一种蜂毒肽-蜂毒明肽组合物在制备抗抑郁药物中的应用

摘要

本发明公开了一种蜂毒肽‑蜂毒明肽组合物在制备抗抑郁药物中的应用，属于中药技术领域。本发明采用脂多糖刺激建立小鼠急性抑郁模型，通过行为学、免疫荧光、ELISA及Western blot等实验评价了蜂毒肽‑蜂毒明肽组合物对抑郁模型小鼠的影响。结果表明，相比于单用蜂毒肽或者蜂毒明肽，蜂毒肽‑蜂毒明肽组合物具有协同增效作用，能够显著改善脂多糖诱导的小鼠抑郁样行为及病理特征。结果提示，本发明的蜂毒肽‑蜂毒明肽组合物可以用于制备抗抑郁药物。

说明书

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种蜂毒肽-蜂毒明肽组合物在制备抗抑郁药物中的应用。

背景技术

抑郁症是我国目前最为普遍的精神疾病之一，且发病率、致残率及死亡率呈逐年递增趋势，严重影响了人们的生活质量，给社会带来了沉重的经济及医疗负担。然而，关于抑郁症的发病机制仍不明确，目前市场上的抗抑郁药物也不能完全解决抑郁症患者的一系列问题。因此，挖掘抗抑郁的有效药物具有重要意义。

研究表明小胶质细胞激活引起的神经炎症在抑郁症的发病过程中扮演着重要角色。小胶质细胞作为中枢神经系统的驻留免疫细胞，可以通过多种途径调控神经元功能，影响患者的各种行为表现。动物实验中，腹腔注射炎症因子诱导剂脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是研究免疫系统激活的条件下行为与生理反应相互关系的模型之一。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的成分，作为一种内毒素，LPS可以激活先天免疫系统并促进促炎性细胞因子的分泌与释放。LPS腹腔注射或脑室注射可引起明显的与抑郁症患者症状相似的抑郁样行为，如快感缺乏和自发活动减少等，而且神经递质和神经内分泌等方面也会受到影响。同时LPS是TLR4的潜在配体，能够激活小胶质细胞表面TLR4蛋白，上调NFκB-p65信号通路，诱发神经炎症。

目前国内外关于中药有效成分的抗抑郁作用已有了大量研究。中药活性成分的组合物具有协同增效作用，在治疗抑郁症方面具有广阔的应用前景。蜂毒是中医蜂疗的重要组成部分,具有显著的药理学和生物学活性。蜂毒是由蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌出的一种带有芳香味易挥发的透明液体混合物，重要成分包括蜂毒肽、蜂毒明肽、透明质酸酶、磷酸酯酶A2、镇静肽等。研究表明蜂毒具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用，且有效成分蜂毒肽和蜂毒明肽能够穿透血脑屏障，对中枢神经系统产生作用。迄今蜂毒肽和蜂毒明肽在抗抑郁方面具有协同作用的研究还未见报导。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种蜂毒肽-蜂毒明肽组合物在制备抗抑郁药物中的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

本发明首先保护一种药物组合物，主要由蜂毒肽、蜂毒明肽组成，所述蜂毒肽和蜂毒明肽的质量比为1-4:1。

作为本申请的优选技术方案，所述蜂毒肽与蜂毒明肽的质量比为2:1。

作为本申请的优选技术方案，还包括一种或多种药学上可接受的载体。

作为本申请的优选技术方案，所述药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

作为本申请的优选技术方案，，还包括另外的治疗剂。

作为本申请的优选技术方案，所述药物组合物为任何一种药剂学上所述的片剂、胶囊、注射剂、散剂或颗粒剂。

本发明还保护提供前述组合物在制备抗抑郁药物中的应用。

与现有技术相比，具有如下有益效果：本发明的组合物中蜂毒肽和蜂毒明肽具有协调增效作用，相比于单用蜂毒肽或蜂毒明肽，蜂毒肽-蜂毒明肽组合物能够显著改善LPS诱导的小鼠抑郁样行为，减轻TLR4介导的炎症信号通路，抑制小胶质细胞激活，改善神经炎症。

附图说明

图1为蜂毒肽-蜂毒明肽组合物对LPS诱导的小鼠抑郁样行为的影响；

图2为蜂毒肽-蜂毒明肽组合物对LPS诱导的小胶质细胞激活标志性蛋白Iba-1表达的影响；

图3为蜂毒肽-蜂毒明肽组合物对LPS诱导的促炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平的影响；

图4为蜂毒肽-蜂毒明肽组合物对LPS诱导的TLR4/NFκB-p65信号通路相关蛋白的影响；

其中，A表示空白组；B表示模型组；C表示蜂毒肽组；D表示蜂毒明肽组；E表示蜂毒肽-蜂毒明肽组(1:1)；F表示蜂毒肽-蜂毒明肽组(2:1)；G表示蜂毒肽-蜂毒明肽组(4:1)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

蜂毒肽-蜂毒明肽组合物对LPS诱导的小鼠抑郁样行为的影响

1.实验方法

1.1动物分组

实验开始前将小鼠适应性喂养3天，然后随机分为7组：空白组(A)、模型组(B)、蜂毒肽(C)、蜂毒明肽(D)、蜂毒肽-蜂毒明肽组(1:1)(E)、蜂毒肽-蜂毒明肽组(2:1)(F)以及蜂毒肽-蜂毒明肽组(4:1)(G)。

1.2LPS诱导的抑郁小鼠模型的建立

各组小鼠采用皮下注射方式进行给药，半小时后采用单次腹腔注射LPS(0.83mg/kg)建立小鼠急性抑郁模型。空白组以及LPS模型组小鼠给予生理盐水，其他各组给予相应药物，给药剂量为0.2mg/kg。LPS刺激24小时后进行行为学检测。

1.3行为学检测

1.3.1糖水偏好实验

正式实验前需对小鼠进行糖水饮用训练，糖水的浓度为1％(W/V)。训练第一天，将两瓶糖水放置于鼠笼上方，让其自由饮水；训练第二天，将一瓶糖水及一瓶饮用水放置于鼠笼上方，让其自由饮水。之后禁食禁水12小时。正式测试时，小鼠单笼饲养，每只鼠给予一瓶糖水和一瓶饮用水，且记录糖水和饮用水的重量，12小时后再次记录糖水和饮用水的重量，计算各组小鼠的蔗糖水、饮用水及总液体的消耗量(g)。糖水偏好率(Sucrose Preference,SP)＝蔗糖水的消耗量(g)/总液体的消耗量(g)×100％。

1.3.2旷场实验

旷场实验的装置由50×50×50cm的白色塑料实验箱构成。进行实验时，将小鼠放置实验箱中，让小鼠自由探索空旷区域，摄像头记录5min内的小鼠行为轨迹。最后统计每只小鼠在中心区域停留时间以及移动总路程。

1.3.3悬尾实验

将小鼠尾尖用胶带固定于水平铁架上，使小鼠倒挂空中，距离实验台面15cm，观察小鼠6min内的行为，并记录后4min内小鼠累计不动时间。不动的判断标准为小鼠无挣扎和任何试图逃离悬挂装置的动作。

1.3.4强迫游泳实验

强迫游泳的装置为圆形塑料桶，桶高30cm，直径为15cm，里面装满水，深度为13cm，温度为37℃。实验时，将小鼠放置桶中，让小鼠自由游泳。观察小鼠6min内的行为，并记录后4min内小鼠累计不动时间。不动的判断标准为小鼠停止挣扎并漂浮在水面上。

2.实验结果

如图1所示，在旷场实验(open field test,OFT)中，与空白组相比，LPS模型组小鼠在旷场中心区域停留时间以及移动总路程显著降低，提前给予蜂毒肽、蜂毒明肽、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(1:1)、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(4:1)后，小鼠的活动轨迹增多，中心区域停留时间及移动总路程增加，蜂毒肽-蜂毒明肽组合物效果显著高于单独给药的蜂毒肽、蜂毒明肽组，其中蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)的作用效果最为明显。

与旷场实验结果一致，在糖水偏好实验(sucrose preference test，SPT)中，给予蜂毒肽、蜂毒明肽、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(1:1)、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(4:1)后，能够显著改善LPS小鼠的糖水消耗率，其中蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)效果最为明显。

在悬尾实验(tail suspension test,TST)以及强迫游泳实验(forced swimmingtest,FST)中，给予蜂毒肽、蜂毒明肽、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(1:1)、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(4:1)后，能够显著减少不动时间，其中蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)效果最为明显。结果提示蜂毒肽、蜂毒明肽以及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物能够逆转LPS引起的小鼠抑郁样行为，且相比于单用蜂毒肽或蜂毒明肽，蜂毒肽-蜂毒明肽组合物的治疗效果更好。

实施例2

蜂毒肽-蜂毒明肽组合物对LPS诱导的小胶质细胞激活的影响

1.实验方法

1.1取全脑

以实施例1的小鼠作为实验对象，采用10％的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠完全麻醉后，用针头固定小鼠四肢，打开胸腔，暴露心脏，采用PBS以及4％多聚甲醛溶液心脏灌流固定脑组织，取出全脑，将脑组织浸泡在4％的多聚甲醛中备用。

1.2免疫荧光染色

将脑组织更换溶液，采用30％的蔗糖溶液脱水，48小时后将脑组织用冰冻切片机进行冰冻切片，切成厚度为15μm的脑片。用0.1％的Triton-100溶液透化脑片20min，然后采用10％的山羊血清封闭2h，之后孵育一抗Iba-1，4℃过夜。用PBS洗3次，孵育荧光二抗Alexa-488及DAPI，封片，共聚焦观察小鼠前额皮层Iba-1的表达。

2.实验结果

如图2所示，与空白组相比，给予LPS刺激后，小鼠前额皮层内小胶质细胞激活标志性蛋白Iba-1表达增加，提前给予蜂毒肽、蜂毒明肽、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(1:1)、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(4:1)后，Iba-1蛋白表达有所下降，其中蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)效果最为明显。结果提示蜂毒肽、蜂毒明肽以及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物能够减轻LPS引起的小胶质细胞激活，且相比于单用蜂毒肽或蜂毒明肽，蜂毒肽-蜂毒明肽组合物的作用效果更好。

实施例3

蜂毒肽-蜂毒明肽组合物对LPS诱导的促炎性细胞因子释放的影响

1.实验方法

1.1组织匀浆制备

实施例1的小鼠行为学结束后，脱颈椎处死，在冰浴上取出前额皮层组织，液氮速冻。将皮层组织与生理盐水按1：9的比例混合，匀浆器研磨，直至看不见组织碎块为止。将匀浆的前额皮层组织保存于4℃冰箱备用。

1.2ELISA实验

采用ELISA试剂盒检测小鼠前额皮层组织中IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量。操作步骤按照试剂盒说明书进行，于532nm波长处测定各孔的OD值，然后根据公式计算出样品中IL-1β、IL-6及TNF-α的蛋白表达含量。表达单位以pg/mgprot来表示。

2.实验结果

如图3所示，与空白组相比，LPS模型组小鼠前额皮层内IL-1β、IL-6及TNF-α的蛋白表达显著升高，提前给予蜂毒肽、蜂毒明肽、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(1:1)、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(4:1)后，这些炎症因子的表达显著下降，其中蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)效果最为明显。结果提示蜂毒肽、蜂毒明肽以及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物能够减轻LPS引起的促炎性细胞因子释放，且相比于单用蜂毒肽或蜂毒明肽，蜂毒肽-蜂毒明肽组合物的作用效果更明显。

实施例4

蜂毒肽-蜂毒明肽组合物对LPS诱导的TLR4/NFκB-p65信号通路的影响

1.实验方法

1.1总蛋白提取

实施例1的小鼠行为学结束后，脱颈椎处死，在冰浴上取前额皮层组织，按重量体积比(1:5)加入含有1％PMSF的RIPA Buffer。于冰浴中手动匀浆5min，使前额皮质组织尽量碾碎，转移至离心管中继续裂解40min后，离心(12000g,4℃,30min)，吸上清。取2μl上清液，用BCA法测定蛋白浓度。向剩余上清中加入体积为其1/4的5×SDS-PAGE Loading Buffer混匀，沸水中煮沸10min后，分装，于-20℃保存备用。

1.2Western blot实验

蛋白样品通过SDS-PAGE凝胶分离，转移到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时并免疫印迹。与抗体TLR4、p65、p-p65及β-actin在4℃条件下孵育过夜。用二抗孵育2小时。用增强化学发光(ECL)检测免疫反应性，并在成像系统中显示。利用Image J对信号进行量化。

2.实验结果

如图4所示，与空白组相比，LPS模型组小鼠前额皮层内TLR4及p-p65蛋白的表达显著升高，提前给予蜂毒肽、蜂毒明肽、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(1:1)、蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(4:1)后，这些蛋白的表达显著下降，其中蜂毒肽-蜂毒明肽组合物(2:1)效果最为明显。结果提示蜂毒肽、蜂毒明肽以及蜂毒肽-蜂毒明肽组合物能够抑制LPS引起的TLR4/NFκB-p65信号通路的激活，且相比于单用蜂毒肽或蜂毒明肽，蜂毒肽-蜂毒明肽组合物的作用效果更明显。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。