赤芝二醇和甘油-3-磷酸胆碱作为生物标志物在检验木瓜热处理有效性中的应用

摘要

本发明提供了一种赤芝二醇和甘油‑3‑磷酸胆碱作为生物标志物在检验木瓜热处理有效性中的应用，属于代谢组学检测技术领域。本发明通过代谢组学检测，以赤芝二醇和甘油‑3‑磷酸胆碱作为生物标志物，并进行数据分析，即可准确、直观的确定木瓜果实是否进行了有效热处理。判别是否进行热处理，且热处理是否有效，仅需要对比热处理前、后木瓜果实赤芝二醇和甘油‑3‑磷酸胆碱是否有显著差异，且该两种物质的物质浓度的Log2的折叠倍数的绝对值是否＞1即可。

说明书

技术领域

本发明属于代谢组学检测技术领域，尤其涉及一种赤芝二醇和甘油-3-磷酸胆碱作为生物标志物在检验木瓜热处理有效性中的应用。

背景技术

木瓜，是番木瓜科常绿软木性乔木，原产墨西哥，17世纪时传入我国，是一种在热带、亚热带地区广泛种植的果树，近年来，在我国南方的种植面积越来越大。木瓜全身是宝，既是名果又是特殊的原料作物。果实含糖、蛋白质、钙和多种维生素，尤其是维生素A、维生素B、维生素C等含量丰富，还具有正气、助消化、治胃病的作用。其青果中含的木瓜酶在医学、化妆和食品工业中都有广泛应用。木瓜可加工成各种制品，青果还可作蔬菜食用也是很好的家禽饲料。

热处理是指果蔬采摘后经过适宜温度的处理，抑制病原菌的产生，调节果蔬内部酶活性，提高果蔬抗逆性，最终使得果蔬在贮臧过程中保持良好的保鲜品质。由于热处理具有耗能少、投资少、简单有效、无毒无农残等优点，已经成为国内外广泛研究的一种物理保鲜技术。在木瓜、香蕉、桃、芒果、草莓、苹果等多种水果上均产生了有效的保鲜效果。虽然热处理对果实品质、软化、抗病性方面具有有益效果，但要注意的是，在实际应用中，会由于果实品种、成熟度甚至其贮藏条件的不同，要选择适宜的热处理条件，才可以达到延长果实保藏期的效果。而如何有效、准确、快速的检测果蔬、尤其木瓜果实是否进行了有效的热处理，当前技术中并未有相关研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种赤芝二醇和甘油-3-磷酸胆碱作为生物标志物在检验木瓜热处理有效性中的应用和检测方法，以赤芝二醇和甘油-3-磷酸胆碱作为生物标志物，对木瓜热处理前、后的果实品质进行检测，准确判断木瓜热处理的有效性。

为了实现上述发明目的，本发明提供了赤芝二醇和甘油-3-磷酸胆碱作为生物标志物在检验木瓜热处理有效性中的应用。

本发明还提供了一种检测木瓜热处理有效性的方法，包括以下技术方案：对热处理前、后的木瓜果实材料进行代谢组学检测以及OPLS-DA分析，采用t-test检测，当赤芝二醇和甘油-3-磷酸胆碱有显著差异，且两种物质的物质浓度的Log

优选的是，所述代谢组学检测为GC-MS分析。

更优选的是，所述GC-MS分析条件为：

色谱条件：Waters UPLC液相色谱柱，液相色谱A相为含0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；柱温箱温度为40℃，自动进样器温度为4℃，进样体积为2μL；

质谱条件：ESI离子源，以多反应监测MRM模式进行质谱分析。

本发明还提供了一种筛选木瓜热处理有效性生物标志物的方法，包括以下步骤：准备待热处理组和对照组木瓜果实，对待热处理组木瓜果实进行热处理，分别对热处理后木瓜果实和对照组木瓜果实进行代谢组学检测，并进行OPLS-DA分析，筛选差异性代谢物；采用t-test检测，筛选对照组与热处理组间代谢物含量有显著差异，以Log

优选的是，所述待热处理组和对照组木瓜果实大小均一、成熟度一致。

优选的是，所述热处理采用交变湿热升温程序，待果心温度达到47.2℃后，持续处理60min。

优选的是，所述代谢组学检测为GC-MS分析。

更优选的是，所述GC-MS分析条件为：

色谱条件：Waters UPLC液相色谱柱，液相色谱A相为含0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；柱温箱温度为40℃，自动进样器温度为4℃，进样体积为2μL；

质谱条件：ESI离子源，以多反应监测MRM模式进行质谱分析。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了赤芝二醇和甘油-3-磷酸胆碱作为生物标志物在检验木瓜热处理有效性中的应用及相应的检测木瓜热处理有效性的方法，本发明通过代谢组学检测，以赤芝二醇和甘油-3-磷酸胆碱作为生物标志物，并进行数据分析，即可准确、直观的确定木瓜果实是否进行了有效热处理。

因此，判别是否进行热处理，且热处理是否有效，仅需要对比热处理前、后木瓜果实赤芝二醇和甘油-3-磷酸胆碱是否有显著差异，且该两种物质的物质浓度的Log

附图说明

图1：木瓜热处理前、后OPLS-DA得分图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、木瓜热处理

选择大小均一，质量在700-900g七成熟海南木瓜果实(表面光滑、色泽均一，表面无擦伤、病害斑或流胶)。使用水果热处理箱对木瓜进行强制热空气处理，采用交变湿热升温程序(见表1)，同时使用温度记录仪监测记录木瓜的果心温度。

表1交变湿热升温程序

打开水果热处理箱后，放入木瓜，待果心温度达到47.2℃后，持续处理60min。对照组木瓜置于室温(25℃)条件下。

处理结束后将处理组和对照组的木瓜放入温度为25℃的水箱(1L)中进行水冷处理，当果心温度降至室温后(大约为30min)，放入次氯酸钠溶液(浓度50ppm)中消毒2-5min，取出晾干，进行取样。热处理组和对照组的样本均用液氮进行速冻，储存于-80℃冰箱。试验每个处理5个重复。

2、样本的代谢组前处理

将样本进行冷冻干燥处理后再进行研磨(50Hz，60s)；称取20mg的样本到离心管中，加两小钢珠，加入提取液(甲醇水，体积比3:1，-40℃预冷，含内标L-2-氯苯丙氨酸)500μL；涡旋30s，35Hz匀浆4min，冰水浴超声5min；重复匀浆超声3次；在混匀仪上4℃过夜；将样本4℃，12000rpm(离心力13800(×g)，半径8.6cm)离心15min；小心地取上清经0.22μm微孔滤膜过滤；每个样本各取30μL混合成QC样本；-80℃储存直到上机检测。

3、木瓜样本代谢组GC/MS分析

色谱仪条件参数：本项目使用EXION LC System(SCIEX)超高效液相色谱仪，通过Waters UPLC液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为含0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈。柱温箱温度为40℃，自动进样器温度为4℃，进样体积为2μL。

Sciex QTrap 6500质谱仪器参数设置：本项目使用装备IonDrive Turbo VESI离子源的SCIEX 6500QTRAP+三重四极杆质谱仪，以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下：IonSprayVoltage:+5500/-4500V,Curtain Gas:35psi,Temperature:400℃,Ion Source Gas 1:60psi,Ion Source Gas 2:60psi,DP:±100V。

4、数据处理

本项目中，所有质谱数据采集及目标化合物定量分析工作，均通过SCIEX AnalystWork Station Software(Version 1.6.3)来完成。使用MSconventer软件将质谱原始转成TXT格式。再使用自撰写R程序包结合自建数据库完成提峰、注释等工作。

5、正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)

采用正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)过滤与模型分类不相关信号即正交信号，建立可靠的OPLS-DA模型。模型质量参数为：R

6、差异性代谢物及其结构鉴定

由于过滤掉了不相关的正交信号，因而获得的差异性代谢物更加可靠。采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t检验(t-test)的p值(阈值0.05)来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索NIST商业数据库(比较质谱和色谱保留时间RT或保留指数RI)，以及采用标准物质数据比对确定。

因此，该方法可以将热处理组与对照组之间的差异性分开，灵敏度和特异性高，代谢物达到84个，其中56个代谢物下降，28个代谢物上升(见表2)，确认了热处理组和对照组的代谢差异，可用于木瓜热处理有效性检测。在以后的检测中，只需要针对表2中的这84个代谢物进行以上代谢组学检测以及OPLS-DA分析即可。

表2热处理组与对照组之间的差异性代谢物

*热处理组与对照组均值之比的对数值(以2为底)，正号表示热处理组相对于对照组上升，负号表示下降。

在以上方案的基础上，从上述84种差异性代谢物之中进一步筛选出能够代表有效热处理的生物标志物，以在保证检测准确性的基础上，更进一步地简化检测程序。

7、代谢组学GC-MS分析后物质峰值鉴别热处理的ROC曲线分析及生物标志物质鉴定

根据代谢组学检测结果，热处理的诊断采用t-test检测，筛选对照与热处理组间有显著差异(P＜0.05)，以Log

如表3所示，热处理组中，代谢物质赤芝二醇(Lucidadiol)和甘油-3-磷酸胆碱(Glycerophosphocholine)经过ROC分析后AUC分别为0.96和1.00，且t-test检验P值＜0.5，Log

表3ROC曲线分析鉴别的热处理生物标志物质

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。