滑液代用品

摘要

本文公开了关节内组合物，其包含至少一种低分子量的线性透明质酸或透明质酸盐与至少一种高分子量的线性透明质酸或透明质酸盐，所述组合物的特征在于动态粘度范围为10至60Pa*s(在0.01s‑1)，交叉频率范围为1至10rad/s，并且在交叉频率处的粘性和弹性模量值范围为20至110Pa。

说明书

本发明涉及包含低分子量和高分子量线性透明质酸或透明质酸盐的关节内组合物。由于它们的流变学性质，本发明的组合物可作为滑液代用品用于粘性补充(viscosupplementation)。

现有技术

滑液是主要由透明质酸、蛋白质(包括润滑素(lubricin))、磷脂(特别是磷脂酰胆碱)和离子组成的粘性溶液。其功能是润滑和保护关节，无论是静止还是运动。为了有效地执行这个功能，滑液具有粘弹性的、非牛顿的行为，因此它的粘度与施加的力成比例地变化。在没有运动时，或在缓慢运动期间，粘性行为(通过粘性模量G”测量)占优势，因此润滑能力占优势。相反，当关节运动时(例如在快速行走或跑步期间)，弹性行为(通过弹性模量G’测量)占优势，其对于在负载下保护关节是至关重要的。

在健康个体的滑液中，两个模量之间的反转发生在低频时，通常在1-2Hz以下。所述频率，称为交叉频率(crossover frequency)，例如对应于从慢走到跑步的转换。

交叉频率随着年龄以及随着关节疾病如骨关节炎的进展而增加，当严重时，其伴随着反转点的消失。在这种情况下，滑液不再表现出占优势的弹性行为，即使在高频率下也如此，并且G’总是小于G”。

滑液流变性质的这种改变伴随着其组成的改变。透明质酸的平均分子量从约6-7百万Da降至1-3百万Da，而其浓度从2-4mg/ml降至1-2mg/ml。这种变化与粘弹性行为的改变直接相关，主要是由于滑液的多糖组分。进而，动态粘度从数十Pa*s的平均值降低到1Pa*s附近或低于1Pa*s。类似地，在2.5Hz频率下的G’值从约120Pa降到低于10Pa的值(Balazs,E.A.“Viscoelastic properties of hyaluronic acid and biological lubrication.”University of Michigan Medical Center Journal(1967):255-259，和Fam,H.,J.T.Bryant,和M.Kontopoulou.“Rheological properties of synovial fluids.”Biorheology 44.2(2007):59-74)。

图1中报道了年轻、正常和骨关节炎患者的滑液的动态模量(取自Balasz,Disorder of knee,1982)。

粘性补充包括向患有关节病症的患者施用一种液体，当该液体直接进入关节腔时，恢复滑液的生理性质。为此，所用的溶液必须尽可能接近地模拟健康个体滑液的粘弹性行为。因此，它必须具有相似的粘度和不超过1-1.5Hz(低于10rad/s)的反转频率。

透明质酸通常在盐水溶液中用于粘性补充，通常以透明质酸钠的形式。透明质酸可以“原样”(线性分子)使用或被化学改性以将各种多糖链键合在一起(交联)。透明质酸溶液的流变性直接受到分子量、浓度和交联度(如果有的话)的影响。分子量越高，溶液的粘弹性行为越好。不幸的是，通过常规的生产技术不能获得与生理值(6-7百万)相似的分子量，并且用于粘性补充的透明质酸盐平均分子量为1-4百万。用于规避这种限制的主要策略包括:

1.增加浓度，在市场上存在的医疗装置中浓度可以高达20mg/ml(

2.通过交联增加分子量，以得到化学改性的透明质酸盐凝胶((

在第一种情况下，这种高浓度(约生理浓度的10倍)伴随着粘度的相当大的增加，其显著高于滑液的粘度，并且可能导致制造和施用的困难。

在交联的情况下出现相同的现象，这通常还伴随着三维结构的“硬化”，结果是弹性模量G’增加，而以粘性模量G”为代价；在这种情况下，与滑液相比，观察到交叉频率的显著改变(降低)，或者甚至交叉点的消失，其中G’总是大于G”，甚至在低频也如此。此外，与化学物质的交联可增加杂质的存在和与生物相容性较差的修饰的透明质酸盐的免疫原性相关的不良反应。

为了避免弹性行为的过度增加，US 8524213提出了线性透明质酸盐和交联透明质酸盐的混合物。然而，尽管在流变学性质上有一定的改进，所述溶液并没有消除施用与天然溶液不同的、化学改性的透明质酸盐有关的缺点。

相反，WO 2012/032151公开了由高分子量HA和具有较低分子量的第二种多糖组成的混合协作复合物，所述第二种多糖可以是另一种透明质酸盐或另一种化学物质(例如硫酸软骨素或麦芽糖糊精)。该复合物通过热处理获得，这导致动态粘度降低高达200倍。热处理还对该溶液的粘弹性有影响，这改变了其流变学特性，使交叉向高频移动。因此，所得制剂也不完全适用于粘性补充，主要是因为制备方法的目的不是制备透明质酸盐的混合物，而是产生低粘度的混合协作复合物。此外，即使在相对高的频率下，也是粘性模量G”占优势。

EP 2 026 821使用具有不同分子量的透明质酸的二元混合物，目的是获得具有至少5Pa*s动态粘度(1秒

发明描述

现在已经令人惊奇地发现，具有与滑液的流变行为相当的溶液可以单独通过仅使用未改性的线性透明质酸、任选地与已经存在于滑液中的其他次要成分(例如蛋白质、磷脂和多糖)组合来获得。透明质酸必须以至少两种不同分子量的混合物存在，以得到具有受控流变性质的溶液。制备所述混合物不需要特殊的步骤，更不用说高温处理。本发明的混合物表现出替代关节病症患者滑液所需的所有特征，因此构成了理想的粘性补充制剂。

发明详述

本发明公开了一种关节内组合物，其包含至少一种低分子量的线性透明质酸或透明质酸盐和至少一种高分子量的线性透明质酸或透明质酸盐，低分子量的透明质酸盐与高分子量的透明质酸盐的重量比为1:10至10:1。

本发明的组合物在25°下的动态粘度为10至60Pa*s(在0.01s

所述低分子量线性透明质酸或透明质酸盐具有范围在10至300kDa，优选在20至150kDa，更优选在50至100kDa，最优选在70至90kDa的平均分子量Mw。

所述高分子量线性透明质酸或透明质酸盐具有1000-6000kDa，优选1000至4500kDa，最优选1000至3500kDa的平均分子量Mw。

低分子量透明质酸盐与高分子量透明质酸盐的重量比优选为1:5至5:1，更优选为1:3至3:1。

根据本发明的优选组合物包含平均分子量Mw为70至90kDa的低分子量线性透明质酸或透明质酸盐、和平均分子量Mw为1000至3500kDa的高分子量线性透明质酸或透明质酸盐。

本发明的组合物优选包含至少两种不同的高分子量线性透明质酸或透明质酸盐。

MW是从特性粘度η(根据EP计算)用Mark-Houwink-Sakurada方程测定的，其中η＝KM

本发明的组合物还可以含有磷脂，如磷脂酰胆碱和润滑素，以及其他糖胺聚糖如非硫酸化软骨素。

根据本发明可用的低和高分子量透明质酸是已知的，并且可以从市场上获得，例如Altergon(意大利)，HTL(法国)，Bloomage Freda Biopharm有限公司(中国)和Kewpie(日本)。

本发明的组合物采用包含浓度为1至5％w/v的透明质酸或透明质酸盐的水溶液形式。低分子量透明质酸盐与高分子量透明质酸盐的比例可为0.1至10。

除了透明质酸盐和任选的其他糖胺聚糖、磷脂和蛋白质如润滑素之外，本发明的组合物还可以含有局部麻醉剂、缓冲剂和任选的其他合适的赋形剂或用于人和兽医学的活性成分。

本发明的组合物可以关节内和滑膜内施用，用于治疗和预防骨关节炎和相关病症。

剂量将取决于各种因素，例如患者的体重和年龄，以及疾病的严重程度和进展阶段，但是在任何情况下，医疗护理人员将容易地根据经验和使用本发明的组合物获得的临床和临床前结果来确定。

以下实施例更详细地说明本发明。

从通过发酵获得的分子量为1,700kDa的透明质酸钠起始，制备了三种浓度递增的水溶液：16mg/ml、21mg/ml和30mg/ml。将制剂在高压釜中灭菌(121℃15分钟)。用装有锥/板系统的流变仪(Modular Compact Rheometer MCR302，Anton Paar)分析粘度增加的澄清溶液。测量在25℃下进行，特别是，振荡分析(扫频)在对应于不同关节运动速度(0.1-100rad/s)的频率下进行，并且进行旋转分析评价在不同剪切速率(0.01-300s

获得的数据总结在下表1中，其还显示了滑液的参考值:

表1

从通过发酵获得的分子量为300kDa的透明质酸钠起始，还制备了浓度为30mg/ml的水溶液。获得的流变数据总结在下表2中:

表2

实验数据表明，在分子量为1,700kDa的低浓度透明质酸盐，动态粘度值与滑液的相似，而交叉时的G’和G”值没有高很多。相反，交叉频率比生理值高得多，并且与在一些骨关节病症中发现的频率相似。

通过增加透明质酸的浓度可以获得交叉频率的改善，但是这种作用具有成比例地增加粘性和弹性模量以及动态粘度值的副作用，这些值与生理值非常不同。

此外，实验数据表明，使用低分子量透明质酸盐(300kDa)不会产生具有交叉点的制剂，因为相对于弹性组分(G’)，粘性组分(G”)总是占优势。

因此，如果使用单一的透明质酸，则没有办法完全模拟滑液的流变性质。

使用具有70kDa分子量的透明质酸钠与具有较高分子量的透明质酸盐混合，制备通过发酵获得的两种透明质酸钠二元溶液。具体而言，一种溶液是使用16g分子量为1,700kDa的透明质酸盐和16g分子量为70kDa的透明质酸盐溶解在1L的盐水溶液中制备的，另一种溶液是通过将9g分子量为3,500kDa的透明质酸盐和6g分子量为70kDa的透明质酸盐溶解在1L的盐水溶液中制备的。

在超过120℃的T下最终灭菌后，获得两种澄清的粘性溶液，将其在25℃下用配备有锥/板系统的流变仪(Modular Compact Rheometer MCR302，Anton Paar)检查以测定交叉频率、交叉时的弹性和粘性模量值以及动态粘度。

两种溶液的流变学数据，称为HA HMW-LMW和HA VHMW-LMW，总结在下表3中，其还显示了滑液的参考值:

表3

两种溶液都表现出与健康个体的滑液相似的流变行为：高分子量透明质酸盐的分子量越高，溶液与滑液越相似。

将5g分子量为3,500kDa的通过发酵获得的透明质酸钠、5g分子量为1,700kDa的通过发酵获得的透明质酸钠和5g分子量为70kDa的通过发酵获得的透明质酸钠溶解在1L的盐水溶液中。灭菌后，得到透明的粘性溶液，用装备有锥体/板系统的流变仪(ModularCompact Rheometer MCR302，Anton Paar)在25℃下检测其流变学性质。

该溶液称为HA VHMW-HMW-LMW，其显示9rad/s的交叉值(健康人的交叉为1-10rad/秒)，交叉频率处40Pa的G’和G”值(健康人的生理值<100Pa)，以及低剪切速率下16Pa*s的动态粘度(健康人的动态粘度范围为1至40Pa*s)。

因此，所制备的溶液的流变学行为与健康个体的滑液的流变学行为相同。

将实施例2和3的溶液，与通过将30g透明质酸钠(通过发酵获得，分子量为1,700kDa)溶解在1L盐水溶液中而获得的溶液，以及与通过将21g透明质酸钠(通过发酵获得，分子量为2,300kDa)溶解在1L盐水溶液中而获得的溶液进行比较。所述两种溶液，分别称为HA 3％和HA 2.1％，用实施例1中所述的流变仪分析。图2(振荡分析)和3(旋转分析)中所示的曲线比较实施例2的HA HMW-LMW与实施例4的HA 3％。

结果总结在下表4中，其还显示了滑液的参考值:

表4

可以看到，所有五种溶液具有与滑液相当的交叉频率。因此，根据其分子量，使用单一的浓度或多或少的透明质酸钠，可以模拟健康个体滑液的交叉频率。然而，所述结果是以动态粘度为代价而获得的，该动态粘度是生理值的两倍以上，并且在交叉点处的模量值G’和G”显著高于滑液。

因此，当使用单一透明质酸时，所得溶液的流变性质不同于滑液的流变性质。相反，与至少一种具有较低分子量的第二透明质酸盐混合的相同透明质酸盐引起粘弹性行为的显著改善，并且通过发酵获得的高分子量透明质酸钠的分子量越高，所述改善越明显。

如实施例1所述制备了溶液(将16g分子量为1700kDa的透明质酸钠与16g分子量为70kDa的透明质酸钠混合，溶解在1L的盐水溶液中)。该溶液具有32mg/ml的总透明质酸钠浓度，并且表现出与健康滑液相当的行为。

为了模拟EP2026821中所述的制剂，将4.4g盐水溶液加入2g所制备的溶液中，得到10mg/ml的终浓度。如上所述确定在交叉频率处的G’和G”的值。获得的数据总结在下表5中。

表5

10mg/ml的制剂不再显示交叉点，因为在高至100rad/s的频率下，粘性成分(G”)总是比弹性成分(G’)更占优势。因此它不再与健康滑液相当。此外，在1Hz下测量的G’和G”值比EP2026821中报道的值低得多。

将1.6g磷脂(磷脂酰胆碱)加入到1L实施例2的HA HMW-LMW溶液中，将该新溶液，称为HA HMW-LMW+PC，按实施例2所述进行流变学分析。

将结果与实施例2的溶液HA HMW-LMW的结果进行比较，并总结在下面的表6中，其还显示了滑液的参考值:

表6

数据表明，加入浓度比透明质酸钠浓度低20倍的磷脂酰胆碱不会引起制剂的流变学性质的任何显著变化。如文献中所报道的，磷脂酰胆碱的存在改善了该系统的润滑能力。

将20g分子量为1,500kDa的通过发酵获得的透明质酸钠和16g分子量为90kDa的通过发酵获得的透明质酸钠溶解在1L的盐水溶液中。对所得溶液的500ml等分试样“照原样”进行流变分析。其余的进行如WO2012/032151在实施例1中所述的热处理循环，以形成混合协作复合物。具体而言，将所述溶液加热在10分钟内达到118℃的温度，然后将所述温度保持10分钟。然后在10分钟内将溶液冷却至25℃。还将所得溶液用流变仪检测。

图4显示了透明质酸盐物理混合物的振荡分析图，图5显示了相应的复合物。主要数据总结在表7中:

表7

在成分和浓度相等的情况下，透明质酸的混合协同复合物表现出比相应的物理混合物显著更高的交叉频率。因此，复合物的形成恶化了透明质酸盐混合物的流变学性质，使得制剂与滑液不太相似，因此不太适于粘性补充。