一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其应用

摘要

本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其应用。Pm5V基因的CDS序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自簇毛麦(Dasypyrum villosum)。克隆Pm5V基因，扩增引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。本发明所述的具有簇毛麦全生育期广谱抗白粉病的基因Pm5V在抵抗小白粉病，提高小麦抗病性，且携带Pm5V基因的T5DL.5VS易位系农艺性状优良，对产量等重要性状没有负向效应，育种利用价值高。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其应用。

背景技术

小麦是一种世界性粮食作物，其适应性强、分布范围广，为超过三分之一的人类提供主要能量来源，小麦的产量和品质直接关系到全人类的食物安全。由小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp tritici)引起的小麦白粉病是小麦主要的病害之一。它属于专化寄生，可以在整个生育期侵染小麦的叶部、茎秆、穗部等，其中主要危害小麦叶片，严重时影响小麦正常的光合作用，从而影响其正常的生长，降低产量。近十年，我国小麦白粉病发病面积每年在667万hm

抗病基因的挖掘和抗病品种的培育是防治小麦白粉病最可持续的策略。然而单一抗源抗性的频繁丧失，使育种工作总是在被动地追赶病原菌小种的变化，严重制约着小麦产量和品质水平的进一步提高。因此，需要发掘新类型抗源，提高抗病基因的遗传多样性，有利于保持小麦品种抗白粉病的持久性。

全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V定位于簇毛麦01I140染色体臂5VS，高抗我国目前所有白粉菌生理小种(范亚丽，2020)。通过创制小麦-簇毛麦T5DL.5VS易位系，已将Pm5V基因导入普通小麦遗传背景，创制了不同遗传背景的抗病新品系。利用不同T5DL.5VS易位系构建遗传分离群体，对Pm5V基因进行了精细定位分析(穆换清，2021)。进一步对携带Pm5V基因的5VS染色体臂分拣测序，结合定位区间、基因沉默等功能分析，实现了Pm5V基因的图位克隆。携带Pm5V基因的T5DL.5VS易位系农艺性状优良，对产量等重要性状没有负向效应，育种利用价值高，并开发了易于鉴定Pm5V基因的分子标记，将加快该基因的育种利用。

发明内容

本发明的目的是公开一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其育种利用方法。

本发明所述的Pm5V基因的DNA序列位于簇毛麦5VS染色体上，DNA序列全长是3804bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码1267个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的Pm5V基因，扩增引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6。

含有所述的基因Pm5V的重组表达载体。

所述的基因Pm5V在培育抗白粉病小麦品种中的应用。

作为本发明的一种优选，将其携带Pm5V基因的小麦-簇毛麦T5DL.5VS易位系与不携带Pm5V基因的小麦品种杂交，通过分子标记辅助选择，培育携带Pm5V基因的小麦新品种，提高小麦的白粉病抗性；所述的分子标记辅助选择使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物。

作为本发明的另一种优选，将所述的基因Pm5V通过基因工程手段导入易感白粉病小麦品种中，以提高其对白粉病的抗性。

所述的重组表达载体在培育抗白粉病小麦品种中的应用。

一种基因Pm5V的分子标记引物，由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物P1和P2、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成。

所述的分子标记引物在小麦抗白粉病育种中的应用。

有益效果

本发明图位克隆得到了一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V，高抗我国目前所有白粉菌生理小种(图1)。Pm5V用于抗病育种，能够提高小麦品种的白粉病抗性(图10)。携带Pm5V基因的T5DL.5VS易位染色体在小麦背景中不与5DS发生交换重组，Pm5V基因与5VS上的其它优异基因呈单一位点连锁遗传，易位染色体对产量等重要性状没有负向效应，育种利用效率高(图8)。所开发的Pm5V基因的分子标记，易于分子标记辅助选择，将加快该基因的育种利用(图3)。

附图说明

图1用来自不同小麦产区的24个Bgt菌株，对携带Pm5V基因材料TF5V-11进行抗谱分析，发现Pm5V对目前我国白粉菌生理小种均具有抗性。注；白粉病反应型采用0-4级标准，0：免疫；0；：过敏性坏死；1：高度抗性；2：中度抗性；3：中度感病；4：高度感病

图2含有Pm5V基因的高代品系与其轮回亲本NAU0686的主要农艺性状分析，发现携带Pm5V基因的T5DL.5VS易位染色体对主要农艺性状没有显著负向效应。

图3 Pm5V基因的PCR克隆。该基因分2段克隆，第一段标记P1/P2的PCR产物经凝胶电泳后,条带大小为2478bp；第二段标记P3/P4的PCR产物经凝胶电泳后,条带大小为2223bp。

图4利用Q-PCR分析Pm5V等位基因在抗白粉病材料TF5V-11和感白粉病材料TF5V-2中的差异表达，发现仅抗病材料TF5V-11中Pm5V的等位基因受白粉菌诱导表达。0小时：Pm5V在未诱导样品中的相对表达量；8、12、24、36、72小时：Pm5V在白粉菌诱导样品中的相对表达量。

图5利用大麦条纹病毒(VIGS)对Pm5V基因沉默验证，通过对第4片有表型的叶片进行白粉病鉴定，发现Pm5V基因表达量降低后，叶片出现了白粉菌孢子，表明Pm5V基因与白粉病抗性相关。对照分别是1：BSMV:PDS、2：未接种任何病毒的TF5V-11、3：BSMV:γ空，以及3组处理4、5、6：BSMV:γ-Pm5V。

图6 VIGS沉默Pm5V基因效率检测。接种病毒后分别取第4片中出现条纹表型的叶片提取RNA，反转cDNA后，利用qPCR进行基因沉默效率的检测。对照CK是BSMV:γ空，1、2、3、4、5是五个独立单株接种重组病毒BSMV:γ-Pm5V的沉默效率。黑色柱状图表示沉默靶点位于Pm5V CC结构域的5个单株，灰色柱状图表示沉默靶点位于Pm5V NBS结构域的5个单株。接种后Pm5V的表达量均显著降低，表明沉默效率较高。

图7 Pm5V过表达转基因分析。利用过表达启动子ubiquitin与Pm5V全长基因连接，构建农杆菌转基因载体，利用农杆菌侵染转感白粉病品种Fielder，对T

图8携带Pm5V基因材料的GISH/FISH鉴定。利用簇毛麦基因组探针、oligo探针pAs1-1和pAs1-4同时进行GISH和FISH鉴定。显示绿色荧光信号的为簇毛麦染色体，红色荧光信号为pAs1-1和pAs1-4探针信号，主要分布在小麦D组染色体上。参照簇毛麦染色体核型、普通小麦中国春的染色体核型，确定该易位染色体为T5DL.5VS。

图9携带Pm5V基因材料的共显性分子标记鉴定。。利用5VS上特异的共显性分子标记EST-237对所选育材料的叶片DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。TF5V-11扩增出5VS上的特异条带同时缺少5DS上的条带，分子标记与细胞学方法相互验证选育材料携带Pm5V基因。

图10携带Pm5V基因新品系苗期与成株期白粉病鉴定。发现携带Pm5V基因的新品系在苗期和成株期均对接种的白粉菌混合生理小种近免疫，证明了该基因在抗病育种中的利用价值。

具体实施方式

实施例1簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V的克隆、表达分析

为了挖掘簇毛麦全生育期广谱抗白粉病的基因Pm5V，对抗病材料小麦-簇毛麦易位系TF5V-11和感病材料TF5V-2中的5VS染色体臂进行分拣测序并组装到scaffolds水平。利用生物信息学的方法筛选出5VS上的序列并对该序列进行基因注释，获取NLR基因。通过精细定位，结合基因型和表型数据，发现在该区间有一个簇毛麦上特异的NLR基因。初步判断该基因与白粉病抗性具有相关性。

以抗病材料TF5V-11经白粉菌诱导24小时的叶片提取出的RNA反转录成cDNA为模板，由于Pm5V基因序列较长，因此分两段进行PCR扩增。利用该基因序列为模板，对NCBI数据库进行相似性序列比对，设计的特异引物P1(ATGGCTGCCTCTGCTGCATTTGT,SEQ ID NO.3)、P2(GCTTATCAAACTGAGAGATGC,SEQ ID NO.4)、P3(TGGGAACAAGAAGAAAGG,SEQ ID NO.5)和P4(TCAGTATGTTCCATCGGTAC,SEQ ID NO.6)为引物进行PCR扩增，获得了Pm5V的全长基因；其CDS序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。(图3)

利用抗病材料TF5V-11和感病材料TF5V-2经白粉菌诱导0、8、12、24、36、72小时的RNA反转录cDNA为模板，利用P5(CGGGAAAAGGAGAAACAAGAT，SEQ ID NO.7)和P6(TCACACGGGTAGCGGAATGT，SEQ ID NO.8)为引物进行实时荧光定量PCR(Q-PCR)分析。PCR程序为：PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20uLPCR反应体系中含2×SYBR Green PCR Master Mix 10uL，0.5μM引物P3和P4，反转录cDNA模板2uL。扩增参数为：95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平用MyiQ系统软件进行分析。结果表明，在TF5V-11中，Pm5V受白粉菌诱导上调表达，12小时上调显著，24h后表达水平最高，36和72小时表达已下降；在TF5V-2中，Pm5V没有受白粉病诱导表达的特征，各个时间段的表达量均低于在TF5V-11中的表达量(图4)。

实施例2利用基因沉默技术验证Pm5V基因的功能

沉默载体是大麦条纹花叶病毒载体(Xing et al.,2018)。构建流程如下：1、以已经克隆的Pm5V的基因序列为模板，在编码区设计引物P5(CGGGAAAAGGAGAAACAAGAT，SEQ IDNO.9)和P6(TCACACGGGTAGCGGAATGT，SEQ ID NO.8)；P7(GAGTCGAAAGGGATAAGTGT，SEQ IDNO.10)和P8(ATTGCTTTGCAAATGCTCA，SEQ ID NO.11)且引物带有NheI的酶切位点。回收扩增产物后，用限制性内切酶NheI完全酶切。另外，利用限制性内切酶NheI完全酶切γ-PDS载体，切下一个200bp左右的插入片段(为PDS基因序列)以及一个大于2Kb的载体片段。将第1步酶切后的外源基因片段与回收的载体片段连接。连接产物转化感受态α大肠杆菌，涂氨苄抗性的平板，37℃培养12-16h后摇菌提质粒。2、载体线性化：将验证正确的γ重组载体质粒与、γ-PDS病毒载体用MluI酶进行线性化，β载体用SpeI酶切线性化。每种质粒切8μg，分成四管，37℃酶切4小时。3、体外转录：按照RiboMAXTMLarge Scale RNA ProductionSystems-SP6 and T7说明书进行操作。4、转录产物用于涂抹小麦叶片：通过接种γ空、γ-PDS的植株表型鉴定用于验证VIGS沉默体系的成功与否；接种BSMV:Pm5V的植株用于沉默目标基因，目标基因及对照重复两次，每次重复接种12株。接种后喷施DEPC水并置于22℃黑暗保湿培养24h后置于16h/8h的光照/黑暗周期，18-20℃条件下培养。待PDS出现漂白现象后，取四叶期出现病毒表型的叶片同时进行离体鉴定及RNA提取。离体叶片整齐放置在6-BA的培养基上，抖菌法接白粉菌新鲜的孢子，接种6天后观察叶片发病情况。结果表明，接种BSMV:PDS的植物出现光漂白现象且接种白粉菌后叶片表面没有出现白粉孢子，说明该实验沉默体系效果明显；接种BSMV:γ空叶片通过白粉菌离体鉴定后叶片表面没有出现白粉孢子而接种BSMV:Pm5V通过白粉菌离体鉴定后叶片表面却出现肉眼可见的白粉孢子，说明Pm5V基因具有抗白粉病功能(图5)。对提取的RNA进行基因表达分析，每个样品3个生物学重复。结果表明，对Pm5V基因的不同编码区进行沉默，以同时期的BSMV:γ空作为对照，接种重组病毒BSMV:γ-Pm5V的单株(1、2、3、4、5)Pm5V表达量有不同程度的下降，表明Pm5V沉默成功(图6)。

实施例3转基因过表达验证Pm5V基因功能

Pm5V全长序列(3804bp)与玉米ubiquitin(Ubi)启动子连接到plGy-OE3载体上，利用的限制性内切酶分别是Stul和BamH1，构建转基因过表达载体pUbi:Pm5V。通过Sanger测序验证Pm5V基因插入到载体的正确性。pUbi:Pm5V质粒经农杆菌侵染转入感白粉病小麦品种Fielder中，T

实施例4携带Pm5V基因的小麦-簇毛麦T5DL.5VS育种利用

利用TF5V-11为抗病亲本与生产上的丰产品种杂交，利用Pm5V基因标记P1/P2进行分子标记辅助选择，结合白粉病抗性鉴定及农艺性状分析，选育高抗小麦白粉病且农艺性状优良新品系，通过参加区域试验，获得携带Pm5V基因的抗病小麦新品种。并对选育的新品系(种)进行如下鉴定以确定是否携带Pm5V基因。

(1)小麦-簇毛麦T5DL.5VS染色体GISH/FISH鉴定。

利用簇毛麦基因组探针、oligo探针pAs1-1和pAs1-4同时进行GISH和FISH鉴定，结果如图(图8)，显示绿色荧光信号的为簇毛麦染色体，红色荧光信号为pAs1-1和pAs1-4探针信号，主要分布在小麦D组染色体上。参照簇毛麦染色体核型(张伟，2012)、普通小麦中国春的染色体核型(王丹蕊等，2017)，确定该易位染色体为T5DL.5VS。

(2)小麦-簇毛麦T5DL.5VS染色体分子标记鉴定。

利用5VS上特异的共显性分子标记EST-237对所选育材料的叶片DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(图9)。TF5V-11扩增出5VS上的特异条带同时缺少5DS上的条带，分子标记鉴定结合GISH/FISH鉴定，确定选育的材料携带Pm5V基因。

(3)携带Pm5V基因新品系苗期与成株期白粉病鉴定

对选育的新品系(种)再进行苗期和成株期接种鉴定，带Pm5V基因材料全生育期表现近免疫(图10)。苗期鉴定在温室进行，在2叶期接白粉菌混合生理小种，待感病材料发病时，进行病级调查。成株期鉴定在白粉病抗性鉴定圃进行，诱发行与鉴定材料垂直种植。拔节期对诱发行进行混合白粉菌生理小种接种鉴定，抽穗期和灌浆期进行病害调查。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3804

<212> DNA

<213> 簇毛麦(Dasypyrum villosum)

<400> 1

atggctgcct ctgctgcatt tgtttttgca gggaagtctg tggcgacttc ggccatatcc 60

ttcttggtca ccaaggcttt caactacatc gatgagtact gcaagtccga aaacatggat 120

gagttgaaga atcggctcct gcgggccatg ccacatatcc aggcggtgtt cgatgtcgtc 180

aacccggaac ttgtcaggga gcagagcagc ggcctcgacg cgtggctctg gcagctcagg 240

gacgcggtcg aggcggcgga ggacgccatc gatgagcttg aatactacga gctcgaggag 300

aaggccaagg accaaaaggt tagtgaatgg ggttctcctc ttggtaagat gaagcacaag 360

tttgtcagat ctcttggccc tgctgtcaac aagactatca agaaaattag tcaccgtgac 420

actctgaaga gattgatgaa atctgtggat gatttagaca aggctgccat aggtgttggt 480

gattttctaa agctcacaga ccatctcagt ggaggttctt ctaccagcag tcaacagaaa 540

gtgcagaaca atgatcgcca gactggttca acagaaagtg caacaaagtt tattggacgg 600

gaaaaggaga aacaagatat tattggatgg ctagccaaca cgtcagatga attgggtgaa 660

aatggggtca gaaggaccaa aagtattcca attatttcag ttattggtca tggtggcatg 720

gggaagactg ccttggctca gagcatatgt aatcaagatg aggtagtgaa gcattttaag 780

atcatctgga tcaccgtatc tactagcttt gatgcgacct cggtgacaag taaaatacta 840

cattccgcta cccgtgtgaa accaaacact gatcatttgg aaccactaca gcgagatctc 900

gaagagaaac tcaaatccat taagtttttg ctagttatgg atgatgtttg ggaagataag 960

aaaagagatg aatgggagaa gttatttgct cctatgaaga aactgaacac tgttgggagc 1020

aaaattttgt tgacaacccg aatgcaatct gtagcggaca tggctgcaaa ggtgatggga 1080

gtcgaaaggg ataagtgtct gacattacaa ggactagaag atgatgaaaa tctcaagctc 1140

ttcaaccatc atgccttttc cggtttgaat ccaggagatg atgcacattt gaagttaact 1200

ggagaacaaa ttgcaaagaa actaagagga tgtcccttgg taacaaaggt tgtcgctgag 1260

catttgcaaa gcaatataac acctgaatac tggaggagat tcttgcatca aggattggaa 1320

cattttaaag gaaccgaaaa ggatattatg gaagttctca gattgagcta ctaccactta 1380

ccaacagagc tacagatttg ctttcggtac tgttgcctat ttcggcagga ctatatgttt 1440

gaaaagaaag tgttggtgca aatgtggatt ggttctggat tgattgcaag tggcattcaa 1500

tctttggagg ataccgcaga acaattcttg gctcagctaa ctagaaagtc gttctttgat 1560

atgaaaccta taacttgtgg atgggaacaa gaagaaaggt atgtaatgca tgacttgatg 1620

catgaattag caagcaatgt gtccactggt gaatgtgcaa gaatagttga ccctgttcaa 1680

cttcaagatg agaagtatac agtccgacac ctatgcattg tcaatattca caggttctct 1740

gctgatgagg tcaagaaaat ctcccatttt aagaatctgc gcactattat cattgataat 1800

accccgccac ttgaaaatga tactcttcgc gcacttcaaa tgatagttga gacctcaaag 1860

gcactgcgac tattccatgc agaattatgg aacacatccc gttttactgt caattttggt 1920

aacttaaaac atcttcgcta tatccgcgtg agttcgatac cacaaggcaa gatatgtggg 1980

gtcgcaagac tttatcactt gatggtcctt cactatggtt cttccgggac cataatagat 2040

gaagcaagat atttagggaa ccttgaacgt ttgcggtatg tatcctatgg tgtgcatgga 2100

tttggtaatt tccccataag caggctcact tctcttcagg aattacatga ttaccaggta 2160

gaagaaagaa catgcaacca aataagtgca gttgggagct taagagatct tcgtagatta 2220

ggtctgctgg gtcttgagaa tgttaagaat tgtgaagaag ctaagaatgc caagttgaag 2280

gaaaaacaat atctcaactc attatttatg aagtggtcga cacctgacca aatcatgaca 2340

gataacttag ttcttgacca ccttgagcca catgttaata tcaaagaatt gcaaattcag 2400

ggttatccag gtcccaaaat tccatcttgg atggagaaca gctctgtcaa aaatctggca 2460

tctctcagtt tgataagctg cattaattgg gaataccttc cctctctcgg cgagttagta 2520

tttctgaagt ttcttatgtt gaaggacctt cgtaatctaa ggcagattgg tcgatcatct 2580

gatatgtccg gtagtagctc catggagttg ctgttacctc aaagacttga tagtttggaa 2640

gtaaatgaat gccgacaact gagagagtta cctattctac ctccaagcct agtgtcactg 2700

gatataggag atgtttgtct gaccaaactc cctatgattg gcaagatatc aagtgggaac 2760

atcgagccga aatcatctaa gttgaatgag atagttatca ccaactgtcc atgcttaagt 2820

tcgctggaag ggagcctttt ggagcaaaaa ttgcacatgg gaactctcca tatcctaaca 2880

attaataatt gtcaggatct ccaatccgcc cccataccat ttgaagaaat gaaagagctt 2940

aaggatctga caatacggga atgtccaaag ttgaggacgt tgagagatgg caaagataag 3000

cttgtgccat catcactaag agggcttact attggccggt gtggtgacct ggaacttcca 3060

ctacttgagt cactccaact gctcaccaac ttatctcatc ttgggctgca caactgctcg 3120

agtctggtgt ctctcccctc cgggaatgta ttcaagagtc tcaggttgct gcagagcatg 3180

cacatagagg aatgcgagaa tctctcgtcc ttgggaggtc tcggatcact tccaaccctc 3240

tattacttag caattagggg gtgcggtaaa ctcgcggagg ctgggtcctc ctcgctaact 3300

cgagttgcat ctggttccag tggcgagcat ctggtggagc ccagtagctc actggagata 3360

acaaatcttg acattgatct gtcgtccctg ctgcatcttg agccacttaa gagtctctgc 3420

cgcaccaaat atttgtgtat taacactgtg tcagagatgg atagcttacc tgaactatgg 3480

ctgctacaga atcgttcatc gctcagatgg ctgactatac acaaagcaga ttccttgaga 3540

tcgctcccac ccagaatgca agacctctgc tctctctcgc aattgagcct tgatgctggg 3600

caactccagt caattccata tctgccctcc tccttgaaga ccctttttct tccaggatgc 3660

catccagacc tggagaagaa gcttacgaaa catggaagcc ctgaatggaa caagattgct 3720

caaatccctt atgcggaaat aggtaccttc actctgccac tctcatcctc ttatttactg 3780

ctctgtaccg atggaacata ctga 3804

<210> 2

<211> 1267

<212> PRT

<213> 簇毛麦(Dasypyrum villosum)

<400> 2

Met Ala Ala Ser Ala Ala Phe Val Phe Ala Gly Lys Ser Val Ala Thr

1 5 10 15

Ser Ala Ile Ser Phe Leu Val Thr Lys Ala Phe Asn Tyr Ile Asp Glu

20 25 30

Tyr Cys Lys Ser Glu Asn Met Asp Glu Leu Lys Asn Arg Leu Leu Arg

35 40 45

Ala Met Pro His Ile Gln Ala Val Phe Asp Val Val Asn Pro Glu Leu

50 55 60

Val Arg Glu Gln Ser Ser Gly Leu Asp Ala Trp Leu Trp Gln Leu Arg

65 70 75 80

Asp Ala Val Glu Ala Ala Glu Asp Ala Ile Asp Glu Leu Glu Tyr Tyr

85 90 95

Glu Leu Glu Glu Lys Ala Lys Asp Gln Lys Val Ser Glu Trp Gly Ser

100 105 110

Pro Leu Gly Lys Met Lys His Lys Phe Val Arg Ser Leu Gly Pro Ala

115 120 125

Val Asn Lys Thr Ile Lys Lys Ile Ser His Arg Asp Thr Leu Lys Arg

130 135 140

Leu Met Lys Ser Val Asp Asp Leu Asp Lys Ala Ala Ile Gly Val Gly

145 150 155 160

Asp Phe Leu Lys Leu Thr Asp His Leu Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ser

165 170 175

Ser Gln Gln Lys Val Gln Asn Asn Asp Arg Gln Thr Gly Ser Thr Glu

180 185 190

Ser Ala Thr Lys Phe Ile Gly Arg Glu Lys Glu Lys Gln Asp Ile Ile

195 200 205

Gly Trp Leu Ala Asn Thr Ser Asp Glu Leu Gly Glu Asn Gly Val Arg

210 215 220

Arg Thr Lys Ser Ile Pro Ile Ile Ser Val Ile Gly His Gly Gly Met

225 230 235 240

Gly Lys Thr Ala Leu Ala Gln Ser Ile Cys Asn Gln Asp Glu Val Val

245 250 255

Lys His Phe Lys Ile Ile Trp Ile Thr Val Ser Thr Ser Phe Asp Ala

260 265 270

Thr Ser Val Thr Ser Lys Ile Leu His Ser Ala Thr Arg Val Lys Pro

275 280 285

Asn Thr Asp His Leu Glu Pro Leu Gln Arg Asp Leu Glu Glu Lys Leu

290 295 300

Lys Ser Ile Lys Phe Leu Leu Val Met Asp Asp Val Trp Glu Asp Lys

305 310 315 320

Lys Arg Asp Glu Trp Glu Lys Leu Phe Ala Pro Met Lys Lys Leu Asn

325 330 335

Thr Val Gly Ser Lys Ile Leu Leu Thr Thr Arg Met Gln Ser Val Ala

340 345 350

Asp Met Ala Ala Lys Val Met Gly Val Glu Arg Asp Lys Cys Leu Thr

355 360 365

Leu Gln Gly Leu Glu Asp Asp Glu Asn Leu Lys Leu Phe Asn His His

370 375 380

Ala Phe Ser Gly Leu Asn Pro Gly Asp Asp Ala His Leu Lys Leu Thr

385 390 395 400

Gly Glu Gln Ile Ala Lys Lys Leu Arg Gly Cys Pro Leu Val Thr Lys

405 410 415

Val Val Ala Glu His Leu Gln Ser Asn Ile Thr Pro Glu Tyr Trp Arg

420 425 430

Arg Phe Leu His Gln Gly Leu Glu His Phe Lys Gly Thr Glu Lys Asp

435 440 445

Ile Met Glu Val Leu Arg Leu Ser Tyr Tyr His Leu Pro Thr Glu Leu

450 455 460

Gln Ile Cys Phe Arg Tyr Cys Cys Leu Phe Arg Gln Asp Tyr Met Phe

465 470 475 480

Glu Lys Lys Val Leu Val Gln Met Trp Ile Gly Ser Gly Leu Ile Ala

485 490 495

Ser Gly Ile Gln Ser Leu Glu Asp Thr Ala Glu Gln Phe Leu Ala Gln

500 505 510

Leu Thr Arg Lys Ser Phe Phe Asp Met Lys Pro Ile Thr Cys Gly Trp

515 520 525

Glu Gln Glu Glu Arg Tyr Val Met His Asp Leu Met His Glu Leu Ala

530 535 540

Ser Asn Val Ser Thr Gly Glu Cys Ala Arg Ile Val Asp Pro Val Gln

545 550 555 560

Leu Gln Asp Glu Lys Tyr Thr Val Arg His Leu Cys Ile Val Asn Ile

565 570 575

His Arg Phe Ser Ala Asp Glu Val Lys Lys Ile Ser His Phe Lys Asn

580 585 590

Leu Arg Thr Ile Ile Ile Asp Asn Thr Pro Pro Leu Glu Asn Asp Thr

595 600 605

Leu Arg Ala Leu Gln Met Ile Val Glu Thr Ser Lys Ala Leu Arg Leu

610 615 620

Phe His Ala Glu Leu Trp Asn Thr Ser Arg Phe Thr Val Asn Phe Gly

625 630 635 640

Asn Leu Lys His Leu Arg Tyr Ile Arg Val Ser Ser Ile Pro Gln Gly

645 650 655

Lys Ile Cys Gly Val Ala Arg Leu Tyr His Leu Met Val Leu His Tyr

660 665 670

Gly Ser Ser Gly Thr Ile Ile Asp Glu Ala Arg Tyr Leu Gly Asn Leu

675 680 685

Glu Arg Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Gly Val His Gly Phe Gly Asn Phe

690 695 700

Pro Ile Ser Arg Leu Thr Ser Leu Gln Glu Leu His Asp Tyr Gln Val

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Glu Glu Arg Thr Cys Asn Gln Ile Ser Ala Val Gly Ser Leu Arg Asp

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Leu Arg Arg Leu Gly Leu Leu Gly Leu Glu Asn Val Lys Asn Cys Glu

740 745 750

Glu Ala Lys Asn Ala Lys Leu Lys Glu Lys Gln Tyr Leu Asn Ser Leu

755 760 765

Phe Met Lys Trp Ser Thr Pro Asp Gln Ile Met Thr Asp Asn Leu Val

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Leu Asp His Leu Glu Pro His Val Asn Ile Lys Glu Leu Gln Ile Gln

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Gly Tyr Pro Gly Pro Lys Ile Pro Ser Trp Met Glu Asn Ser Ser Val

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Lys Asn Leu Ala Ser Leu Ser Leu Ile Ser Cys Ile Asn Trp Glu Tyr

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Leu Pro Ser Leu Gly Glu Leu Val Phe Leu Lys Phe Leu Met Leu Lys

835 840 845

Asp Leu Arg Asn Leu Arg Gln Ile Gly Arg Ser Ser Asp Met Ser Gly

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Ser Ser Ser Met Glu Leu Leu Leu Pro Gln Arg Leu Asp Ser Leu Glu

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Val Asn Glu Cys Arg Gln Leu Arg Glu Leu Pro Ile Leu Pro Pro Ser

885 890 895

Leu Val Ser Leu Asp Ile Gly Asp Val Cys Leu Thr Lys Leu Pro Met

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Ile Gly Lys Ile Ser Ser Gly Asn Ile Glu Pro Lys Ser Ser Lys Leu

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Asn Glu Ile Val Ile Thr Asn Cys Pro Cys Leu Ser Ser Leu Glu Gly

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Ser Leu Leu Glu Gln Lys Leu His Met Gly Thr Leu His Ile Leu Thr

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Ile Asn Asn Cys Gln Asp Leu Gln Ser Ala Pro Ile Pro Phe Glu Glu

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Met Lys Glu Leu Lys Asp Leu Thr Ile Arg Glu Cys Pro Lys Leu Arg

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Leu Gln Leu Leu Thr Asn Leu Ser His Leu Gly Leu His Asn Cys Ser

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Ser Leu Val Ser Leu Pro Ser Gly Asn Val Phe Lys Ser Leu Arg Leu

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Leu Gln Ser Met His Ile Glu Glu Cys Glu Asn Leu Ser Ser Leu Gly

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Gly Leu Gly Ser Leu Pro Thr Leu Tyr Tyr Leu Ala Ile Arg Gly Cys

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Gly Lys Leu Ala Glu Ala Gly Ser Ser Ser Leu Thr Arg Val Ala Ser

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Gly Ser Ser Gly Glu His Leu Val Glu Pro Ser Ser Ser Leu Glu Ile

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Thr Asn Leu Asp Ile Asp Leu Ser Ser Leu Leu His Leu Glu Pro Leu

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Lys Ser Leu Cys Arg Thr Lys Tyr Leu Cys Ile Asn Thr Val Ser Glu

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Arg Met Gln Asp Leu Cys Ser Leu Ser Gln Leu Ser Leu Asp Ala Gly

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Gln Leu Gln Ser Ile Pro Tyr Leu Pro Ser Ser Leu Lys Thr Leu Phe

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Leu Pro Gly Cys His Pro Asp Leu Glu Lys Lys Leu Thr Lys His Gly

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Ser Pro Glu Trp Asn Lys Ile Ala Gln Ile Pro Tyr Ala Glu Ile Gly

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