公开/公告号CN114796452A
专利类型发明专利
公开/公告日2022-07-29
原文格式PDF
申请/专利权人 华东师范大学;
申请/专利号CN202110117195.8
申请日2021-01-28
分类号A61K38/17(2006.01);A61P17/00(2006.01);A61P17/06(2006.01);C12N9/14(2006.01);C12Q1/6883(2018.01);G01N33/573(2006.01);G01N33/68(2006.01);A01K67/02(2006.01);
代理机构上海德禾翰通律师事务所 31319;
代理人夏思秋
地址 200241 上海市闵行区东川路500号
入库时间 2023-06-19 16:11:11
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-08-16
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K38/17 专利申请号:2021101171958 申请日:20210128
实质审查的生效
技术领域
本发明涉及生物化学、分子生物学、免疫学和皮肤病学等领域,涉及炎症性皮肤疾病生物标志物DDX5和/或sIL-36R及其应用。
背景技术
特应性皮炎(Atopic dermatitis,AD)和银屑病是两种主要的慢性炎症性皮肤疾病。世界卫生组织的数据显示:全球至少有2.3亿人患有特应性皮炎[1],约1.25亿人受到银屑病的影响[2]。其中<7岁儿童中特应性皮炎的患病率高达25%,成年人患特应性皮炎的概率为7-10%。这两种炎症性皮肤疾病不仅发病率高,而且反复发作,给患者的生活带来严重的困扰。
AD和银屑病这两种炎症性疾病在皮肤上的病理表型都主要由角质形成细胞对T细胞产生的细胞因子应答所导致的,但在这两种疾病中起致病作用的T细胞亚群不同,因而作用于角质形成细胞的细胞因子也差别较大[3]。例如,在AD中,Th2细胞分泌的IL-4、IL-13作用于角质形成细胞,不仅抑制角质形成细胞分化基因Flaggerin(FLG)的表达来破坏皮肤屏障功能[4,5],而且能诱导角质形成细胞表达CCL17、CCL22等趋化因子招募大量的炎性细胞浸润在皮损部位[6]。而银屑病中,Th17细胞分泌的IL-17A、IL-17F等细胞因子作用于角质形成细胞,诱导角质形成细胞表达REG3A促进表皮的过度增生[7]或诱导CXCL1、CCL20等趋化因子招募更多的嗜中性粒细胞和Th17细胞的浸润[8],从而加重皮肤炎症表型。
虽然AD和银屑病是具有不同临床、组织和分子表型的两种炎症性皮肤疾病,但是这两种炎症性皮肤疾病在发病机制上也有其相似的机制,即角质形成细胞对外界危险信号的应答在AD和银屑病的炎症起始起了至关重要的作用。在皮肤受损后,受损细胞释放的RNAs激活角质形成细胞TLR3来诱导IL-36的表达[9]。IL-36激活角质形成细胞或树突状细胞中的IL-36受体(IL-36R)信号传导诱导CCL17、CXCL8、CXCL1和CCL20等趋化因子的表达,招募大量的中性粒细胞浸润或激活Th17等细胞分泌更多的细胞因子,从而引发皮肤炎症[10]。已有大量的研究证明IL-36家族细胞因子的高表达和IL-36/IL-36R信号通路的紊乱是引发银屑病(尤其是脓疱型银屑病)的重要因素[11]。而在AD中,IL-36激活IL-36信号通路会促进搔抓,以起始或维持AD炎症[12]。另外,亚洲AD病人兼具欧美AD和银屑病的病理表型,尤其是IL-36在亚洲AD表皮中的高表达是其兼具这两种病理表型的主要因素[13]。综上所述,IL-36家族细胞因子通过结合并激活其受体IL-36R启动下游促炎症信号通路,诱导炎症因子和趋化因子的表达来招募大量的炎性细胞的浸润,从而引发AD和银屑病。因而,IL-36/IL-36R信号通路可作为治疗AD和银屑病等炎症性皮肤疾病的靶点。最近利用IL-36R中和抗体成功治疗7例脓疱型银屑病病人的报道也印证了这一点[14]。而除了IL-36R中和抗体,是否还有其他因子能够拮抗IL-36R信号通路以及拮抗IL-36R信号通路是否能治疗AD仍未知。
DDX5是一种ATP依赖的RNA解旋酶,也称为DEAD盒蛋白5或RNA解旋酶p68[15]。DDX5参与包括RNA结构改变在内的各种途径,可作为转录调节剂、剪接的调节剂并在非编码RNA的加工中发挥作用[16]。RNA剪接(特别是可变剪接)是真核基因表达调控的重要方式之一。可变剪接会导致多种转录本变体的产生,不同的变体在疾病的发生发展中起着至关重要的作用。例如,DDX5/DDX17参与调节转录因子NFAT5的可变剪接促进IL-4和GATA3的表达,可能促进AD中Th2免疫应答[17,18]。另外,已有数据显示DDX5与皮褶型、红皮型以及慢性斑块型银屑病紧密相关[19],而在atopic march相关的疾病基因分析中,DDX5也被发现在哮喘中的表达降低与疾病进程相关[20]。虽然DDX5与AD和银屑病有一定的相关性,但是DDX5是如何参与AD或银屑病的致病以及是否可作为AD和银屑病等炎症性皮肤疾病的诊治生物标志物仍未知。
发明内容
本发明提供了sIL-36R、DDX5、DDX5/sIL-36R在制备抑制和/或缓解和/或减轻和/或治疗特应性皮炎(AD)和/或银屑病的药物中的应用。
所述的sIL-36R通过抑制IL-36/IL-36R信号通路,包括下游的NFκB和p38MAPK信号通路,抑制由IL-36家族细胞因子诱导的炎症反应,进而起到减轻、治疗AD的作用。在MC903诱导的AD小鼠中注射重组的本发明所述的sIL-36R能缓解AD小鼠的病理症状,起到抑制和/或缓解和/或减轻和/或治疗AD的作用。
所述sIL-36R为IL-36的可溶性受体,其仅包括IL-36R的配体结合区域;其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示,其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示:
小鼠的sIL-36R氨基酸序列如下:
MGVTSLLFCGVFFLLLLFVAADTCEDIFMHNVIISEGQPFPFNCTYPPETNGAVNLTWYKTPSKSPVSNNRHLRVHQDQTWILFLPLTLEDSGIYQCVIRNAHNCYQIAVNLTVLKNHWCDSSMEGSPVNSPDVYQQILPIGKSGSLNCHLYFPESCALDSIKWYKGCEEIKAGKKYSPSGAKLLVNNVAVEDGGSYACSARLTHLGRHFTIRNYIAVNTKEVEYGRRIPNITYPKNNSIEVPLEPMCP。(SEQ ID NO.1)
人的sIL-36R氨基酸序列如下:
MWSLLLCGLSIALPLSVTADGCKDIFMKNEILSASQPFAFNCTFPPITSGEVSVTWYKNSSKIPVSKIIQSRIHQDETWILFLPMEWGDSGVYQCVIKTVTRLKGSGSLFWKPGFW(SEQ ID NO.2)
小鼠的sIL-36R核苷酸序列如下:
atgggggttacatctttgctcttctgtggggtgtttttcctgcttctgcttttcgtggcagcagatacgtgtgaggacatttttatgcacaatgtgataatttcagagggccagccttttcctttcaactgcacatacccgccagaaacaaacggggcagtaaatctgacatggtacaaaacacctagcaaaagcccagtatctaacaacagacaccttagagttcaccaggaccagacctggatcttgtttcttccattgacactggaggactccggtatctatcagtgtgttataaggaatgcccacaactgctaccaaatagctgtgaacctaaccgttttaaaaaaccactggtgtgactcttccatggaggggagtcccgtaaattcaccagatgtgtaccagcaaatattacccataggaaaatcgggcagtctgaattgtcatctctacttcccagaaagttgtgctttggattcaataaaatggtataagggttgtgaagagattaaagcggggaaaaagtacagcccttcaggagcaaagcttcttgtgaacaacgttgctgtggaggacggcgggagctatgcgtgctcagccagactgactcacttggggagacacttcaccattagaaactacattgctgtgaacaccaaggaagttgagtatggaagaaggatccctaacatcacgtatccaaagaacaactccattgaagttccacttgaaccaatgtgtccttga(SEQ ID NO.3)
人的sIL-36R核苷酸序列如下:
ATGTGGTCCTTGCTGCTCTGCGGGTTGTCCATCGCCCTTCCACTGTCTGTCACAGCAGATGGATGCAAGGACATTTTTATGAAAAATGAGATACTTTCAGCAAGCCAGCCTTTTGCTTTTAATTGTACATTCCCTCCCATAACATCTGGGGAAGTCAGTGTAACATGGTATAAAAATTCTAGCAAAATCCCAGTGTCCAAAATCATACAGTCTAGAATTCACCAGGACGAGACTTGGATTTTGTTTCTCCCCATGGAATGGGGGGACTCAGGAGTCTACCAATGTGTTATAAAGACTGTAACGAGATTAAAGGGGAGCGGTTCACTGTTTTGGAAACCAGGCTTTTGGTGA(SEQ ID NO.4)
所述sIL-36R的氨基酸序列,只含有全长受体的配体结合区域,不具有全长受体的跨膜区域和胞内区域。
所述sIL-36R是由缺失第3个外显子IL-36R mRNA转录、翻译后得到,由于IL-36RmRNA缺失第3个外显子使得转录提前终止,因此翻译后蛋白只含有配体结合区域,分泌至胞外。
本发明还提供了所述sIL-36R在制备抑制IL-36诱导的细胞因子和趋化因子产生的药物中的应用。
其中,所述细胞因子包括IL-4、IL-13、TSLP、IL23、IL17a。
其中,所述趋化因子包括CCL17、CCL22、CCL20、CXCL1、CXCL2、CCL3、和CCL11。
其中,所述药物用于抑制角质形成细胞对IL-36的炎症应答。
本发明还提供了所述sIL-36R在制备抑制IL-36/IL-36R信号通路,包括下游信号通路NFκB和p38 MAPK的药物中的应用。
本发明还提供了所述sIL-36R在制备抑制角质形成细胞增殖的药物中的应用。
本发明还提供了一种生物标志物DDX5,所述生物标志物DDX5为RNA解旋酶DDX5,其氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示,理化特征为ATP依赖的RNA解旋酶,参与基因的转录调控,在正常皮肤表皮层角质形成细胞中高表达,其在AD和银屑病病人皮损中的表达显著被抑制。
所述DDX5用于诊断特应性皮炎和/或银屑病的病发和/或治愈和/或复发。
所述DDX5在特应性皮炎和银屑病皮损部位表达降低,而随着皮损消退,所述DDX5的表达回复到正常水平。
本发明还提供了所述生物标志物DDX5在诊断特应性皮炎和/或银屑病等炎症性皮肤疾病的病发和/或治愈和/或复发中的应用。
所述炎症性皮肤疾病包括AD、银屑病等。
所述生物标志物DDX5和sIL-36R在AD和银屑病皮损中表达下降,而在基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)等皮肤癌的角质形成细胞中表达升高。DDX5的减少导致皮肤自发产生AD样和银屑病样炎症,而在病理状态下DDX5的缺失进一步加重AD和银屑病的皮肤炎症。当AD或银屑病病理症状消退后,DDX5的表达回复到正常水平。
本发明还提供了一种组合生物标志物,其包含DDX5、sIL-36R、和/或DDX5/sIL-36R组合。
本发明还提供了所述DDX5、sIL-36R和/或DDX5/sIL-36R组合标志物在诊断特应性皮炎或银屑病等炎症性皮肤疾病的病发和/或治愈和/或复发中的应用。
所述DDX5调节IL-36R pre-mRNA的剪接产生sIL-36R。
DDX5的减少导致IL-36R的增加,但sIL-36R减少,从而导致IL-36/IL-36R信号通路紊乱产生大量的细胞因子和趋化因子来引发皮肤炎症。因此,在AD、银屑病病人及小鼠皮损中DDX5的量相对减少,相应的sIL-36R也减少。
本发明还提供了一种检测试剂/试剂盒,其含有生物标志物DDX5、和/或sIL-36R和/或DDX5/sIL-36R组合。
所述检测试剂/试剂盒用于诊断特应性皮炎或银屑病等炎症性皮肤疾病的病发和/或治愈和/或复发。
本发明还提供了一种药物或药物组合物,其含有生物标志物DDX5、sIL-36R和/或DDX5/sIL-36R组合。
本发明还提出了所述药物或药物组合物在制备抑制和/或缓解和/或减轻和/或治疗特应性皮炎和/或银屑病的药物中的应用。
本发明还提供了一种皮炎自发的小鼠模型,即表皮特异性缺失DDX5的基因敲除小鼠(Ddx5
本发明中,所述细胞因子包括IL-4、IL-13、TSLP、IL23、IL17a。所述趋化因子包括CCL3、CCL11、CCL17、CCL22、CCL20、CXCL1和CXCL 2。
本发明还提供了所述皮炎自发的小鼠模型在抑制和/或治疗和/或减轻和/或缓解AD或银屑病等炎症性皮肤疾病中的应用。
本发明还提供了一种抑制和/或治疗和/或减轻和/或缓解特应性皮炎或银屑病的方法,向受试者个体施用所述的可溶性受体sIL-36R、DDX5、DDX5/sIL-36R。
本发明还提出了检测AD和银屑病等炎症性皮肤疾病的病发、治愈和复发的方法,用所述DDX5、sIL-36R和/或DDX5/sIL-36R试剂或试剂盒检测受试者个体皮损中DDX5和/或sIL-36R的表达。
本发明的有益效果包括:本发明提供的可溶性受体sIL-36R,可以抑制IL-36激活的IL-36R信号通路,进而减轻AD的炎症反应,达到治疗AD的目的。本发明还发现DDX5、sIL-36R或DDX5/sIL-36R组合可作为诊治炎症性皮肤疾病的靶点和生物标志物,能够有效抑制、治疗、减轻、缓解AD、银屑病等炎症性皮肤疾病。本发明中,DDX5在银屑病和/或特应性皮炎皮损处的角质形成细胞中表达下调,但在皮损消退后DDX5的表达回复到正常水平。DDX5的低表达导致角质形成细胞中IL-36Rpre-mRNA的可变剪接发生改变,使得IL-36R增多而可溶性sIL-36R减少,从而促使IL-36R信号通路紊乱进而诱发皮肤炎症;而通过注射sIL-36R能够有效抑制特应性皮炎小鼠或银屑病小鼠中IL-36R信号通路,抑制特应性皮炎或银屑病小鼠皮损中细胞因子的表达来减轻特应性皮炎。所述sIL-36R、DDX5、DDX5/sIL-36R可作为诊治炎症性皮肤疾病的靶点和生物标志物。
附图说明
图1表示GEO数据库中正常人、银屑病病人和特应性皮炎患者皮损处DDX5的mRNA的表达。
图2表示银屑病病人皮损和特应性皮炎皮损处DDX5蛋白表达减少,其中,图A表示银屑病病人皮损处DDX5蛋白表达减少,图B表示AD病人皮损处DDX5蛋白表达减少。
图3表示DDX5主要在特应性皮炎(图3A)和银屑病(图3B)病人皮损角质形成细胞中表达减少。
图4表示DDX5在基底细胞癌和鳞状细胞癌中的表达增加。
图5表示DDX5的mRNA和蛋白水平在咪喹莫特(IMQ)涂抹诱导的C57BL/6银屑病小鼠皮损中的表达减少,其中,图A表示IMQ诱导不同天数的银屑病小鼠皮损中DDX5 mRNA的表达,随着诱导天数的延长,DDX5的mRNA的表达显著降低,图B表示IMQ诱导不同天数的银屑病小鼠皮损中DDX5蛋白的表达,随着诱导天数的延长,DDX5蛋白的表达明显降低。
图6表示DDX5的mRNA和蛋白水平在MC903涂抹诱导的C57BL/6特应性皮炎小鼠皮损中的表达减少,其中,图A表示MC903诱导不同天数的特应性皮炎小鼠皮损中DDX5 mRNA的表达,随着诱导天数的延长,DDX5的mRNA的表达显著降低,图B表示MC903导不同天数的特应性皮炎小鼠皮损中DDX5蛋白的表达,随着诱导天数的延长,DDX5蛋白的表达明显降低。
图7表示DDX5蛋白在银屑病和特应性皮炎消退的C57BL/6小鼠皮肤中的表达回复,其中,图A表示小鼠正常皮肤、IMQ诱导的银屑病小鼠皮损以及银屑病消退后同一部位皮肤中DDX5蛋白的表达,图B表示小鼠正常皮肤、MC903诱导的特应性皮炎小鼠皮损以及特应性皮炎消退后同一部位皮肤中DDX5蛋白的表达。
图8表示角质形成细胞中特异敲除DDX5基因(Ddx5
图9表示咪喹莫特诱导的Ddx5
图10表示咪喹莫特诱导的Ddx5
图11表示MC903诱导的Ddx5
图12表示MC903诱导的Ddx5
图13表示DDX5调节人和鼠角质形成细胞中IL-36受体的pre-mRNA可变剪接产生可溶性的sIL-36R,图A表示人角质形成细胞中IL-36Rpre-mRNA的剪接,B表示小鼠角质形成细胞中IL-36Rpre-mRNA的剪接。
图14表示角质形成细胞中DDX5的缺失导致IL-36R表达升高,sIL-36R表达减少,图A表示在人的角质形成细胞中敲低DDX5后IL-36Rpre-mRNA的剪接,图B表示DDX5缺失的小鼠的角质形成细胞中IL-36Rpre-mRNA的剪接。
图15表示sIL-36R在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠中表达逐渐降低,而IL-36R和IL-36γ表达逐渐升高,图A表示western blot检测蛋白的表达,图B表示统计的蛋白条带灰度的比值。
图16表示sIL-36R在MC903诱导的AD小鼠中表达逐渐降低,而IL-36R和IL-36γ表达逐渐升高,图A表示western blot检测蛋白的表达,图B表示统计的蛋白条带灰度的比值。
图17表示sIL-36R抑制由IL-36γ所介导的DDX5
图18表示注射重组sIL-36R蛋白可以减轻MC903诱导的特应性皮炎小鼠的病理症状。
图19表示注射sIL-36R蛋白可以减少MC903诱导的特应性皮炎小鼠皮损中细胞因子和趋化因子的表达。
具体实验方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
实施例1:DDX5在银屑病和特应性皮炎病人皮损中的表达
首先,通过分析GEO数据库中银屑病和特应性皮炎皮肤样本数据,结果如图1所示:与38个正常人样本相比,在28例银屑病和27例特应性皮炎病人皮损中DDX5的mRNA水平降低,在银屑病中皮损DDX5的mRNA的表达下降40%左右,而在特应性皮炎中皮损DDX5的mRNA的表达下降30%左右。
其次,本发明收集了3例特应性皮炎病人、3例银屑病病人和3例正常人皮肤,将皮肤组织加入含有RIPA试剂的击打管中,在4℃,60Hz下,击打3分钟,之后在4℃用12000转离心15分钟,收取上层澄清蛋白样品,用BCA试剂盒检测完蛋白浓度后,用western blot检测20μg总蛋白中DDX5的表达,实验结果如图2所示:与正常人相比,DDX5蛋白在银屑病和AD患者皮损中的表达分别降低了20%和60%。
最后,本发明收集一些正常人、银屑病和AD病人的皮肤,并用4%多聚甲醛固定48小时后,进行一系列脱水后进行石蜡包埋,将包埋好的蜡块切成4μm的薄片,放置在载玻片上。将切片脱蜡后进行抗原修复,用3%BSA封阻以防非特异性染色,之后加入抗DDX5抗体4℃孵育过夜。第二天,孵育对应的二抗后,通过共聚焦显微镜检测DDX5的定位和表达。结果如图3所示:DDX5主要在正常人表皮角质形成细胞中高表达(绿色荧光所示),而在AD和银屑病病人皮损表皮角质形成细胞中绿色荧光明显减弱,表明DDX5在AD和银屑病病人皮损表皮角质形成细胞中的表达显著降低。
综上,Westernblot和免疫荧光染色结果均显示DDX5在正常人表皮角质形成细胞中高表达,而在AD和银屑病患者皮损表皮层中的DDX5表达显著降低。
实施例2:DDX5在皮肤癌中的表达
本发明收集了3例基底细胞癌和3例鳞状细胞癌皮肤切片,将切片脱蜡后进行抗原修复,用3%BSA在室温封阻1小时以防非特异性染色,再加入抗DDX5抗体4℃孵育过夜。第二天,孵育对应的二抗后,通过共聚焦显微镜检测DDX5的定位和表达。实验结果如图4所示:绿色荧光表征DDX5的免疫染色,绿色荧光在基底细胞癌和鳞状细胞癌等皮肤癌的角质形成细胞中光强明显亮于正常人,说明DDX5在人的基底细胞癌和鳞状细胞癌等皮肤癌中的表达高于正常人皮肤。
实施例3:DDX5在银屑病和特应性皮炎小鼠的表达
对于银屑病小鼠模型,给7-8周大的野生型C57BL/6小鼠背部脱毛,从第二天开始在小鼠背部皮肤上连续5天涂抹62.5mg咪喹莫特(IMQ)乳膏诱导小鼠银屑病模型,每天处死一组小鼠取小鼠皮肤组织制备组织切片以及抽提RNA和蛋白,提取RNA的具体操作方法是:取绿豆大小的组织加入到1ml含有3mm磁珠的Trizol中,用组织匀浆仪在4℃击打3分钟,离心5分钟后,吸取上层Trizol,不要取到组织,然后加入1/5的氯仿,震荡10秒后室温静置5分钟,在4℃用12000转离心15分钟,吸取上层透明澄清液,加入等体积异丙醇混匀后在室温静置10分钟。之后在4℃用12000转离心10分钟,管子底部可见乳白色RNA沉淀,用1ml 75%预冷的乙醇洗涤1次,离心5分钟后去掉乙醇,待RNA干燥后加入RNase-free水溶解RNA。使用Nanodrop检测RNA浓度后,用Roche反转录试剂将1μg总RNA反转录成cDNA。提取蛋白的方法和本发明实施例1一致。如图5所示:DDX5的mRNA在IMQ诱导的第一天降低了55%左右,而随着IMQ诱导时间的延长,DDX5的mRNA进一步降低,到第5天的时候降低了75%左右,并且DDX5蛋白在IMQ诱导的第3天有明显的下降,第4、第5天DDX5蛋白与诱导前相比降低了75%左右,说明DDX5的mRNA和蛋白的表达在银屑病皮损中随着疾病加重而降低。
对于特应性皮炎小鼠模型,是在7-8周大的野生型C57BL/6小鼠耳朵上每天涂抹1nm MC903来诱导小鼠AD模型,每天用游标卡尺测量小鼠耳朵厚度,每间隔2天处死一组小鼠,取样抽提RNA和蛋白检测DDX5表达。实验结果如图6所示:DDX5的mRNA在MC903给药涂抹的第4天降低了50%左右,之后一直保持降低的水平,而DDX5的蛋白在MC903给药涂抹的第8天降低了50%,在第12天降低了80%左右,到第16天几乎检测不到,说明DDX5的mRNA和蛋白的表达在AD皮损中随着疾病加重而降低。
综上,这些实验结果说明DDX5的mRNA和蛋白表达在AD和银屑病致病过程中均显著降低。另外,如图7所示:DDX5的表达不仅随疾病进程加重而减少,而且随着疾病的消退其表达回复到正常水平。图A表示在IMQ诱导的银屑病小鼠中,DDX5蛋白在诱导5天的银屑病小鼠皮损中表达显著降低(降低70%左右),而在停药8天银屑病消退后的皮肤中DDX5的表达有所恢复;图B表示DDX5在MC903诱导8天的耳朵样品中表达降低50%左右,在停药10天炎症消退后表达回复到正常水平。
实施例4:表皮特异性缺失DDX5基因的小鼠(Ddx5
通过cre-loxP技术构建DDX5
实施例5:表皮特异性缺失DDX5加重特应性皮炎和银屑病小鼠病理
如本发明实施例3所述分别用IMQ和MC903诱导银屑病和AD小鼠模型,Ddx5
图10显示利用ELISA检测银屑病皮损中细胞因子和趋化因子的表达,发现银屑病相关细胞因子Il-23从200pg/mg增加到600pg/mg左右,Il-17a从150pg/mg增加到300pg/mg左右,并且趋化因子Ccl20从200pg/mg左右上升到300pg/mg,以及cxcl1从400pg/mg增加到700pg/mg左右。
同样的,Ddx5
RT-PCR检测特应性皮炎皮损中细胞因子和趋化因子的表达,结果如图12所示Ddx5
综上,这些结果说明表皮特异性缺失DDX5会加重特应性皮炎和银屑病。
实施例6:DDX5调节IL-36R pre-mRNA的可变剪切
角质形成细胞中IL-36R存在不同的变体。人的角质形成细胞中hsIL-36R是由全长的IL-36R缺失3号外显子所产生的,而在小鼠角质形成细胞中msIL-36R则是由全长的IL-36R缺失第6号外显子所产生的。为了确定DDX5能调节IL-36R pre-mRNA剪接,本发明根据缺失的序列设计了能够区分全长IL-36R和sIL-36R的PCR引物,首先我们利用CRISPR-Cas9技术人角质形成细胞系HaCat中DDX5敲除,得到DDX5
此外,本发明还分离了DDX5
这些结果说明DDX5参与调节IL-36R pre-mRNA的可变剪切,DDX5的缺失导致IL-36R表达增多而sIL-36R的表达减少。
实施例7:角质形成细胞中因缺失DDX5使IL-36R增加而sIL-36R减少
用western blot的技术手段验证IL-36R和sIL-36R蛋白在角质形成细胞中的表达。首先,在6孔板中培养人的新生儿原代角质形成细胞(NHEK),当细胞密度达到80%时,用lipofectamin2000试剂将100pmol siRNA转入NHEK细胞中,4小时后换成新鲜完全培养基,36小时后,用RIPA裂解细胞,超声破碎细胞,4℃离心15分钟后,收集上清。待上清中蛋白浓度用BCA法测定后,20μg总蛋白用于western blot,实验结果如图14A所示;DDX5被敲低后,角质形成细胞中IL-36R蛋白表达升高了2.5倍,sIL-36R蛋白表达减少了60%左右。
此外,本发明还从Ddx5
此外,本发明也在如实施例3所构建的不同天数银屑病和AD小鼠模型中,用western blot检测到随着诱导天数的增加,银屑病和AD小鼠皮损中IL-36R和IL-36γ的表达呈递增趋势,而sIL-36R的表达则随着时间的延长而减少,在银屑病中的表达具体可见在图15中IL-36γ和IL-36R分别在第1天和第2天表达上升,IL-36R在第4天表达量最高,高达35倍;而sIL-36R的表达在第1、第2天表达先增加,到底3天则表达降低,一直持续到第5天。在AD中的表达具体可见图16:IL-36γ和IL-36R分别在第4天和第8天表达上升,而sIL-36R的表达则在第4天有轻微的升高,在第8天开始表达降低,一直到第16天sIL-36R的表达降低了80%左右。
综上,这些结果说明DDX5能调节IL-36Rpre-mRNA的可变剪切,而DDX5的减少或缺失导致角质形成细胞中IL-36R表达增多而sIL-36R蛋白表达减少。而在银屑病和AD病理条件下,由于DDX5的减少,皮损中IL-36R增加而sIL-36R蛋白减少,进一步加重银屑病和AD。
实施例8:sIL-36R抑制角质形成细胞的炎症应答
将DDX5
实施例9:注射重组sIL-36R蛋白能减轻特应性皮炎小鼠的病理症状
向野生型小鼠左耳注射20μl PBS,右耳注射1μg sIL-36R蛋白(20μl)后,再用1nMMC903涂抹小鼠耳朵,连续涂抹15天诱导特应性皮炎。诱导过程中,每天用游标卡尺测量耳朵厚度,给小鼠耳朵拍照。第16天处死小鼠,收集耳朵蛋白、RNA和组织制备切片。如图18和图19所示,重组sIL-36R能显著抑制AD的病发,表现在:如图18所示的小鼠耳朵皮屑明显减少,耳朵厚度和皮损表皮层厚度变薄;RT-PCR检测皮损中细胞因子和趋化因子的表达如图19所示:sIL-36R能显著抑制AD小鼠皮损中细胞因子和趋化因子的表达,具体地Il-4抑制了75%,Il-13抑制了90%,Tslp抑制了80%,以及趋化因子Ccl11抑制70%,Ccl17和Ccl22均抑制了50%。
这些结果说明重组sIL-36R蛋白能减轻特应性皮炎的病理症状,对特应性皮炎起到治疗作用。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。
1.Weidinger,S.,et al.,Atopic dermatitis.Nat Rev Dis Primers,2018.4(1):p.1.
2.Parisi,R.,et al.,Global epidemiology of psoriasis:a systematicreview of incidence and prevalence.J Invest Dermatol,2013.133(2):p.377-85.
3.Cristina,et al.,Keratinocytes in Inflammatory Skin Diseases.2005.
4.Sehra,S.,et al.,IL-4 regulates skin homeostasis and thepredisposition toward alergic skin inflammation.2010.184(6):p.3186-3190.
5.Furue,K.,et al.,The IL-13–OVOL1–FLG axis in atopicdermatitis.2019.158(4).
6.Yano,C.,et al.,Mechanism of Macrophage-Derived Chemokine/CCL22Production by HaCaT Keratinocytes.2015.27(2).
7.Lai,Y.,et al.,The Antimicrobial Protein REG3A RegulatesKeratinocyte Proliferation and Diferentiation after Skin Injury.2012.37(1):p.74-84.
8.Furue,M.,et al.,Interleukin-17A and Keratinocytes inPsoriasis.2020.21(4):p.1275.
9.Jiang,Z.,et al.,IL-36γInduced by the TLR3-SLUG-VDR Axis PromotesWound Healing via REG3A.2017:p.S0022202X17327379.
10.Li,N.,et al.,Alarmin function of cathelicidin antimicrobialpeptide LL37 through IL-36γinduction in human epidermalkeratinocytes.2014.193(10):p.5140-8.
11.Madonna,S.,et al.,The Significance of IL-36 Hyperactivation andIL-36R Targeting in Psoriasis.2019.20(13).
12.Liu,H.,et al.,Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure DrivesSkin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses.2017.22(5):p.653-666.
13.Guttman-Yassky,E.and J.G.Krueger,Atopic dermatitis and psoriasis:two diferent immune diseases or one spectrum?Curr Opin Immunol,2017.48:p.68-73.
14.Inhibition of the Interleukin-36 Pathway for the Treatment ofGeneralized Pustular Psoriasis.%J New England Journal of Medicine.2019.
15.Fuller-Pace and V.J.B.B.A.Frances,The DEAD box proteins DDX5(p68)and DDX17(p72):Multi-tasking transcriptional regulators.2013.1829(8):p.756-763.
16.Nyamao,M.,et al.,Roles of DDX5 in the tumorigenesis,proliferation,diferentiation,metastasis and pathway regulation of human malignancies.2018.
17.Yang,J.,et al.,Systematic Determination of Human Cyclin DependentKinase(CDK)-9 Interactome Identifies Novel Functions in RNA Splicing Mediatedby the DEAD Box(DDX)-5/17 RNA Helicases.2015.14(10):p.2701.
18.Matthias,J.,et al.,Sodium chloride isan ionic checkpoint for humanTH2 cels and shapes the atopic skin microenvironment.2019.11(480).
19.Xing,X.,et al.,IL-17 Responses Are the Dominant InflammatorySignal Linking Inverse,Erythrodermic,and Chronic Plaque Psoriasis.J InvestDermatol,2016.136(12):p.2498-2501.
20.Diana
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 炎症性皮肤疾病生物标志物DDX5和/或sIL-36R及其应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gly Val Thr Ser Leu Leu Phe Cys Gly Val Phe Phe Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Phe Val Ala Ala Asp Thr Cys Glu Asp Ile Phe Met His Asn Val
20 25 30
Ile Ile Ser Glu Gly Gln Pro Phe Pro Phe Asn Cys Thr Tyr Pro Pro
35 40 45
Glu Thr Asn Gly Ala Val Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Thr Pro Ser Lys
50 55 60
Ser Pro Val Ser Asn Asn Arg His Leu Arg Val His Gln Asp Gln Thr
65 70 75 80
Trp Ile Leu Phe Leu Pro Leu Thr Leu Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Gln
85 90 95
Cys Val Ile Arg Asn Ala His Asn Cys Tyr Gln Ile Ala Val Asn Leu
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Thr Val Leu Lys Asn His Trp Cys Asp Ser Ser Met Glu Gly Ser Pro
115 120 125
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130 135 140
Gly Ser Leu Asn Cys His Leu Tyr Phe Pro Glu Ser Cys Ala Leu Asp
145 150 155 160
Ser Ile Lys Trp Tyr Lys Gly Cys Glu Glu Ile Lys Ala Gly Lys Lys
165 170 175
Tyr Ser Pro Ser Gly Ala Lys Leu Leu Val Asn Asn Val Ala Val Glu
180 185 190
Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ala Arg Leu Thr His Leu Gly Arg
195 200 205
His Phe Thr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala Val Asn Thr Lys Glu Val Glu
210 215 220
Tyr Gly Arg Arg Ile Pro Asn Ile Thr Tyr Pro Lys Asn Asn Ser Ile
225 230 235 240
Glu Val Pro Leu Glu Pro Met Cys Pro
245
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
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1 5 10 15
Val Thr Ala Asp Gly Cys Lys Asp Ile Phe Met Lys Asn Glu Ile Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Gln Pro Phe Ala Phe Asn Cys Thr Phe Pro Pro Ile Thr
35 40 45
Ser Gly Glu Val Ser Val Thr Trp Tyr Lys Asn Ser Ser Lys Ile Pro
50 55 60
Val Ser Lys Ile Ile Gln Ser Arg Ile His Gln Asp Glu Thr Trp Ile
65 70 75 80
Leu Phe Leu Pro Met Glu Trp Gly Asp Ser Gly Val Tyr Gln Cys Val
85 90 95
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
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1 5 10 15
Gly Ala Pro Arg Phe Gly Gly Ser Arg Ala Gly Pro Leu Ser Gly Lys
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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180 185 190
Ala Cys Arg Leu Lys Ser Thr Cys Ile Tyr Gly Gly Ala Pro Lys Gly
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Arg Leu Ile Asp Phe Leu Glu Cys Gly Lys Thr Asn Leu Arg
225 230 235 240
Arg Thr Thr Tyr Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met Leu Asp Met
245 250 255
Gly Phe Glu Pro Gln Ile Arg Lys Ile Val Asp Gln Ile Arg Pro Asp
260 265 270
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275 280 285
Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys Asp Tyr Ile His Ile Asn Ile Gly Ala
290 295 300
Leu Glu Leu Ser Ala Asn His Asn Ile Leu Gln Ile Val Asp Val Cys
305 310 315 320
His Asp Val Glu Lys Asp Glu Lys Leu Ile Arg Leu Met Glu Glu Ile
325 330 335
Met Ser Glu Lys Glu Asn Lys Thr Ile Val Phe Val Glu Thr Lys Arg
340 345 350
Arg Cys Asp Glu Leu Thr Arg Lys Met Arg Arg Asp Gly Trp Pro Ala
355 360 365
Met Gly Ile His Gly Asp Lys Ser Gln Gln Glu Arg Asp Trp Val Leu
370 375 380
Asn Glu Phe Lys His Gly Lys Ala Pro Ile Leu Ile Ala Thr Asp Val
385 390 395 400
Ala Ser Arg Gly Leu Asp Val Glu Asp Val Lys Phe Val Ile Asn Tyr
405 410 415
Asp Tyr Pro Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Thr
420 425 430
Ala Arg Ser Thr Lys Thr Gly Thr Ala Tyr Thr Phe Phe Thr Pro Asn
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450 455 460
Gln Ala Ile Asn Pro Lys Leu Leu Gln Leu Val Glu Asp Arg Gly Ser
465 470 475 480
Gly Arg Ser Arg Gly Arg Gly Gly Met Lys Asp Asp Arg Arg Asp Arg
485 490 495
Tyr Ser Ala Gly Lys Arg Gly Gly Phe Asn Thr Phe Arg Asp Arg Glu
500 505 510
Asn Tyr Asp Arg Gly Tyr Ser Ser Leu Leu Lys Arg Asp Phe Gly Ala
515 520 525
Lys Thr Gln Asn Gly Val Tyr Ser Ala Ala Asn Tyr Thr Asn Gly Ser
530 535 540
Phe Gly Ser Asn Phe Val Ser Ala Gly Ile Gln Thr Ser Phe Arg Thr
545 550 555 560
Gly Asn Pro Thr Gly Thr Tyr Gln Asn Gly Tyr Asp Ser Thr Gln Gln
565 570 575
Tyr Gly Ser Asn Val Pro Asn Met His Asn Gly Met Asn Gln Gln Ala
580 585 590
Tyr Ala Tyr Pro Ala Thr Ala Ala Ala Pro Met Ile Gly Tyr Pro Met
595 600 605
Pro Thr Gly Tyr Ser Gln
610
<210> 6
<211> 615
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ser Ser Tyr Ser Ser Asp Arg Asp Arg Gly Arg Asp Arg Gly Phe Gly Ala Pro
1 5 10 15
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Lys Leu Val Lys Lys Lys Trp Asn Leu Asp Glu Leu Pro Lys Phe Glu Lys Asn Phe Tyr
40 45 50 55
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100 105 110 115
Ile Gln Ala Gln Gly Trp Pro Val Ala Leu Ser Gly Leu Asp Met Val Gly Val Ala Gln
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Thr Gly Ser Gly Lys Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile Asn His Gln
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Cys Ile Tyr Gly Gly Ala Pro Lys Gly Pro Gln Ile Arg Asp Leu Glu Arg Gly Val Glu
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Ile Cys Ile Ala Thr Pro Gly Arg Leu Ile Asp Phe Leu Glu Cys Gly Lys Thr Asn Leu
220 225 230 235
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Ile Asn Ile Gly Ala Leu Glu Leu Ser Ala Asn His Asn Ile Leu Gln Ile Val Asp Val
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Lys Met Arg Arg Asp Gly Trp Pro Ala Met Gly Ile His Gly Asp Lys Ser Gln Gln Glu
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Ser Gly Arg Ser Arg Gly Arg Gly Gly Met Lys Asp Asp Arg Arg Asp Arg Tyr Ser Ala
480 485 490 495
Gly Lys Arg Gly Gly Phe Asn Thr Phe Arg Asp Arg Glu Asn Tyr Asp Arg Gly Tyr Ser
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Tyr Thr Asn Gly Ser Phe Gly Ser Asn Phe Val Ser Ala Gly Ile Gln Thr Ser Phe Arg
540 545 550 555
Thr Gly Asn Pro Thr Gly Thr Tyr Gln Asn Gly Tyr Asp Ser Thr Gln Gln Tyr Gly Ser
560 565 570 575
Asn Val Ala Asn Met His Asn Gly Met Asn Gln Gln Ala Tyr Ala Tyr Pro Ala Thr Ala
580 585 590 595
Ala Ala Ala Pro Met Ile Gly Tyr Pro Met Pro Thr Gly Tyr Ser Gln
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<210> 7
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<212> DNA
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atgtcgggtt attcgagtga ccgagaccgc ggccgggacc gagggtttgg tgcacctcga 60
tttggaggaa gtagggcagg gcccttatct ggaaagaagt ttggaaaccc tggggagaaa 120
ttagttaaaa agaagtggaa tcttgatgag ctgcctaaat ttgagaagaa tttttatcaa 180
gagcaccctg atttggctag gcgcacagca caagaggtgg aaacatacag aagaagcaag 240
gaaattacag ttagaggtca caactgcccg aagccagttc taaattttta tgaagccaat 300
ttccctgcaa atgtcatgga tgttattgca agacagaatt tcactgaacc cactgctatt 360
caagctcagg gatggccagt tgctctaagt ggattggata tggttggagt ggcacagact 420
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ttcctagaga gaggcgatgg gcctatttgt ttggtgctgg caccaactcg ggaactggcc 540
caacaggtgc agcaagtagc tgctgaatat tgtagagcat gtcgcttgaa gtctacttgt 600
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atgaggagag atgggtggcc tgccatgggt atccatggtg acaagagtca acaagagcgt 1140
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机译: 评估感染性疾病(如人类肠炎性肠病)对治疗炎症性疾病或疾病的反应状态的生物标志物
机译: 评估感染性疾病(如人类肠炎性肠病)对治疗炎症性疾病或疾病的反应状态的生物标志物
机译: 调整后的多生物标志物疾病活动评分用于炎症性疾病评估