一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用。本发明首先构建了表达犬白介素6的重组质粒，将所述重组质粒导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，筛选得到稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株，所述细胞株传代培养20次仍可稳定表达犬白介素6蛋白，且细胞株表达犬白介素6蛋白的能力不受冻存及复苏的影响；所述细胞株表达犬白介素6蛋白是将犬白介素6蛋白分泌至细胞上清，纯化更方便，所得纯化蛋白更接近天然蛋白分子，具备促进淋巴细胞增殖的生物活性，可作为佐剂增强疫苗的免疫效果。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物免疫学技术领域，具体地，涉及一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用。

背景技术

白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)，最初被描述为B细胞刺激因子，现在被称为多效性细胞因子，属于细胞因子网络中的重要成员。IL-6可由T细胞、B细胞、单核巨噬细胞及内皮细胞等分泌，又可促进多种细胞的生长和分化。IL-6在急性炎症反应中处于中心地位，可介导肝脏的急性期反应，刺激C反应蛋白(CRP)和C纤维蛋白原的生成。IL-6具有致炎和抗炎的双向功能，它的作用与组织中的含量有关。当机体内的IL-6水平属于正常水平，则对机体有利；反之高水平会引起一系列炎性损害。有研究表明，在炎症、感染和患有某些肿瘤等情况下，血清中IL-6的含量会有不同程度上升，且IL-6水平与患者预后密切相关。

IL-6属于Th2型细胞因子，可以介导各种免疫应答，能够刺激活化后期的B细胞大量合成分泌型抗体，刺激T细胞增殖，还能够与IL-2、TNF-α等细胞因子相互诱生，共同构成复杂的细胞因子网络，从而同时提高机体的体液免疫和细胞免疫水平，在机体的抗感染免疫反应中起着重要的作用。因此，IL-6常作为分子佐剂增强疫苗的免疫应答效应。而现有技术中利用犬IL-6的是将犬IL-6的基因与病毒基因结合，如中国发明专利CN106967691A以狂犬病毒rHEP-Flury为亲本毒株基础上，插入了犬IL-6基因的重组狂犬病病毒，从而产生比亲本株介导更强的免疫应答，诱导机体产生更高的中和抗体。但是，IL6作为一种炎症因子，过量表达或使用会会引起过度的炎症反应而损害机体，因此，有必要研究单独的犬IL-6蛋白是否可以作为佐剂，并通过控制犬IL-6蛋白作为佐剂的用量避免IL6过表达导致的影响。现有技术虽然有利用犬IL-6重组质粒表达犬IL-6蛋白，如中国发明专利CN113376380A，利用pET-IL6重组质粒转染并表达犬IL-6蛋白，然而其利用的是大肠杆菌原核表达系统，犬IL-6蛋白的获得方法比较复杂，操作步骤多，因此有必要提供一种更方便的犬IL-6蛋白的获得方法。

发明内容

为了解决现有技术中犬IL-6蛋白的制备方法的缺陷和不足，提供一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用。

本发明的目的在于提供一种表达犬白介素6的重组质粒。

本发明的目的还在于提供一种稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株的制备方法。

本发明的目的还在于提供所述制备方法制备得到的细胞株。

本发明的目的还在于提供利用所述细胞株在制备犬白介素6蛋白中的应用。

本发明的目的还在于提供一种制备犬白介素6蛋白的方法。

本发明的目的还在于提供所述方法制备得到的犬白介素6蛋白。

本发明的目的还在于提供犬白介素6蛋白在促进淋巴细胞增殖中的应用。

本发明的目的还在于提供所述犬白介素6蛋白在制备犬类疾病治疗药物中应用。

本发明首先构建了表达犬白介素6的重组质粒，将所述重组质粒导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，筛选得到稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株，所述细胞株传代培养20次仍可稳定表达犬白介素6蛋白，且细胞株表达犬白介素6蛋白的能力不受冻存及复苏的影响；所述细胞株表达犬白介素6蛋白是将犬白介素6蛋白分泌至细胞上清，纯化更方便，所得纯化蛋白更接近天然蛋白分子。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

一种表达犬白介素6的重组质粒，连接有核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示基因片段的表达载体。

优选地，所述表达载体为pcDNA3.1(+)。

优选地，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

所述重组质粒的构建方法，以核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的序列为模板，利用引物合成犬白介素6(犬IL-6)基因，将犬IL-6基因和表达载体分别用限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切，将酶切后的犬IL-6基因片段和表达载体用T4连接酶连接即得重组质粒；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

所述重组质粒在制备犬白介素6蛋白中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株的制备方法，包括以下步骤：将所述重组质粒导入哺乳动物细胞系；并进行加压筛选和单克隆筛选；对加压筛选和单克隆筛选得到细胞株进行鉴定，即得到表达犬白介素6蛋白的细胞株。

优选地，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢细胞系。

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统，与其他蛋白表达系统相比，该系统具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；具有产物胞外分泌功能，且很少分泌自身的内源蛋白，便于产物分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；可贴壁生长，也可悬浮生长，适合大规模培养。

优选地，所述加压筛选及单克隆的细胞筛选的筛选试剂为遗传霉素(G418)。

优选地，所述加压筛选的培养基中遗传霉素的终浓度为700μg/mL～900μg/mL；所述单克隆筛选的培养基中遗传霉素的终浓度为350μg/mL～450μg/mL。

更优选地，所述加压筛选的培养基中遗传霉素的终浓度为800μg/mL；所述克隆筛选的培养基中遗传霉素的终浓度为400μg/mL。

优选地，所述单克隆筛选鉴定的步骤共重复2～3次。

更优选地，所述单克隆筛选鉴定的步骤共重复3次。

利用所述制备方法制得的稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株也应在本发明的保护范围之内。所述细胞株能稳定表达犬白介素6蛋白。

所述细胞株在制备犬白介素6蛋白中的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种制备犬白介素6蛋白的方法，包括以下步骤：培养所述细胞株；收集细胞上清；过滤，利用层析柱纯化，即得的犬白介素6蛋白。

优选地，培养所述细胞株至细胞长满单层后，收集细胞上清。

优选地，所述过滤是以0.2～0.3μm无菌滤器过滤。

进一步优选地，所述过滤是以0.22μm无菌滤器过滤。

优选地，所述利用层析柱纯化的过程中所用的平衡液为含有终浓度为0～40mM咪唑的磷酸缓冲液。

更优选地，所述利用层析柱纯化的过程中所用的平衡液为含有终浓度为40mM咪唑的磷酸缓冲液。

优选地，所述利用层析柱纯化的过程中所用的洗脱液为含有终浓度为500mM咪唑的磷酸缓冲液。

优选地，所述利用层析柱纯化的过程中，采用线性梯度洗脱法洗脱蛋白。

利用所述方法制备得到的犬白介素6蛋白也在本发明的保护范围之内。

所述犬白介素6蛋白在促进淋巴细胞增殖中的应用也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述应用中犬白介素6蛋白的浓度为0.5～10×10

所述犬白介素6蛋白在作为免疫增强类佐剂和/或制备预防或治疗犬类疾病的药物中应用也在本发明的保护范围之内。

一种预防或治疗犬类疾病的药物，包含所述犬白介素6蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种表达犬白介素6的重组质粒，所述重组质粒导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，筛选得到稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株，所述细胞株传代培养20次仍可稳定表达犬白介素6蛋白，且细胞株表达犬白介素6蛋白的能力不受冻存及复苏的影响，本发明的细胞株将犬IL-6蛋白分泌至细胞上清，便于纯化，所得纯化蛋白更接近天然蛋白分子，具备促进淋巴细胞增殖的生物活性，可作为佐剂增强疫苗的免疫效果。

附图说明

图1为重组质粒单菌落菌液PCR鉴定结果；M为DL2000的marker；1～5均为重组质粒转化后在平板上挑取的单菌落；6为以水作为模板的阴性对照。

图2为重组质粒双酶切鉴定结果；M为DL10000的marker；1为PCR鉴定正确的单菌落的质粒；2为以水作为模板的阴性对照。

图3为pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染细胞后加压筛选第6天的细胞生长情况，为显微镜10倍镜下观察结果。

图4为各组细胞中犬IL-6基因mRNA转录情况；M为marker；1以CHO正常细胞组细胞cDNA为模板；2以pcDNA3.1(+)空载转染组细胞cDNA为模板；3以pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组细胞cDNA为模板；4以水作为模板(阴性对照)。

图5为各组细胞表达犬IL-6蛋白的Western-blotting分析结果；1为CHO正常细胞组细胞上清；2为pcDNA3.1(+)空载转染组细胞上清；3、4为pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组细胞上清；5为CHO正常细胞组细胞；6为pcDNA3.1(+)空载转染组细胞；7、8为pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组细胞。

图6为第一次亚克隆获得的单克隆的细胞株犬IL-6蛋白表达情况鉴定结果；1～14分别指14株单克隆的细胞株的上清。

图7为第三次筛选获得的阳性单克隆的细胞株的不同代次单克隆的细胞株犬IL-6蛋白表达情况鉴定结果；1为第1代细胞上清；2为第5代细胞上清；3为第10代细胞上清；4为第15代细胞上清；5为第20代细胞上清。

图8为冻存前后单克隆的细胞株犬IL-6蛋白表达情况鉴定结果；1、3为细胞株冻存前的细胞上清；2为1细胞株冻存2个月后再复苏的细胞上清；4为2细胞株冻存2个月后再复苏的细胞上清。

图9为犬IL-6蛋白纯化的SDS-PAGE分析结果；a使用不含咪唑的磷酸盐缓冲液作为平衡液；b使用含40mM咪唑的磷酸盐缓冲液作为平衡液；a、b中M为蛋白marker；1为待纯化的蛋白液；2为上样流穿液；3为蛋白洗脱液。

图10为犬IL-6蛋白纯化的Western-blotting分析结果；1为待纯化的蛋白液；2为上样流穿液；3为蛋白洗脱液。

图11为犬IL-6蛋白浓度与淋巴细胞活力的线性关系图；a为浓度0.5～5ng/mL的犬IL-6蛋白与淋巴细胞活力的线性关系图；b为浓度1～20μg/mL的犬IL-6蛋白与淋巴细胞活力的线性关系图。

图12为实验犬体内的中和抗体水平变化。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 pcDNA3.1-CaIL6重组质粒的构建

1.扩增引物的设计及合成

根据核苷酸序列如SEQ ID NO:1(624bp)所示的犬白介素6(IL-6)基因，设计扩增引物IL-6-F和IL-6-R，引物序列如表1所示。引物IL-6-F及IL-6-R由生工生物上海股份有限公司(广州分部)合成。

表1

注：IL-6-F序列中划线+斜杠部分为Hind III酶切位点，划线部分为信号肽序列，IL-6-R序列中划线+斜杠部分为BamHI酶切位点，划线部分为六组氨酸标签序列。

2.犬IL-6基因的扩增

以核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列为模板，利用引物IL-6-F和IL-6-R进行PCR扩增。反应体系(25μL)为：IL-6-F(10μM)，0.5μL；IL-6-R(10μM)，0.5μL；2×Taq酶，13μL；模板，2μL；ddH

使用Magen公司的凝胶回收试剂盒(HiPure Gel Pure DNA Micro Kit)，参照使用说明书对PCR产物进行胶回收、纯化，即得到纯化的PCR产物。

3.酶切连接

使用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ分别对pcDNA3.1(+)质粒和上一步所得纯化的PCR产物进行双酶切。酶切体系(20μL)为：10×Green buffer，2μL；HindⅢ，1μL；BamHⅠ，1μL；pcDNA3.1(+)质粒，4μL(纯化的PCR产物，4μL)；ddH

使用T4 DNA酶连接IL-6基因片段(SEQ ID NO：5)和酶切后的pcDNA3.1(+)质粒。连接体系(20μL)为：10×T4 DNA Ligasebuffer(10×)，2μL；T4 DNALigase，1μL；酶切后的pcDNA3.1(+)质粒，1μL；IL-6基因片段(SEQ ID NO：5)，0.7μL；ddH

4.转化及鉴定

将重组质粒转化至DH5α感受态细胞中。挑取平板上的单菌落，利用IL-6的特异性引物IL-6-F及IL-6-R对单菌落菌液进行PCR鉴定。重组质粒单菌落菌液PCR鉴定结果如图1所示，图1中M为DL2000的marker，1～5均为重组质粒转化后在平板上挑取的单菌落，6为以水作为模板的阴性对照；从图1可知，挑取的5个单菌落经PCR扩增均在717bp出现条带，且条带与预期大小一致。

参照Magen公司质粒抽提试剂盒说明书对PCR鉴定正确的单菌落的菌液进行质粒提取，用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶对质粒进行鉴定。重组质粒双酶切鉴定结果如图2所示，M为DL10000的marker；1为PCR鉴定正确的单菌落的质粒；2为以水作为模板的阴性对照；从图2可知，重组质粒经双酶切后，凝胶电泳检测共有2条长度不同的条带，一条长约717bp，另一条长约5410bp，均与预期大小一致。

将经PCR和双酶切鉴定正确的重组质粒送交生物工程(上海)股份有限公司广州分公司进行序列测定。将测序正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-CaIL6重组质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)。

实施例2稳定表达犬IL-6蛋白的CHO细胞株的构建

1.细胞转染

参照Qiagen公司质粒中量提取试剂盒说明书，提取pcDNA3.1-CaIL6去内毒素质粒，保存于-20℃。

将中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)以1×10

待CHO细胞的生长密度达到60％～80％，即可进行转染。转染前，用1×PBS洗涤细胞一次，再加入1mL含10％胎牛血清(v/v％)及青链霉素(100IU/mL)的RPMI-1640培养基，放回培养箱继续培养。

使用Thermo Fisher的Lipofectamine

表2

将配制好的工作溶液A液和B液分别用涡旋振荡混匀，再将工作溶液B液加入到A液中，混匀，所得混合液于室温静置10min。

以B液中添加pcDNA3.1-CaIL6重组质粒的作为pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组；以B液中添加pcDNA3.1(+)质粒的作为pcDNA3.1(+)空载转染组；以B液中不添加质粒的作为CHO正常细胞组。

以250μL/孔向6孔板细胞中分别加入各组混合液，置于5％CO

2.加压筛选

配制加压筛选培养基：以RPMI-1640培养基作为基础培养基，制备含有10％胎牛血清(v/v％)和终浓度为800μg/mL的遗传霉素(G418)的RPMI-1640培养基，即为加压筛选培养基。

取出转染后的CHO细胞，沿板壁轻轻吸去旧的培养基，加入2mL加压筛选培养基，在5％CO

使用加压筛选培养基培养，pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染细胞后加压筛选第6天的细胞生长情况如图3所示，为显微镜10倍镜下观察结果；图3显示，使用加压筛选培养基培养CHO细胞第6天时，未成功转入pcDNA3.1-CaIL6重组质粒(SEQ ID NO:4)的CHO细胞变圆脱落而死亡，而成功转入pcDNA3.1-CaIL6重组质粒(SEQ ID NO:4)的CHO细胞开始长成一团，继续存活并增殖。

使用加压筛选培养基培养14天以上，直至CHO正常细胞对照组全部死亡则停止加压筛选。

3.转染产物检测

(1)方法

使用Omega公司的RNA试剂盒提取pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组、pcDNA3.1(+)空载转染组及正常细胞组的核酸并反转成cDNA，使用IL-6特异性引物进行RT-PCR扩增，检测犬IL-6基因在各组细胞内的表达情况，即犬IL-6基因mRNA转录情况。

收集pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组、pcDNA3.1(+)空载转染组及正常细胞组的上清样品和细胞样品，使用犬IL-6抗体(申请号：CN202110618231.9)为一抗，羊抗鼠(Earthox，E030110-01)为二抗进行Western-blotting分析，检测犬IL-6蛋白在各组细胞内的表达情况。

(2)结果

各组细胞中犬IL-6基因mRNA转录情况如图4所示；M为marker，1以CHO正常细胞组细胞cDNA为模板，2以pcDNA3.1(+)空载转染组细胞cDNA为模板，3以pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组细胞cDNA为模板，4以水作为模板(阴性对照)。图4显示，只有pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组细胞检测到大小符合预期的特异性条带，而对照组和空载组均无特异性条带。说明pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染细胞能表达IL-6基因。

各组细胞表达犬IL-6蛋白的Western-blotting分析结果如图5所示，1为CHO正常细胞组细胞上清，2为pcDNA3.1(+)空载转染组细胞上清，3、4为pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组细胞上清，5为CHO正常细胞组细胞，6为pcDNA3.1(+)空载转染组细胞，7、8为pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组细胞。图5显示，只有pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组的细胞上清中检测到大小为26kDa的条带，与IL-6蛋白大小一致，而pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组的细胞、pcDNA3.1(+)空载转染组及CHO正常细胞组的细胞上清和细胞中均未检测到相同大小的蛋白条带。说明pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组细胞株能表达犬IL-6蛋白，且将犬IL-6蛋白分泌至上清。

4.稳定细胞株的筛选和鉴定

制备细胞悬液：将上一步加压筛选所得的pcDNA3.1-CaIL6重组质粒转染组细胞株的细胞，用PBS清洗2次，再用0.25％的胰酶(wt％)消化。消化后进行细胞计数，调节细胞密度为300～500个/mL。

配制单克隆筛选培养基：以RPMI-1640培养基作为基础培养基，制备含有15％胎牛血清(v/v％)和终浓度为400μg/mL的G418的RPMI-1640培养基，即为单克隆筛选培养基。

向96孔细胞培养板中每孔加入100μL单克隆筛选培养基，在第一行的细胞孔中加入100μL上述制备的细胞悬液，吹打混匀后吸取100μL接种于第二行，以此类推，直到第八行，弃100μL。将96孔板置于5％CO2、37℃培养箱中。从培养的第4天开始观察96孔板内是否出现单克隆的细胞，待单克隆的细胞生长至聚集成团后，按照48孔板→24孔板→12孔板→6孔板顺序进行扩大培养，得到单克隆细胞株。收集每一株单克隆细胞株的上清，通过Western-blotting分析每株细胞的蛋白表达情况。选择第一次筛选为阳性的细胞株进行第二次亚克隆筛选，并以同样的方法进行第三次亚克隆筛选。

将第三次筛选获得的阳性单克隆的细胞株连续培养传代20次，每5代收集细胞上清，通过Western-blotting检测单克隆细胞株表达IL-6蛋白能力的传代稳定性。

将第三次筛选获得的阳性单克隆细胞株冻存至液氮罐，两个月后进行复苏培养，收集细胞上清，通过Western-blotting检测单克隆细胞株表达犬IL-6蛋白能力的冻存稳定性。

第一次亚克隆获得的单克隆的细胞株犬IL-6蛋白表达情况鉴定结果如图6所示，其中1～14分别指14株单克隆的细胞株的上清，图6显示14株单克隆的细胞株均在26kDa处出现目的条带，第12株目的条带最明显，说明该株蛋白表达量较高。

第三次筛选获得的阳性单克隆的细胞株的不同代次单克隆的细胞株犬IL-6蛋白表达情况鉴定结果如图7所示，其中，1为第1代细胞上清；2为第5代细胞上清；3为第10代细胞上清；4为第15代细胞上清；5为第20代细胞上清；图7显示，第1、5、10、15、20代的细胞上清中均检测到大小符合预期的蛋白条带。说明表明该单克隆的细胞株能稳定表达犬IL-6蛋白。

冻存前后单克隆的细胞株犬IL-6蛋白表达情况鉴定结果如图8所示，1、3为细胞株冻存前的细胞上清；2为1细胞株冻存2个月后再复苏的细胞上清；4为2细胞株冻存2个月后再复苏的细胞上清。图8显示，未冻存的单克隆的细胞株及冻存2个月后复苏的单克隆的细胞株，在细胞上清中均检测到大小符合预期的蛋白条带。说明该单克隆的细胞株冻存前后均能表达犬IL-6蛋白，且细胞株表达犬IL-6蛋白的能力不受冻存及复苏的影响，本发明获得的单克隆的细胞株能稳定表达犬IL-6蛋白。

以上结果表明，通过本实施例成功构建了稳定表达犬IL-6蛋白的CHO细胞株。

实施例3犬IL-6蛋白的纯化

1.实验方法

(1)收集蛋白液

将实施例2所得稳定表达犬IL-6蛋白的CHO细胞株接种于10cm细胞皿，以含10％胎牛血清(v/v％)及青链霉素(100IU/mL)的RPMI-1640培养基为培养基，于37℃，5％CO

(2)蛋白纯化

使用思拓凡公司GE产品Histrap excel亲和层析柱和SCG蛋白纯化系统进行犬IL-6蛋白的纯化。具体方法如下：

依次打开系统主机----紫外检测器电源----输液泵电源---组分收集器电源。将A、B管路放入超纯水中，清洗系统，确保层析系统的泵和管道中注满去离子水。安装层析柱，待柱前流路有液体流出后去掉层析柱上塞子，将层析柱连接至层析系统中，打开层析柱下出口并连接到层析系统中，连接处旋紧防止漏液；

用3～5倍柱体积的去离子水冲洗层析柱，排除层析柱中的存储缓冲液；

用5～10倍柱体积的0mM-40mM咪唑的磷酸缓冲液作为平衡液平衡层析柱；

利用系统上样泵上样，控制上样量不超过柱子的结合能力；

用含0mM、40mM咪唑的磷酸缓冲液作为平衡液，冲洗层析柱，直到UV280的吸光度值达到一个稳定的基线；

用平衡液和含500mM咪唑的磷酸缓冲液洗脱蛋白，采用线性梯度洗脱法洗脱目的蛋白，即当UV280指标的曲线开始增加时，收集洗脱液，当上升后又下降到平稳时，停止收集洗脱液。使用10倍柱体积的500mM咪唑溶液洗脱柱子上结合的杂蛋白。使用10倍柱体积的去离子水冲洗柱子及系统管道，再用20％乙醇流过系统和层析柱。取下柱子，4℃保存。

对于收集的洗脱液使用10kD的超滤管对其进行溶剂置换和蛋白浓缩，得到纯化的犬IL-6蛋白。

(3)纯化效果检测

将蛋白纯化过程中得到的样品(包括上样流穿液、蛋白洗脱液)以及原始样品(待纯化的蛋白液)，用SDS-PAGE和Western-blotting检测纯化效果。

2.实验结果

(1)犬IL-6蛋白纯化的SDS-PAGE分析结果如图9所示，其中图9中a使用不含咪唑的磷酸盐缓冲液作为平衡液；b使用含40mM咪唑的磷酸盐缓冲液作为平衡液；a、b中M为蛋白marker；1为待纯化的蛋白液；2为上样流穿液；3为蛋白洗脱液。图9显示，当使用不含咪唑的磷酸盐缓冲液作为平衡液时，蛋白洗脱液在70kDa处存在大量杂蛋白；当使用含40mM咪唑的磷酸盐缓冲液作为平衡液时，蛋白洗脱液在70kDa处基本无杂蛋白。说明，以用含40mM咪唑的磷酸盐缓冲液作为平衡液时可得到基本无杂质的纯化的犬IL-6蛋白。

(2)犬IL-6蛋白纯化的Western-blotting分析结果如图10所示，其中1为待纯化的蛋白液；2为上样流穿液；3为蛋白洗脱液；从图10可知，待纯化的蛋白液和蛋白洗脱液均在26kDa处出现条带，而上样流穿液无条带出现，说明犬IL-6蛋白能够很好的与镍柱结合并被洗脱，得到纯化的犬IL-6蛋白。

实施例4犬IL-6蛋白的生物学活性检测

1.实验方法

(1)淋巴细胞的分离

采用颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠置于75％酒精中浸泡3min。

在无菌条件下取出小鼠脾脏，小心剔除脾脏上的脂肪组织；将1毫升的针头插入到2毫升的注射器针筒上，并把针头折弯，抽取RPMI-1640培养基，将针头插入脾脏中，轻推注射器将脾细胞吹洗出来，反复多次，收集含有脾细胞的溶液。将获得的脾细胞悬液经200目铜网过滤，1000rpm/min，离心10min。

弃上清，加入4mL红细胞裂解液轻轻吹打混匀，静置5min，待红细胞完全破碎后，2000rpm/min，离心10min。

弃上清，加入5mLRPMI-1640培养基，洗涤细胞沉淀，2000rpm/min，离心10min，重复一次。

弃上清，用含10％FBS(v/v％)的RPMI-1640培养基重悬沉淀，调节细胞密度为5×10

(2)淋巴细胞增殖试验

将上一步所得淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100μL。

试验分为两组，第一组使用低浓度的犬IL-6蛋白剂量，使用RPMI-1640培养基进行蛋白稀释，100μL/孔，使得孔内蛋白终浓度依次为0.5ng/mL、0.75ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL。第二组使用较高浓度的犬IL-6蛋白剂量，使用RPMI-1640培养基进行蛋白稀释，100μL/孔，使得孔内蛋白终浓度依次为：1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL。

每组均设置阳性对照、阴性对照和空白对照：

向淋巴细胞中加入终浓度为10μg/mL的刀豆素(Con A)，作为阳性对照，记为Con A组。

只加入淋巴细胞，不添加任何药物的，即0加药，作为阴性对照。

只加入培养基，不加淋巴细胞和药物的，作为空白对照。

在96孔细胞培养板试验区域的四周其余空孔，每孔加入200μL的PBS，减少实验组中培养基的蒸发。置于37℃、5％CO

培养结束后，向淋巴细胞加入20μL/孔CCK-8溶液，置于37℃、5％CO

2.实验结果

犬IL-6蛋白组、阳性对照、阴性对照、空白对照的吸光值及对应细胞活力的统计结果，低浓度组如表3所示，高浓度组如表4所示。

表3吸光值及细胞活力的统计结果(低浓度)

表4吸光值及细胞活力的统计结果(高浓度)

犬IL-6蛋白浓度与淋巴细胞活力的线性关系图如图11所示；其中a为浓度0.5～5ng/mL的犬IL-6蛋白与淋巴细胞活力的线性关系图；b为浓度1～20μg/mL的犬IL-6蛋白与淋巴细胞活力的线性关系图。

从表3、4和图11可以看出，在低浓度组中，浓度0.5～5ng/mL的犬IL-6蛋白均可以促进淋巴细胞的增殖，随着犬IL-6蛋白浓度的增加，细胞活力的数值增大，说明犬IL-6蛋白促进淋巴细胞增殖的效果增加；但在高浓度组时，浓度1～10μg/mL的犬IL-6蛋白均可以促进淋巴细胞的增殖，随着犬IL-6蛋白浓度增加，淋巴细胞活力值逐渐降低；当犬IL-6蛋白浓度达到15μg/mL时，细胞活力值为负数，说明此浓度的犬IL-6蛋白具有抑制淋巴细胞增殖的效果。综合可知，犬IL-6蛋白在0.5～5ng/mL低浓度及1～10μg/mL的高浓度下均可以促进小鼠淋巴细胞的增殖。结果表明，本发明筛选的稳定表达犬IL-6蛋白的CHO细胞株分泌的犬IL-6蛋白具备促进小鼠淋巴细胞的增殖的生物活性。

实施例5犬IL-6蛋白的应用

1.实验方法

(1)犬副流感病毒灭活疫苗的制备及检验

取Vero细胞培养的第9代病毒液(CPIV)制备灭活疫苗，病毒的TCID

将灭活的病毒液放入烧杯内，按照体积比20％的比例加入ADJ-801(W)水佐剂(商品名：爱德佳801聚合物完全水佐剂)，使用磁力搅拌器低速搅拌10min即可完成病毒液和佐剂的乳化。

按照兽药典要求，对灭活疫苗成品进行无菌检验。取1mL灭活苗成品接种于50mL硫乙醇酸盐流体培养基(TG)，于37℃培养箱中培养3天；吸取培养液分别加入TG小管和酪胨琼脂(GA)斜面各两支，每支0.2mL，一支于37℃培养，另一支于25℃培养；另取0.2mL接种1支胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基，置于25℃培养箱培养。以上接种物均培养7天，观察长菌情况。

(2)动物试验

15只六周龄的中华田园犬，经金胶体检测试剂盒检测均不携带犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒。实验犬驱虫7天后按照第0、14天程序注射英特威犬瘟热-犬细小二联苗，作为基础免疫。基础免疫14天后，按照第0、14天程序进行犬副流感病毒灭活疫苗免疫。具体分组情况如表5。

表5灭活疫苗的动物分组

注：犬IL-6蛋白即实施例3纯化的犬IL-6蛋白。

(3)中和抗体检测

分别在一免前、一免后14天、二免后14天和二免后28天对实验犬进行采血，分离血清。采用固定病毒-稀释血清的中和实验测定犬体内副流感病毒中和抗体水平。以抗CPIVNP鼠多克隆抗体为一抗，Dylight 488标记的羊抗鼠为二抗进行间接免疫荧光试验。通过观察每个血清稀释度的荧光结果，以全部重复孔都能中和病毒为最高的抗体效价，以2为底数，取log2值进行绘图分析，若最低稀释倍数都没有荧光，取1计算。

2.实验结果

灭活后的病毒液接种Vero细胞，盲传三代均无细胞病变，说明病毒已完全灭活。将制备的灭活疫苗成品分别接种于硫乙醇酸盐流体培养基(TG)、酪胨琼脂斜面(GA)和胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中，于25℃和37℃培养7天后，均没有杂菌生长，表明制备的犬副流感病毒灭活疫苗的无菌检验合格。

实验犬体内的中和抗体水平变化如图12所示，各组实验犬在免疫前的中和抗体检测均为阴性；一免14天后，CPIV组和CPIV+IL-6组的试验犬有出现中和抗体，但1:2.5稀释时都不能完全中和病毒；二免14天后，CPIV+IL-6组的中和抗体水平最高，与生理盐水组差异显著(P<0.01)，但与CPIV组无显著差异；二免28天后，CPIV+IL-6组和CPIV组的中和抗体水平有所下降，但CPIV+IL-6组仍与生理盐水组具有差异(P<0.05)。实验中CPIV+IL-6组的抗体水平与CPIV组的无统计学差异，推测与犬IL-6蛋白的剂量有关。以上结果说明犬IL-6蛋白可以提高犬机体产生抗犬副流感病毒的中和抗体，可以作为病毒疫苗的免疫增强类佐剂。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaactccc tctccacaag cgccttctcc ctggggctgc tcctggtgat ggctactgct 60

ttccctaccc cgggacccct ggcaggagat tccaaggatg atgccacttc aaatagtcta 120

ccactcacct ctgcaaacaa agtggaagaa ctgattaagt acatcctcgg caaaatctct 180

gcactgagaa aggagatgtg tgacaagttt aacaagtgtg aagacagcaa agaggcactg 240

gcagaaaata acctacatct tcccaaactg gagggaaaag atggatgctt ccaatctggg 300

ttcaatcagg agacctgctt gacaagaatc actaccggtc ttgtggagtt tcagctacac 360

ctgaatatcc tccagaacaa ctatgaaggt gataaggaaa atgtcaagtc tgtgcacatg 420

agtaccaaga tcctggtcca gatgctaaag agcaaggtaa agaatcagga tgaagtgacc 480

actcctgacc caaccacaga cgccagcctg caggctatct tgcagtcaca ggatgagtgg 540

ctgaagcaca caacaattca cctcatcctg cggagtctgg aggatttcct gcagttcagt 600

ctgagggctg ttcggataat gtag 624

<210> 2

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccaagcttg ccatggagac agacacactc ctgctatggg tactgctgct ctgggttcca 60

ggttccactg gtgacaactc cctctccaca agc 93

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatccc taatggtgat ggtgatgatg cattatccga acagccct 48

<210> 4

<211> 6506

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cctacattat ccgaacagcc ctcagactga actgcaggaa atcctccaga 240

ctccgcagga tgaggtgaat tgttgtgtgc ttcagccact catcctgtga ctgcaagata 300

gcctgcaggc tggcgtctgt ggttgggtca ggagtggtca cttcatcctg attctttacc 360

ttgctcttta gcatctggac caggatcttg gtactcatgt gcacagactt gacattttcc 420

ttatcacctt catagttgtt ctggaggata ttcaggtgta gctgaaactc cacaagaccg 480

gtagtgattc ttgtcaagca ggtctcctga ttgaacccag attggaagca tccatctttt 540

ccctccagtt tgggaagatg taggttattt tctgccagtg cctctttgct gtcttcacac 600

ttgttaaact tgtcacacat ctcctttctc agtgcagaga ttttgccgag gatgtactta 660

atcagttctt ccactttgtt tgcagaggtg agtggtagac tatttgaagt ggcatcatcc 720

ttggaatctc ctgccagggg tcccggggta gggaaagcag tagccatcac caggagcagc 780

cccagggaga aggcgcttgt ggagagggag ttcatagcca tggccttgtc gtcgtcgtcg 840

gtacccagat ctgggctgtc catgtgctgg cgttcgaatt tagcagcagc ggtttctttc 900

ataccagaac cgcgtggcac cagaccagaa gaatgatgat gatgatggtg catatggcca 960

gaaccagaac cggccaggtt agcgtcgagg aactctttca actgaccttt agacagtgca 1020

cccactttgg ttgccgccac ttcaccgttt ttgaacagca gcagagtcgg gataccacgg 1080

atgccatatt tcggcgcagt gccagggttt tgatcgatgt tcagttttgc aacggtcagt 1140

ttgccctgat attcgtcagc gatttcatcc agaatcgggg cgatcatttt gcacggaccg 1200

caccactctg cccagaaatc gacgaggatc gccccgtccg ctttgagtac atccgtgtca 1260

aaactgtcgt cagtcaggtg aataatttta tcgctcatat gtatatctcc ttcttaaagt 1320

taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca caattcccct atagtgagtc 1380

gtattaattt cgcgggatcg agatcgatct cgatcctcta cgccggacgc atcgtggccg 1440

gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg 1500

aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag 1560

gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg 1620

cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg 1680

gagagcgtcg agatcccgga caccatcgaa tggcgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga 1740

tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat 1800

gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc 1860

cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct gaattacatt 1920

cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc 1980

tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat 2040

caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa 2100

gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg 2160

gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc gttatttctt 2220

gatgtctctg accagacacc catcaacagt attattttct cccatgaaga cggtacgcga 2280

ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca 2340

ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct cactcgcaat 2400

caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa 2460

accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt cccactgcga tgctggttgc caacgatcag 2520

atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggacatc 2580

tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac agctcatgtt atatcccgcc gttaaccacc 2640

atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct gcaactctct 2700

cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc 2760

accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 2820

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag 2880

ttagctcact cattaggcac cgggatctcg accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt 2940

cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt 3000

tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg 3060

ctttcgctgg agcgcgacga tgatcggcct gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc 3120

cctcgctcaa gccttcgtca ctggtcccgc caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat 3180

tatcgccggc atggcggccc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg 3240

gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac 3300

gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg 3360

tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg 3420

gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa 3480

gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg 3540

tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag 3600

catcctctct cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga 3660

ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca 3720

gacattaacg cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg 3780

tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga 3840

tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 3900

ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 3960

cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca 4020

tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 4080

taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 4140

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 4200

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 4260

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 4320

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 4380

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 4440

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 4500

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 4560

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 4620

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 4680

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg 4740

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 4800

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 4860

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 4920

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 4980

tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 5040

ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 5100

catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 5160

ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 5220

caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 5280

ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 5340

tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 5400

cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 5460

aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 5520

tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 5580

gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 5640

cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 5700

aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 5760

tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 5820

tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 5880

gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 5940

atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 6000

taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga aattgtaaac gttaatattt 6060

tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa 6120

tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag 6180

tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg 6240

tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga 6300

ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg 6360

gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg 6420

cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc 6480

cgctacaggg cgcgtcccat tcgcca 6506

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagcttgcca tggagacaga cacactcctg ctatgggtac tgctgctctg ggttccaggt 60

tccactggtg acaactccct ctccacaagc gccttctccc tggggctgct cctggtgatg 120

gctactgctt tccctacccc gggacccctg gcaggagatt ccaaggatga tgccacttca 180

aatagtctac cactcacctc tgcaaacaaa gtggaagaac tgattaagta catcctcggc 240

aaaatctctg cactgagaaa ggagatgtgt gacaagttta acaagtgtga agacagcaaa 300

gaggcactgg cagaaaataa cctacatctt cccaaactgg agggaaaaga tggatgcttc 360

caatctgggt tcaatcagga gacctgcttg acaagaatca ctaccggtct tgtggagttt 420

cagctacacc tgaatatcct ccagaacaac tatgagggtg ataaggaaaa tgtcaagtct 480

gtgcacatga gtaccaagat cctggtccag atgctaaaga gcaaggtaaa gaatcaggat 540

gaagtgacca ctcctgaccc aaccacagac gccagcctgc aggctatctt gcagtcgcag 600

gatgagtgcg tgaagcacac aacaattcac ctcatcctgc ggagtctgga ggatttcctg 660

cagttcagtc tgagggctgt tcggataatg catcatcacc atcaccatta gggatcc 717

<210> 6

<211> 6121

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aagcttgcca tggagacaga cacactcctg ctatgggtac tgctgctctg 960

ggttccaggt tccactggtg acaactccct ctccacaagc gccttctccc tggggctgct 1020

cctggtgatg gctactgctt cccctacccc gggacccctg gcaggagatt ccaaggatga 1080

tgccacttca aatagtctac cactcacctc tgcaaacaaa gtggaagaac tgattaagta 1140

catcctcggc aaaatctctg cactgagaaa ggagatgtgt gacaagttta acaagtgtga 1200

agacagcaaa gaggcactgg cagaaaataa cctacatctt cccaaactgg agggaaaaga 1260

tggatgcttc caatctgggt tcaatcagga gacctgcttg acaagaatca ctaccggtct 1320

tgtggagttt cagctacacc tgaatatcct ccggaacaac tatgaaggtg ataaggaaaa 1380

tgtcaagtct gtgcacatga gtaccaagat cctggtccag atgctaaaga gcaaggtaaa 1440

gaatcaggat gaagtgacca ctcctgaccc aaccacagac gccagcctgc aggctatctt 1500

gcagtcacag gatgagtggc tgaagcacac aacaattcac ctcatcctgc ggagtctgga 1560

ggatttcctg cagttcagtc tgagggctgt tcggataatg catcatcacc atcaccatta 1620

gggatccact agtccagtgt ggtggaattc tgcagatatc cagcacagtg gcggccgctc 1680

gagtctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 1740

ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 1800

gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 1860

ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat 1920

gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg 1980

gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 2040

agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 2100

tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 2160

ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 2220

cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 2280

tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 2340

tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 2400

caaaaattta acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc 2460

caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt 2520

gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt 2580

cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg 2640

cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct 2700

ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca 2760

aaaagctccc gggagcttgt atatccattt tcggatctga tcaagagaca ggatgaggat 2820

cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga 2880

ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc 2940

ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga 3000

atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg 3060

cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc 3120

cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg 3180

atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga 3240

aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc 3300

tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca 3360

tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 3420

tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct 3480

atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg 3540

accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc 3600

gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac 3660

gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt 3720

cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga 3780

gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 3840

catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 3900

actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta 3960

atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 4020

acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 4080

aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 4140

atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 4200

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ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 4320

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tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 4620

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gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 4740

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 4800

cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 4860

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cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 6000

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