工作液均分别按照1.25ng/(个×mL)、0.8ng/(个×mL)、0.6ng/(个×mL)、0.4ng/(个×mL)、0.3ng/(个×mL)、0.2ng/(个×mL)、0.125ng/(个×mL)终投料比包被，室温震荡2h后，磁分离吸附去上清，使用相同体积的上述pH为7.0、浓度为0.05moL/L的磷酸盐缓冲液清洗3次，制得突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒。

其中，1.25ng/(个×mL)表示平均1mL液中含有1.25ng生物素化突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽与1个链霉亲和素的磁性条码微粒，或平均1mL液中含有1个磁性条码微粒，磁性条码微粒上通过链霉亲和素偶联有1.25ng生物素化突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽。

使用含有2mg/mL的牛血清白蛋白、0.005mg/mL proclin 300、pH为0.7，浓度为0.05moL/L的磷酸盐缓冲液将制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒重悬封闭1h。

封闭完成后，使用pH为0.7，浓度为0.05moL/L的磷酸盐缓冲液重悬突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒至10

按照每个测试使用10

4.制备藻红蛋白标记的抗人IgG抗体工作液：

用含有0.2mg/mL牛血清白蛋白、0.1mg/mL氯化钠、0.1mg/mL蔗糖、0.1mg/mLproclin300、pH为6.5、浓度为0.1moL/L的磷酸盐缓冲液将藻红蛋白标记的抗人IgG抗体稀释到300ng/mL。

5.制备0值对照液、样本稀释液：

所述0值对照液、样本稀释液为含有0.05mg/mL牛血清白蛋白、0.05mg/mL氯化钠、0.01mg/mL吐温20、pH为7.0、浓度为0.01moL/L的磷酸盐缓冲液。

6.抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒配制。

抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒包括：突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒6.5mL/瓶、藻红蛋白标记的抗人IgG抗体3.5mL/瓶、0值对照工作液1.0mL/支分装后，组装在一起，保存于2-8℃。

在一个实施方案中，可以将待测样品、突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒混合孵育，再加入藻红蛋白标记的抗人IgG抗体工作液孵育。当样本中存在抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体时，则形成磁性条码微粒-链霉亲和素-生物素-突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽-抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体-抗人IgG抗体复合物，通过抗人IgG抗体上藻红蛋白、磁性条码微粒上的条码检测样本中的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体进行定性或定量分析。

一、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、H1、G5包被磁微粒投料比检测。

实验例1.1

本实施例采用的突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原为突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1。E1的氨基酸序列为SEQ ID No.1，其中氨基酸序列中的X为瓜氨酸Cit。突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1上修饰有生物素。

本实施例中所用磁微粒为偶联有链霉亲和素的磁性条码微粒。一个磁性条码微粒上具有多个条码区。将偶联有链霉亲和素的磁性条码微粒悬浮液中的磁性条码微粒进行磁性分离，获得磁性条码微粒。用pH为7.0、浓度为0.05moL/L的磷酸盐缓冲液将磁性条码微粒重悬至浓度为2×10

将生物素化突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1与链霉亲和素磁微粒工作液分别按照投料比1.25ng/(个×mL)、0.8ng/(个×mL)、0.6ng/(个×mL)、0.4ng/(个×mL)、0.3ng/(个×mL)、0.2ng/(个×mL)、0.125ng/(个×mL)浓度包被，室温震荡2h后，磁分离吸附去上清，使用相同体积的上述pH为7.0、浓度为0.05moL/L的磷酸盐缓冲液清洗3次，制得突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒。

其中，1.25ng/(个×mL)表示平均1mL液中含有1.25ng生物素化突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽与1个链霉亲和素的磁性条码微粒，或平均1mL液中含有1个磁性条码微粒，其上通过链霉亲和素偶联有1.25ng生物素化突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽。

使用含有2mg/mL的牛血清白蛋白、0.005mg/mLproclin 300、pH为0.7，浓度为0.05moL/L的磷酸盐缓冲液将制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒重悬封闭1h。

封闭完成后，使用pH为0.7，浓度为0.05moL/L的磷酸盐缓冲液重悬突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒至10

按照每个测试使用10

用含有0.2mg/mL牛血清白蛋白、0.1mg/mL氯化钠、0.1mg/mL蔗糖、0.1mg/mLproclin300、pH为6.5、浓度为0.1moL/L的磷酸盐缓冲液将藻红蛋白标记的抗人IgG抗体稀释到300ng/mL。

制备0值对照液、样本稀释液，其为含有0.05mg/mL牛血清白蛋白、0.05mg/mL氯化钠、0.01mg/mL吐温20、pH为7.0、浓度为0.01moL/L的磷酸盐缓冲液。

抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒包括：突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒6.5mL/瓶、藻红蛋白标记的抗人IgG抗体3.5mL/瓶、0值对照工作液1.0mL/支分装后，组装在一起，保存于2-8℃。

使用上述制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒检测0值样本、10例患有类风湿性关节炎并血液中含有抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的阳性样本、10例未患有类风湿性关节炎的阴性样本，通过珠海丽珠试剂股份有限公司MCLIA-800全自动多重液相芯片免疫分析系统进行检测。检测过程如下：

第一步：MCLIA-800全自动多重液相芯片免疫分析系统吸取样本15μL后自动稀释13倍。

第二步：取稀释后的样本50μL，加入100μL突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒，37℃孵育15min，孵育后磁分离，清洗3次。

第三步：加入50μL藻红蛋白标记的抗人IgG抗体，37℃孵育15min，孵育后磁分离，清洗3次。

第四步：加入150μL信号增强液，读取信号值，计算信噪比，抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体测试结果如表1所示。

实验例1.2

突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原为突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1。H1的氨基酸序列为SEQ ID No.2，其中氨基酸序列中的X为瓜氨酸Cit。其余条件与实验例1相同，抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体测试结果如表2所示。

实验例1.3

突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原为突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5。H1的氨基酸序列为SEQ ID No.3，其中氨基酸序列中的X为瓜氨酸Cit。其余条件与实验例1相同，抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体测试结果如表3所示。

对比例1

突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原为市售突变型瓜氨酸化波形蛋白。其余条件与实验例1相同，抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体测试结果如表4所示。

表1.实验例1.1突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1包被磁微粒终投料比检测

表2.实验例1.2突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1包被磁微粒终投料比检测

表3.实验例1.3突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5包被磁微粒终投料比检测

表4.对比例1市售突变型瓜氨酸化波形蛋白包被磁微粒投料比检测

结果分析:

因生物素修饰的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽与链霉亲和素修饰的磁性条码微粒之间存在解离平衡，且因为磁性条码微粒与突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽之间不能始终保持充分接触，因此会出现磁性条码微粒上偶联突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽不均匀、数目差别较大的情况，因此只能在偶联过程解离后计算偶联时的缓冲液中存在的氨基酸量，从而计算出结合在磁性条码微粒上的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽量，在忽略少数磁性条码微粒上偶联突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽较少的情况，计算出的平均突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽、磁性条码微粒、缓冲液的比例，是表示突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽偶联磁微粒上抗原偶联量的唯一标准。

根据信噪比、信号值综合判断，阳性样本信噪比越高且阴性样本信噪比越低，效果越好。

由表1可知突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1包被磁微粒的最佳抗原、磁微粒投料比为0.6ng/(个×mL)，阳性样本的信噪比为6.84，阴性样本的信噪比为1.67。使用抗原、磁微粒投料比上限为0.8ng/(个×mL)，下限为0.4ng/(个×mL)。

由表2可知突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1包被磁微粒的最佳抗原、磁微粒投料比为0.3ng/(个×mL)，阳性样本的信噪比为7.01，阴性样本的信噪比为1.65。使用抗原、磁微粒投料比上限为0.4ng/(个×mL)，下限为0.2ng/(个×mL)。

由表3可知突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5包被磁微粒的最佳抗原、磁微粒投料比为0.3ng/(个×mL)，阳性样本的信噪比为6.90，阴性样本的信噪比为1.64。使用抗原、磁微粒投料比上限为0.4ng/(个×mL)，下限为0.2ng/(个×mL)。

由表4可知市售突变型瓜氨酸化波形蛋白包被磁微粒的最佳抗原、磁微粒投料比为0.3ng/(个×mL)，阳性样本的信噪比为4.07，阴性样本的信噪比为1.83。使用抗原、磁微粒投料比上限为0.4ng/(个×mL)，下限为0.2ng/(个×mL)。市售突变型瓜氨酸化波形蛋白的最佳阳性样本的信噪比低于突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5的最差阳性样本的信噪比，表明市售突变型瓜氨酸化波形蛋白的对抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的检测性能低于突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1或突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5。

二、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽偶联磁微粒混合投料比例检测

实验例2.1

将实验例1.1中的制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒以投料比为0.6ng/(个×mL)用于制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒。其余条件与实验例1.1相同，使用制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体试剂盒检测50例阳性样本、51例阴性样本，并根据检测结果计算灵敏度、特异性，测试结果如表5所示。

实验例2.2

将实验例1.2中的制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒以投料比为0.3ng/(个×mL)用于制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒。其余条件与实验例1.1相同，使用制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体试剂盒检测50例阳性样本、51例阴性样本，并根据检测结果计算灵敏度、特异性，测试结果如表6所示。

实验例2.3

将实验例1.3中的制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒以投料比为0.3ng/(个×mL)用于制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒。其余条件与实验例1.1相同，使用制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体试剂盒检测50例阳性样本、51例阴性样本，并根据检测结果计算灵敏度、特异性，测试结果如表7所示。

实验例2.4

将实验例1.1中的制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒以终投料比为0.6ng/(个×mL)、实验例1.2中制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒以终投料比为0.3ng/(个×mL)混合，制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒。其余条件与实验例1.1相同，使用制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒检测50例阳性样本、51例阴性样本，并根据检测结果计算灵敏度、特异性，测试结果如表8所示。

实验例2.5

将实验例1.1中的制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒以终投料比为0.6ng/(个×mL)、实验例1.3中制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒以终投料比为0.3ng/(个×mL)混合，制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒。其余条件与实验例1.1相同，使用制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒检测50例阳性样本、51例阴性样本，并根据检测结果计算灵敏度、特异性，测试结果如表9所示。

实验例2.6

将实验例1.2中制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒以终投料比为0.3ng/(个×mL)、实验例1.3中制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒以终投料比为0.3ng/(个×mL)混合，制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒。其余条件与实验例1.1相同，使用制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒检测50例阳性样本、51例阴性样本，并根据检测结果计算灵敏度、特异性，测试结果如表10所示。

实施例1

将实验例1.1中的制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒以终投料比为0.6ng/(个×mL)、实验例1.2中制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒以终投料比为0.3ng/(个×mL)、实验例1.3中制备的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒以终投料比为0.3ng/(个×mL)混合，制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒。其余条件与实验例1.1相同，使用制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒检测50例阳性样本、51例阴性样本，并根据检测结果计算灵敏度、特异性，测试结果如表11所示。

对比例2

将实验例1.4中的制备的市售突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒以投料比为0.3ng/(个×mL)用于制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒。其余条件与实验例1.1相同，使用制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体试剂盒检测50例阳性样本、51例阴性样本，并根据检测结果计算灵敏度、特异性，测试结果如表12所示。

其中，八种试剂盒对50例阳性样本的检测结果如表13所示，八种试剂盒对50例阴性样本的检测结果如表14所示，各试剂盒的灵敏度、特异性、假阳性、假阴性结果如表15所示。

表5.突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1灵敏度、特异性测试

表6.突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1灵敏度、特异性测试

表7.突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5灵敏度、特异性测试

表8.突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1+H1灵敏度、特异性测试

表9.突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1+G5灵敏度、特异性测试

表10.突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1+G5灵敏度、特异性测试

表11.突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1+E1+G5灵敏度、特异性测试

表12.突变型瓜氨酸化波形蛋白灵敏度、特异性测试

表13.八个试剂盒阳性测试结果

表14.八个试剂盒阴性测试结果

表15.八个试剂盒灵敏度、特异性、假阳性、假阴性测试结果

结果分析：

由表15内数据可得，突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1偶联磁微粒以终投料比0.6ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1偶联磁微粒以终投料比0.3ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5偶联磁微粒以终投料比0.3ng/(个×mL)混合制备的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒的灵敏度和特异性均优于市售突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒以投料比为0.3ng/(个×mL)用于制备抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒，假阴性由30.00％降至10.00％，降低了66.7％；假阳性由29.41％降至10.00％，降低了66.0％，灵敏度与特异性有较大提升。

发明人推测：类风湿性关节炎患者血液中产生的突变型瓜氨酸化波形蛋白为具有针对于不同抗原表位的抗体混合物(多克隆抗体)。不同个体产生的抗体种类及抗体占比不同。人工合成的突变型瓜氨酸化波形蛋白抗原/基因工程表达的抗原，仅有部分抗原决定簇充分暴露，使用单一抗原进行免疫学检验时极易造成漏检，导致灵敏度低。通过突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5联合使用，尽可能多的涵盖了特异有效的抗原表位。

联合使用突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5的灵敏度最高、特异性最强，且保持特异性在90％以上，此时三种抗原的终投料比分别是突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1与磁性条码微粒0.6ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1与磁性条码微粒0.3ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5与磁性条码微粒0.3ng/(个×mL)。

因本发明申请中所使用的所述突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5的氨基酸长度均为17个氨基酸，在采用生物素修饰后，生物素的空间结构较小，不会影响多肽上抗原位点的暴露，也更利于多肽与磁性条码微粒的连接，提升了多肽、磁性条码微粒的利用率。若使用其他方式将多肽与磁性条码微粒连接，则会出现影响抗原表位暴露、多肽无法连接在磁性条码微粒上、多肽利用率低或磁性条码微粒利用率低的情况，进而严重影响试剂盒对抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测的灵敏度、特异性。

本申请中采用了先将不同的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽分别与不同的磁性条码微粒偶联，形成不用的突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒，再将不用的突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒以特定终投料比混合形式。较同时将不同的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽在同一液体内与磁性条码微粒偶联，磁性条码微粒上偶联的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽更加均匀，避免了在同一磁性条码微粒上偶联多种突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽时出现空间位阻较大、均匀性较差的情况，进一步提升了试剂盒检测结果的灵敏度、特异性。

三、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、H1、G5与磁微粒终投料比筛选

对比例3

将突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1与磁性条码微粒终投料比、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1与磁性条码微粒终投料比、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5与磁性条码微粒终投料比按照表16中所表述的序号1-9组合进行正交实验，其余过程与实施例1相同。序号1-9组合对应的灵敏度、特异性检测结果如表17-26所示。

表16.突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、H1、G5与磁性条码微粒终投料比实验表

表17.对比例3组1灵敏度、特异性测试

表18.对比例3组2灵敏度、特异性测试

表19.对比例3组3灵敏度、特异性测试

表20.对比例3组4灵敏度、特异性测试

表21.对比例3组5灵敏度、特异性测试

表22.对比例3组6灵敏度、特异性测试

表23.对比例3组7灵敏度、特异性测试

表24.对比例3组8灵敏度、特异性测试

表25.对比例3组9灵敏度、特异性测试

表26.突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1+H1+G5混合抗原不同终投料比灵敏度、特异性测试结果

结果分析：

表26中，组1、组3、组4中，因突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5中因一种或多种多肽的投料比过高而出现了假阳性结果的叠加，导致最终检测结果的特异性低于90％，假阳性出现了不同程度的提升。

组5、组7、组9中，因突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5中因一种或多种多肽的投料比过低而出现了假阴性结果的叠加，导致最终检测结果的灵敏度低于90％，假阴性出现了不同程度的提升。

组2、组6、组8中，因突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5中因一种或多种多肽的投料比较高，或较低，导致了特异性低于90％，且假阳性提升近100％以上。

发明人推测：本申请选用的突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5均含有不同的抗原决定簇，三个抗原的抗原决定簇与其对应抗体的结合速率常数恒定且各不相同，单个抗原的浓度水平信号值与信号值水平呈正相关，免疫检测方法学通过信号值与预先设定的临界值的比对来判断检测结果的阴阳性。三个抗原对在人群中抗体的检测存在互补关系。三个抗原在同时混合使用时的终投料比尤为重要。只有在将混合后的抗原检测结果调至信号值水平接近时，三个抗原阳性判定值接近，此时灵敏度、特异性最高。某个抗原浓度相对较低时，会导致仅有该抗原能检出的样本信号值低于临界点，误判为阴性，导致漏检，灵敏度下降。同理当某个抗原浓度相对较高，导致整体样本整体信号值拉高，临界点上移，误判为阳性，结果是错检，特异性下降。

综合表15与表26可知以突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1与磁性条码微粒终投料比0.6ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1与磁性条码微粒终投料比0.3ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5与磁性条码微粒终投料比0.3ng/(个×mL)为最优组合，此时对抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测的灵敏度和特异性最高，灵敏度为90.00％，特异性为90.20％，假阳性为9.80％，假阴性为10.00％；较市售突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒以终投料比0.3ng/(个×mL)，假阳性29.41％，假阴性为30.00％，假阳性、假阴性均降低了66.67％，效果显著。

本发明利用以突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽E1与磁性条码微粒终投料比0.6ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽H1与磁性条码微粒终投料比0.3ng/(个×mL)、突变型瓜氨酸化波形蛋白多肽G5与磁性条码微粒终投料比0.3ng/(个×mL)替代市售突变型瓜氨酸化波形蛋白偶联磁微粒，进一步提高了对不同患者血清的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测的灵敏度和特异性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海丽珠试剂股份有限公司

<120> 抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒及其应用

<130> 20220427

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 1

Ser Xaa Pro Ser Ser Ser Xaa Ser Tyr Val Thr Thr Ser Thr Xaa Thr

1 5 10 15

Tyr

<210> 2

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<220>

<221> misc_feature

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<220>

<221> misc_feature

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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