一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽、制备方法及其应用

摘要

本发明提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽、制备方法及其应用，本发明提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，该杂合抗菌肽能够解决瓦氏黄颡鱼鱼苗抗菌力差以及存活率低的技术问题。本发明还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，该方法采用瓦氏黄颡鱼头肾组织中的抗菌肽Hepcidin和β‑defensin为母肽进行合成，该方法步骤简单、容易操作，方便瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的批量生产。接着，本发明提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽在提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率中的应用，最后，本发明提供了一种提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率的制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽、制备方法及其应用。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是在外界条件刺激下，动物免疫系统产生的一类对抗外源性病原体侵袭的防御性活性肽类物质，是动物非特异性免疫防御系统的重要组成部分，能够通过“溶解性”破坏或“离子”造孔来防御多种细菌、真菌、病毒及其他病原生物的感染。近年来，抗菌肽作为一种新型的高效抗菌药物，由于其具有分子量小、水溶性好、稳定性强、耐酸碱、抗菌谱广且作用机制特别，不易产生耐药性等优点，成为新型抗生素替代品开发的良好候选资源。

虽然目前已经有两千多种抗菌肽被鉴定或研究，但是大多数天然抗菌肽都表现出活性较低、不稳定、具有一定的细胞毒性和产量低等缺点。随着对抗菌肽作用机制、分子结构与功能关系等研究的逐步深入，人们在发掘新抗菌肽的同时，更注重寻找高效、广谱、稳定、低毒、肽链较短的抗菌肽，其中杂合肽即为一类这样的新型抗菌肽。

瓦氏黄颡鱼(学名：Pelteobagrus vachelli)是鲿科、黄颡鱼属一种常见的淡水鱼，由于其具有肉质鲜美、营养丰富、生长迅速和抗病力强等特点，受到广大消费者、养殖户和科研工作者的青睐，逐渐成为一种用于遗传育种、营养饲料和疾病防控研究的模式试验鱼类。然而随着养殖密度的提高，养殖水环境恶化，导致瓦氏黄颡鱼的疾病频繁爆发，特别是细菌性疾病危害最大。因此，开展瓦氏黄颡鱼抗菌肽的系统研究，对瓦氏黄颡鱼抗病机制阐述、抗病新品种培育及其抗菌肽产品开发具有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，该杂合抗菌肽能够解决瓦氏黄颡鱼鱼苗抗菌力差以及存活率低的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，该方法采用瓦氏黄颡鱼头肾组织中的抗菌肽Hepcidin和β-defensin为母肽进行合成，该方法步骤简单、容易操作，方便瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的批量生产。

本发明的第三目的在于提供一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽在提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率的制剂。

首先，本发明提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，该杂合抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽能够有效提高瓦氏黄颡鱼对于病菌的抗病能力，从而提高瓦氏黄颡鱼鱼苗的存活率。

其次，本发明还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：去掉瓦氏黄颡鱼抗菌肽β-defencin的第1-20个氨基酸和第47-49个氨基酸、删除第36位和第42位的半胱氨酸、将第23位的异亮氨酸替换为赖氨酸以及将第28位的谷氨酸替换为精氨酸，得到dcBD1，dcBD1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；删除瓦氏黄颡鱼抗菌肽Hepcidin的α螺旋两端的多余序列并保留第8-17个氨基酸区段，得到dcHEP2，dcHEP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；将dcBD1与dcHEP2组合，得到dcBD1-HEP2，即得到瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽。该方法通过条件优化，获得高产、无毒、高活性的杂合抗菌肽产物，此外该方法简单方便容易操作，能够便于该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽得到大批量生产。

接着，本发明还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽在提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率中的应用。

最后，本发明还提供了一种提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活力的制剂。

与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点与积极效果：

一、本发明提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽能够有效提高瓦氏黄颡鱼对于病菌的抗病能力，从而提高瓦氏黄颡鱼鱼苗的存活率。

二、本发明还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，该方法通过条件优化，获得高产、无毒、高活性的杂合抗菌肽产物，此外该方法简单方便容易操作，能够便于该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽得到大批量生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中PCR扩增结果图；

图2为本发明实施例中信号肽分析结果图；

图3为本发明实施例中跨膜区分析结果图；

图4为本发明实施例中hepcidin核酸序列及氨基酸序列功能位点分析结果；

图5为本发明实施例中β-defensin核酸序列及氨基酸序列功能位点分析；

图6为本发明实施例中hepcidin氨基酸序列同源性比对结果；

图7为本发明实施例中β-defensin氨基酸序列同源性比对结果；

图8为本发明实施例中瓦氏黄颡鱼hepcidin氨基酸序列的系统进化树分析；

图9为本发明实施例中瓦氏黄颡鱼β-defensin氨基酸序列的系统进化树分析；

图10为本发明实施例中瓦氏黄颡鱼hepcidin基因结构示意图；

图11为本发明实施例中瓦氏黄颡鱼β-defensin基因结构示意图；

图12为本发明实施例中两种抗菌肽氨基酸序列3D结构预测图，其中A为hepcidin，B为β-defensin；

图13为本发明实施例中杂合抗菌肽氨基酸序列分析结果；

图14为本发明实施例中杂合抗菌肽的溶血性分析；

图15为本发明实施例中重组载体的酶切鉴定结果；

图16为本发明实施例中杂合抗菌肽毕赤酵母表达鉴定；

图17为本发明试验例中毕赤酵母表达杂合抗菌肽抑菌动力学分析；

图18为本发明试验例中毕赤酵母表达的杂合抗菌肽溶血率分析；

图19为本发明试验例中发病鱼塘及发病鱼症状。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

首先，本发明提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽，该杂合抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽能够有效提高瓦氏黄颡鱼对于病菌的抗病能力，从而提高瓦氏黄颡鱼鱼苗的存活率。

其次，本发明还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：去掉瓦氏黄颡鱼抗菌肽β-defencin的第1-20个氨基酸和第47-49个氨基酸、删除第36位和第42位的半胱氨酸、将第23位的异亮氨酸替换为赖氨酸以及将第28位的谷氨酸替换为精氨酸，得到dcBD1，dcBD1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；删除瓦氏黄颡鱼抗菌肽Hepcidin的α螺旋两端的多余序列并保留第8-17个氨基酸区段，得到dcHEP2，dcHEP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；将dcBD1与dcHEP2组合，得到dcBD1-HEP2，即得到瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽。该方法通过条件优化，获得高产、无毒、高活性的杂合抗菌肽产物，此外该方法简单方便容易操作，能够便于该瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽得到大批量生产。

上述瓦氏黄颡鱼抗菌肽β-defencin和瓦氏黄颡鱼抗菌肽Hepcidin的制备包括如下步骤：以斑点叉尾鮰抗菌肽Hepcidin和β-defensin为参考序列并用瓦氏黄颡鱼头肾转录组数据作为对比，设计得到Hepcidin引物对和β-defensin引物对；提取瓦氏黄颡鱼头肾组织中的RNA并反转录为cDNA，将Hepcidin引物对和β-defensin引物对分别与cDNA混合进行PCR扩增并纯化，得到纯化产物，将纯化产物连接入克隆载体并转化至DH5α感受态细胞中后经AMP抗性平板筛选并进行菌落PCR鉴定，将鉴定阳性的菌落进行扩大培养并提取质粒后测序，即得到瓦氏黄颡鱼抗菌肽β-defencin和瓦氏黄颡鱼抗菌肽Hepcidin的核苷酸序列，将核酸序列翻译成氨基酸序列，瓦氏黄颡鱼抗菌肽β-defencin的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，瓦氏黄颡鱼抗菌肽Hepcidin的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

最后，本发明还提供了一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽在提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率中的应用。

上述应用包括如下步骤：将瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽按酵母表达的氨基酸序列进行密码子优化后得到优化序列，针对优化序列设计引物对，将优化序列依次PCR扩增、胶回收和双酶切后得到待接片段，将待接片段与毕赤酵母表达载体连接，得到杂合肽毕赤酵母表达载体，将杂合肽毕赤酵母表达载体转入瓦氏黄颡鱼进行表达。

上述优化序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物对中下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

上述毕赤酵母表达载体为pPICZαA载体。

上述待接片段与毕赤酵母载体连接后还包括线性化步骤，线性化包括如下步骤：将待接片段与毕赤酵母载体连接后得到表达载体，用SacI酶切表达载体后转入毕赤酵母表达菌株X33中，得到阳性菌落。

上述得到阳性菌落后还包括诱导步骤，诱导包括如下步骤：用甲醇对阳性菌落诱导表达。

一种提高瓦氏黄颡鱼抗菌力和存活率的制剂，包括上述的瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽。

实施例

根据斑点叉尾鮰已经报道的抗菌肽Hepcidin(NP_001188323)和β-defensin(NP_001352159.1)氨基酸序列作为参考序列，利用瓦氏黄颡鱼头肾转录组数(NCBI基因登录号：SRR14306653-SRR14306667)，采用BioEdite 7.0进行本地比对，获得相关抗菌肽的转录本，然后进行ORF分析，获得相关基因的疑似CDS区域，并采用Oligo6.0软件在CDS区域两端设计多对检测引物Hepcidin-F、Hepcidin-R、β-defensin-F和β-defensin-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9-12所示，用于相关基因扩增(见序列表)。经PCR扩增验证后，最终获得相关基因的扩增引物序列。

1.2瓦氏黄颡鱼抗菌肽基因PCR扩增及基因克隆

采集瓦氏黄颡鱼新鲜头肾组织，按照常规的方法提取RNA并反转录为cDNA。根据以下反应条件和反应体系进行PCR扩增(见表1和表2)。PCR扩增后采用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，条带大小与预期一致后进行PCR产物纯化。将纯化的PCR产物与克隆载体pGM-TSimple Vector进行连接，然后将连接产物转换至DH5α感受态细胞中，经AMP抗性平板筛选后再进行菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定正确后提取质粒送生工生物科技有限公司进行测序。结果显示，PCR扩增片段均与预期片段一致，Hepcidin和β-defensin基因扩增片段长度分别为712bp和393bp(见图1)，图1中，A、B，M为Marker DL200；A，1为Hepcidin基因扩增结果；B，1为阴性对照，2为β-defensin。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应条件

1.3瓦氏黄颡鱼抗菌肽基因生物信息学分析

1.3.1信号肽和跨膜区分析

将测得的瓦氏黄颡鱼抗菌肽核酸序列利用Lasergene软件(DNAStar,USA)分析序列中开放性阅读框(open reading frame,ORF)，并演绎出氨基酸序列；肽链中信号肽切割位点使用SignalP5.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行分析，跨膜区域使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对两种抗菌肽的氨基酸序列分析。结果显示，Hepcidin和β-defensin两个抗菌肽均在N端具有一个信号肽切割位点，分别位于23-24和25-26氨基酸之间(见图2)，其中A为Hepcidin氨基酸序列；B为β-defensin氨基酸序列。跨膜区预测结果显示，仅β-defensin有跨膜区域，跨膜的蛋白位于第13-第35个氨基酸残基，细胞内的蛋白位于第1-第12个氨基酸残基，细胞内的蛋白位于第36-第74个氨基酸残基(见图3)，其中A为Hepcidin氨基酸序列；B为β-defensin氨基酸序列。

1.3.2抗菌肽基因序列功能位点分析

将测序所得抗菌肽核酸序列翻译为氨基酸序列，根据已报到相关抗菌肽功能位点进行分析。结果显示，hepcidin基因CDS区共282bp，编码93个氨基酸，其中N端前23个氨基酸为信号肽序列，第65号到68号RTKR序列为前体肽转化酶识别基序，预测第69号到93号氨基酸残基为成熟肽序列，成熟肽长25个氨基酸残基(图4)，图4中方框内氨基酸序列为信号肽序列；23号丙氨酸与24号丙氨酸之间为信号肽切割位置；hepcidin功能域氨基酸用下划线标注，其中虚线标注的RTKR序列为前体肽转化酶识别基序，hepcidin成熟肽区域氨基酸使用双划线标注，序列中8个保守性的半胱氨酸残基用灰色阴影标出；﹡表示为终止子；β-defensin基因CDS区共225bp，编码75个氨基酸，其中N端前25个氨基酸为信号肽序列，成熟肽为50个氨基酸，跨膜的蛋白位于第13-35个氨基酸残基(图5)，图5中信号肽用方框表示；其保守的半胱氨酸残用灰色阴影表示；起始密码子和终止密码子用下划线表示；翻译得到的氨基酸中终止密码子用*表示。

1.3.3多序列同源比对分析

使用NCBI中blastp工具进行不同物种间抗菌肽同源氨基酸序列比对，然后用Clustal Omega进行多序列比对，比对结果得出在不同物种各抗菌肽氨基酸序列保守情况。结果显示，不同物种中hepcidin氨基酸序列数目相似

1.3.4系统进化树分析

使用NCBI中blastp工具进行不同物种间抗菌肽同源氨基酸序列比对，下载相应同源序列，采用Mega软件，基于Neighbour-Joining法构建系统进化树。结果显示，瓦氏黄颡鱼的hepcidin序列与黄颡鱼该序列位于进化树同一下小枝，辐鳍鱼纲内鱼类位于进化树同一分支上，而腔棘鱼纲中的西印度洋矛尾鱼进化树位置则与两栖类动物相接近，哺乳类动物独自聚于一枝(见图8)；β-defensin进化树共分为2个大的分支，分别为鱼类β-defensin1，鱼类β-defensin 2和3，禽类和哺乳类，鱼类β-defensin1聚为一大支，硬骨鱼和软骨鱼分为两支，瓦氏瓦氏黄颡鱼β-defensin位于β-defensin1分枝中，与虹鳟β-defensin1最为接近，进一步说明β-defensin属于β-defensin家族成员，且属于β-defensin1型(见图9)。

1.3.5基因结构分析

使用NCBI中blastn工具检索黄颡鱼(基因登录号REGT01000155.1；P.fulvidraco)全基因组序列，分别与瓦氏黄颡鱼的抗菌肽克隆的cDNA序列进行比对，绘制出基因结构图。瓦氏黄颡鱼hepcidin基因内含2个内含子(分别为728bp与84bp)，3个外显子(分别为198bp、97bp和423bp)，其中外显子1、3的一部分与外显子2组成了CDS区域，外显子1、3还转录出一部分非翻译区，5′UTR(102bp)与3′UTR(322bp)(见图10)；完整β-defensin基因含有三个外显子，分别长123bp、53bp、47bp，两个内含子，分别为100bp、139bp，一个非编码区(UTR)为134bp，本实验只扩增出了3’端的UTR区，5’端的UTR区暂时未扩增到(见图11)。

1.3.6三级结构分析

根据推导的瓦氏黄颡鱼两种抗菌肽氨基酸序列，使用网络工具CPHmodels online3.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/)进行序列比对，同时将获得的数据通过PyMOL Molecular Graphics System软件(http://www.pymol.org/)进行可视化处理得到3D视图。结果显示，瓦氏黄颡鱼hepcidin 3D结构成熟肽区域具有一个α螺旋结构(见图12A)；β-defensin3D结构包含了6个保守的Cys形成3个分子二硫键，共同形成两个β折叠，一个α螺旋(见图12B)，图中A和B分别为hepcidin和β-defensin。

1.4瓦氏黄颡鱼杂合肽设计及抗菌活性分析

1.4.1瓦氏黄颡鱼杂合肽设计及分析

杂合肽的设计主要是通过将两种抗菌肽进行截断、氨基酸替换、氨基酸增减后组合成新的抗菌肽，通过改变抗菌肽长度、疏水性、净电荷数等方式来提高杂合肽的抗菌能力和稳定性，降低杂合肽的溶血性。以瓦氏黄颡鱼抗菌肽β-defencin(dcBD)和Hepcidin(dcHEP)氨基酸序列作为母肽，进行改造。根据之前的报道显示，β-defencin的活性并不需要三对二硫键，参考人的β-defencin的改造方法对瓦氏黄颡鱼的β-defencin进行改造。其中dcBD成熟肽一共有49个氨基酸，去掉第1-20个氨基酸和第47-49个氨基酸，删除第36和第42位的半胱氨酸只保留两个半胱氨酸，第23位异亮氨酸(I)替换为赖氨酸(K)，第28位谷氨酸(E)替换为精氨酸(R)，改造后的dcBD1氨基酸长度为24个氨基酸，净电荷和疏水性均比母肽有所提高。dcHEP删除了α-螺旋两段的多余序列，dcHEP1保留了其第8-24个氨基酸区域，dcHEP2保留了其第8-17个氨基酸区域，片段较母肽都进行了缩减。然后将改造后的dcBD1与dcHEP1和dcHEP2进行组合，最终分别形成两个新的杂合肽dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2。

采用在线分析软件ExPASy(https://www.expasy.org/resources/protparam)和APD3(https://aps.unmc.edu/)对杂合肽的理化性质进行了分析；利用HeliQuest(http://lbqp.unb.br/NetWheels/)进行螺旋轮分析；利用I-TASSER(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)进行二级结构和三级结构的分析。结果显示：dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2的平均亲水指数分别为-0.033和-0.183，均比原来的肽段降低；而疏水性分别为1.78和2.8，均比原来的肽段增加，净电荷数分别为+8.25和+7.25均比原来的肽段增加(见表3)。二级结构和三级结构分析显示，dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2二级结构和三级结构均相似，只是dcBD1-HEP2的C端更短(见图13A、B、C、D)。螺旋轮分析结果显示，由于dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2的阿尔法螺旋一致，亲水性氨基酸和疏水性氨基酸数量相近，因此均在C端具有一个两亲性螺旋结构(见图13E和F)，图中A、C分别为dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2的二级结构分析，其中H表示螺旋，S表示线型，C表示卷曲。B、D分别为dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2的三级结构分析。E、F分别为dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2的螺旋轮分析，其中红色表示带正电荷极性氨基酸，绿色代表不带电荷极性氨基酸，黄色代表非极性氨基酸。

表3抗菌肽理化性质分析

1.4.2杂合肽序列合成

将设计的两个杂合肽dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2氨基酸序列送生工生物科技有限公司进行合成，合成时对C端进行酰胺化处理。

1.4.3杂合肽抗菌活性分析

参考前面的方法，分别选取大肠杆菌代表革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌代表革兰氏阳性菌，嗜水气单胞菌作为水产动物病原菌进行最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定。两种杂合肽对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC一致，均分别为12.5μg/ml和50μg/ml；而dcBD1-HEP2对大肠杆菌和嗜水气单胞菌的MIC和MBC均低于dcBD1-HEP1，其中对大肠杆菌的MIC和MBC最低，分别为3.125μg/ml和25μg/ml(见表4)。说明dcBD1-HEP2具有更好的抗菌活性。

表4两种杂合肽的MIC与MBC(μg/ml)

1.4.4杂合肽溶血性分析

本试验选用4％的兔血红细胞测定多肽的溶血活性，溶血率＜5％认为没有溶血活性。选择不同终浓度的dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2分别作用于兔血红细胞1h后，OD540测定吸光值并计算溶血率。溶血率(％)＝(A实验组-A阴性对照组)/(A阳性对照组-A阴性对照组)×100％。结果显示，dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2均在浓度为32μg/ml以下时溶血率小于5％，随着浓度升高，两个杂合肽溶血性都增强，其中dcBD1-HEP2溶血性均高于dcBD1-HEP1，而且当dcBD1-HEP2浓度为256μg/ml时，溶血率达到30.48％(见图14)。说明dcBD1-HEP2溶血性高于dcBD1-HEP1，但是64μg/ml以下的浓度差异较小。

1.4.5杂合肽酵母分泌性表达

1.4.5.1杂合肽密码子优化

根据抗菌活性实验和溶血性实验结果，选取dcBD1-HEP2进行酵母表达。酵母表达氨基酸序列为：RPKCLPTRLPFGPFASKGFVCVSHCRYCCNCCKNKHHHHHH，C端加入6个组氨酸标签便于蛋白纯化。

采用在线分析软件JAVA codon adaption tool(JCAT,http://www.jcat.de/Start.jsp)对进行酵母表达的氨基酸序列进行密码子优化，密码子适配指数值(CodonAdaptation Index value，CAI-value)为0.918，说明具有较好的适配性，优化序列123bp，共41个氨基酸，约4.8KDa，结果见SEQ ID NO.7，其中组氨酸标签序列为CACCACCACCACCACCACTAA。

1.4.5.2杂合肽引物设计

将序列送生工生物科技有限公司进行人工合成。根据优化后的序列片段，采用oligo6.0个primer5.0软件设计引物，分别在上游和下游引物添加酶切位点EcoR I和XbaI，同时添加起始密码ATG和终止密码子TAA。上游引物为P1，核苷酸序列如SEQ ID NO.8，其中酶切位点序列为GAATTC，下游引物为P2，核苷酸序列如SEQ ID NO.9，其中酶切位点序列为GCTCTAGA。

1.4.5.3杂合肽毕赤酵母表达载体构建

经过PCR扩增、胶回收和双酶切后得到dcBD1-HEP2基因片段，同时将酶切好的真核表达载体pPICZαA进行链接，得到毕赤酵母表达载体pPICZαA-dcBD1-HEP2，随后将pPICZαA-dcBD1-HEP2载体进行单双酶切，单酶切片段大小约4.0kb，双酶切片段载体部分约3.5kb，目的基因约120bp(如图15)，图中M1，DNA marker DL2000；M2，DNA marker DL10000；1，为PCR扩增产物dcBD1-HEP2(约120bp)；2，为SacI单酶切的pPICZαA-dcBD1-HEP2；3，EcoRI和XbaI双酶切后的pPICZαA-dcBD1-HEP2。随后用SacI酶切载体进行线性化，将线性化载体片段电转化入毕赤酵母表达菌株X33中，通过PCR对长出的阳性菌落进行鉴定，然后挑选10个具有较强阳性信号的菌落进行诱导表达。

试验例1

杂合肽毕赤酵母表达及纯化：

将PCR鉴定为阳性的克隆子进行甲醇诱导表达后，收集上清进行SDS-PAGE分析。结果显示，10个克隆子均有不同程度表达，选择表达量最高的克隆子进行大量表达，并收集上清通过Ni

试验例2

毕赤酵母表达杂合肽抗菌活性分析：

参考前面的方法，分别选取大肠杆菌代表革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌代表革兰氏阳性菌，水产动物致病菌嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、拟态弧菌、迟缓爱德华氏菌和脑膜炎脓毒黄杆菌，共7种细菌进行最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定。结果显示，毕赤酵母表达杂合肽dcBD1-HEP2，对革兰氏阴性菌中的大肠杆菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌均具有较好的抑菌和杀菌效果，MIC范围为3.125～6.25μg/ml，MBC范围为25～50μg/ml；然而对拟态弧菌抑菌效果却较差(MIC为50μg/ml)，而且浓度达200μg/ml时仍然没有杀菌效果。毕赤酵母表达杂合肽dcBD1-HEP2对两种革兰氏阳性菌的抑菌效果均较差(MIC范围25～100μg/ml)，而且浓度达200μg/ml时对膜炎脓毒黄杆菌仍然没有杀菌效果(见表5)。以上结果说明毕赤酵母表达杂合肽dcBD1-HEP2能够用在嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和迟缓爱德华氏菌引起的鱼类疾病的防治。

表5毕赤酵母表达杂合肽的MIC与MBC(μg/ml)

试验例3

毕赤酵母表达杂合肽抑菌动力学分析：

选取三种抑菌效果较好的嗜水气单胞菌(Ah)、维氏气单胞菌(Av)和迟缓爱德华氏菌(Et)进行抑菌动力学分析。分别将毕赤酵母表达杂合抗菌肽dcBD1-HEP2稀释至MIC和2MIC，然后与浓度为1.2×10

试验例4

毕赤酵母表达杂合肽溶血性分析：

本试验选用4％的兔血红细胞测定多肽的溶血活性，溶血率＜5％认为没有溶血活性。选择不同终浓度的毕赤酵母表达的dcBD1-HEP2作用于兔血红细胞1h后，OD540测定吸光值并计算溶血率。结果显示，毕赤酵母表达dcBD1-HEP2浓度为32μg/ml以下时溶血率小于5％，随着浓度升高，杂合肽溶血性都增强，其中浓度为256μg/ml时，溶血率达到26.26％(见图18)，比人工合成dcBD1-HEP2溶血率(30.48％)低。

试验例5

毕赤酵母表达杂合肽动物安全性分析：

分别选取高浓度(50μg/g鱼体重)、中浓度(25μg/g鱼体重)和低浓度(3.125μg/g鱼体重)的毕赤酵母表达的dcBD1-HEP2腹腔注射健康瓦氏黄颡鱼(10g±2g)，每组20尾，以等体积PBS作为对照。养殖水温25℃±1℃，连续观察14天，并记录死亡情况和症状。结果显示，连续观察14d，仅高浓度组死亡两尾鱼，剖检后注射部位组织有轻微出血；而其它组均未出现死亡，随机选取3尾鱼剖检后未发现内脏器官有明显病变(表6)。

表6毕赤酵母表达杂合肽腹腔注射健康瓦氏黄颡鱼后死亡情况

试验例6

毕赤酵母表达杂合肽临床应用I(疾病预防)：

在四川眉山瓦氏黄颡鱼养殖区，三个养殖池塘，每个养殖池塘架设四个网箱(2m×1.5m×2m)，每个网箱投放瓦氏黄颡鱼鱼苗500尾(5g±2g)，养殖水温22℃±4℃。分别设置高浓度(5g/kg饲料)、中浓度(3g/kg饲料)和低浓度(1g/kg饲料)的毕赤酵母表达的dcBD1-HEP2拌饲料投喂健康瓦氏黄颡鱼鱼苗，对照组投喂相同商品化瓦氏黄颡鱼膨化饲料，每天按照3％的量进行饱食投喂，投喂后2h后捞出未吃完饲料，连续投喂一个月，养殖水质定期测定，保持正常养殖水体水质标准。投喂一个月后统计发病情况和死亡率，同时每组捞取20尾，在实验室用半数致死剂量的迟缓爱德华氏菌进行人工感染，连续观察14天，统计死亡率。

实验结果显示，1号池塘和2号池塘在实验过程中发生相应疾病和水质变化，导致存活率比3号池塘低。不同剂量组之间，实验组存活率均高于对照组，高剂量组和中剂量组存活率分别为80.27％和79.6％差别不大，而且人工感染平均存活率为78.3％和76.7％，也相差不大，相比较低剂量组和对照组平均存活率均高(见表7和表8)。说明毕赤酵母表达的杂合肽dcBD1-HEP2能够提高瓦氏黄颡鱼鱼苗存活率，提高迟缓爱德华氏菌感染的抵抗力，具有预防疾病的作用。

表7疾病预防情况

表8疾病预防死亡率统计

试验例7

毕赤酵母表达杂合肽临床应用II(疾病治疗)：

在疾病流行季节，选取两个瓦氏黄颡鱼发病池塘，进行疾病治疗效果分析。1号池塘发病鱼主要表现为体表及及内脏器官出血，并有少量带血样腹水，经实验室细菌分离和鉴定，确定为嗜水气单胞菌感染。发病后第三天，每天死亡量约200尾-300尾，按照3g/kg饲料重量进行拌饲料投喂，连续投喂1周，停止死亡。2号发病池塘，发病鱼主要变现为腹部膨大，腹腔内有大量带血样腹水，同时肠道有炎症，经实验室鉴定为迟缓爱德华氏菌感染所致。每天死亡数量约1000尾，按照3g/kg饲料重量进行拌饲料投喂，连续投喂1周，死亡量降低到每天死亡50尾，连续投喂10天后，停止死亡(见图19)，图中A和B分别为1号发病池塘和发病鱼症状；C和D为2号发病池塘和发病鱼症状。以上结果表明，毕赤酵母表达的杂合肽dcBD1-HEP2能够治疗瓦氏黄颡鱼嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌感染所导致的疾病。

综上所述：本发明从瓦氏黄颡鱼头肾转录组数据中筛选出两种抗菌肽基因，Hepcidin和β-defensin，克隆了瓦氏黄颡鱼两种抗菌肽基因，预测了两种抗菌肽的成熟肽区段。人工改造了抗菌肽dcβ-defensin和dcHepcidin，得到两个杂合肽dcBD1-HEP1和dcBD1-HEP2，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌均具有抑菌作用。构建了毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA-dcBD1-HEP2，并成功表达，表达杂合肽对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑菌作用，具有较低溶血性，而且对瓦氏黄颡鱼安全。将毕赤酵母表达杂合肽dcBD1-HEP2拌饲料投喂瓦氏黄颡鱼鱼苗，能够提高其存活率和抗感染能力，同时也具有细菌性疾病的治疗作用。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 内江师范学院

<120> 一种瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽、制备方法及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> PRT

<213> 瓦氏黄颡鱼杂合抗菌肽的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 1

Arg Pro Lys Cys Leu Pro Thr Arg Leu Pro Phe Gly Pro Phe Ala Ser

1 5 10 15

Lys Gly Phe Val Cys Val Ser His Cys Arg Tyr Cys Cys Asn Cys Cys

20 25 30

Lys Asn Lys

35

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> dcBD1的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Arg Pro Lys Cys Leu Pro Thr Arg Leu Pro Phe Gly Pro Phe Ala Ser

1 5 10 15

Lys Gly Phe Val Cys Val Ser His

20

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> dcHEP2的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

Cys Arg Tyr Cys Cys Asn Cys Cys Lys Asn Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 49

<212> PRT

<213> 瓦氏黄颡鱼抗菌肽β-defencin的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)

<400> 4

Ala Lys Gly Asn Ala Met Ala Ala Phe Pro Trp Ser Cys Thr Asn Tyr

1 5 10 15

Ser Gly Val Cys Arg Pro Ile Cys Leu Pro Thr Glu Leu Pro Phe Gly

20 25 30

Pro Phe Ala Cys Ser Lys Gly Phe Val Cys Cys Val Ser His Val Ile

35 40 45

Leu

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 瓦氏黄颡鱼抗菌肽Hepcidin的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)

<400> 5

Gln Ser His Leu Ser Leu Cys Arg Tyr Cys Cys Asn Cys Cys Lys Asn

1 5 10 15

Lys Gly Cys Gly Phe Cys Cys Arg Phe

20 25

<210> 6

<211> 126

<212> PRT

<213> 优化序列的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 6

Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr Gly Cys

1 5 10 15

Cys Ala Ala Cys Thr Ala Gly Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr

35 40 45

Ala Ala Gly Gly Gly Thr Thr Thr Cys Gly Thr Thr Thr Gly Thr Gly

50 55 60

Thr Thr Thr Cys Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Ala Gly Ala Thr Ala

65 70 75 80

Cys Thr Gly Thr Thr Gly Thr Ala Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Thr

85 90 95

Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys

100 105 110

Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Ala

115 120 125

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 杂合肽上游引物的核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 7

cggaattcat gagaccaaag tgtttgccaa ctag 34

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 杂合肽下游引物的核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 8

gctctagatt agtggtggtg gtggtggtgc t 31

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Hepcidin-F引物核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 9

gaatccaagc atccagagag a 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Hepcidin-R引物核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 10

acattggcta tgtcccttta ct 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> β-defensin-F引物的核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 11

atgaagtatc aagggatgac ca 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> β-defensin-R引物的核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 12

tctgtgagat gagggtccat 20

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> dcHEP2的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 13

Cys Arg Tyr Cys Cys Asn Cys Cys Lys Asn Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 42

<212> PRT

<213> dcBD1-HEP1的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 14

Arg Pro Lys Cys Leu Pro Thr Arg Leu Pro Phe Gly Pro Phe Ala Ser

1 5 10 15

Lys Gly Phe Val Cys Val Ser His Cys Arg Tyr Cys Cys Asn Cys Cys

20 25 30

Lys Asn Lys Gly Cys Gly Phe Cys Cys Arg

35 40