MIR8175对改善肥胖和胰岛素抵抗的应用

摘要

本发明公开了一种植物MIR8175对改善肥胖和胰岛素抵抗的应用，通过solexa测序从牛蒡中发现活性小核酸MIR8175，进行分析和验证，证明了MIR8175表达量极其丰富且耐高温蒸煮，具有较高的稳定性；通过给饮食诱导的肥胖小鼠模型灌胃牛蒡MIR8175，检测体重和摄食量，证明牛蒡MIR8175能够显著的抑制饮食诱导的体重增加；同样用此模型给小鼠灌胃牛蒡MIR8175，检测血糖，ITT，GTT，血脂，证明牛蒡MIR8175对胰岛素抵抗，血糖，血脂有改善作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程领域，具体涉及植物MIR8175对改善肥胖和胰岛素抵抗的应用。

背景技术

随着经济的发展和人们生活水平的不断提高，肥胖人数日益增多。肥胖不仅影响人的形体美，造成心理负担，而且还会引发高血压、高脂血症、高尿酸血症、痛风、脂肪肝、冠心病、脑血管、胰岛素抵抗病等慢性疾病，对身体健康造成威胁。胰岛素抵抗在临床上定义为已知数量的内源性或外源性胰岛素无法像正常人群一样增加个体对葡萄糖的吸收和利用，而肥胖能够导致并加剧胰岛素抵抗。随着体内多种组织表现出胰岛素抵抗，破坏了体内葡萄糖稳态，引发人体整体代谢异常，进而导致二型糖尿病(T2DM)的发生。

胰岛素抵抗与胰岛素分泌受损是T2DM的核心缺陷。治疗T2DM的关键在于治疗胰岛素抵抗，增加胰岛素敏感性。治疗胰岛素抵抗的方法包括饮食控制、运动锻炼及药物干预。饮食控制是改善胰岛素敏感性的基本方法，但是效果由于人的主观性不强不太理想。运动可以降低胰岛素的水平、改善胰岛素的作用，且需要长期坚持才能达到效果，但是当前人们生活节奏快，工作繁忙，缺乏运动的时间，可行性也不高。药物治疗是相对最有效的方法，但是主要问题为价格昂贵，不良反应多。目前本领域还没有一种有效的、副作用小的预防和治疗肥胖及其相关疾病的方法和药物，因此本领域迫切需要寻找新的治疗成分和开发新的治疗策略。

中医药有几千年的历史，在医疗保健中发挥着重要作用。自古以来，许多中药典籍就有中药配方和中草药用于预防或治疗疾病的记载。近年来，关于中医药的研究日益流行，与现代化学药物相比，通常具有较低的毒性和不良反应。在中国，多种中草药一直以来被中医用来治疗糖尿病。牛蒡根是我国一味传统的中草药，牛蒡根的药用价值在多本医药典籍中都有记载，根据记载牛蒡根能防治糖尿病、胆固醇过高、内外痔、肥胖症、性机能减退及便秘等症，具有去风湿、利尿、解热、治中风等作用。但是牛蒡根复杂的活性成分造就了其同时能对多种疾病具有疗效，现代医学研究将牛蒡根药用价值多归功于其含有大量膳食纤维，多糖，多酚等活性小分子。最新研究发现，植物MicroRNAs(miRNA)也能够通过饮食被动物吸收，被转移到血液中，并在组织中积累，调节动物内源基因的表达，发挥生物学功能。miRNA是一类长约19-23nt的单链非编码小RNA，能够通过互补配对调控靶基因的表达。研究表明植物中含有丰富的miRNA，并且很多中miRNA非常稳定，耐高温蒸煮，这提示我们植物miRNA也是众多活性成员的一员，这为阐述中草药中活性成分及其作用机制提供了新的研究方向，并以此为切入点，让我们聚焦到探索牛蒡中有治疗效果的miRNA的作用。

发明内容

本发明的目的是基于以上的问题述求，发现一种植物MIR8175对改善肥胖的应用；本发明的另一目的是提供一种MIR8175改善胰岛素抵抗的应用；本发明的另一目的是提供一种miRNA8175改善高血脂的应用。

本发明的目的是采用以下技术方案实现的：首先是找到牛蒡中发挥关键作用的小分子，我们通过solexa测序从牛蒡的干片和牛蒡汤中筛选出MIR8175，进行RNA的提取和Q-PCR验证，证明牛蒡MIR8175具有极高的表达量和稳定性。然后建立高脂饮食(HFD)诱导的胰岛素抵抗小鼠模型，给小鼠灌胃牛蒡MIR8175，检测小鼠体重和每日摄食量的变化，验证牛蒡MIR8175对改善肥胖的作用；同样地，用此模型给小鼠灌胃牛蒡MIR8175，检测小鼠血糖的变化，进行胰岛素耐受性测试(ITT)和葡萄糖耐受性测试(GTT)，证明牛蒡MIR8175对改善小鼠胰岛素抵抗的作用；最后用此模型给小鼠灌胃牛蒡MIR8175，检测小鼠血脂(包括甘油三酯水平(TG)，总胆固醇水平(T-CHO)，低密度脂蛋白水平(LDL)和高密度脂蛋白水平(HDL))的变化，确认牛蒡MIR8175在改善血脂方面的应用。

本发明的有益效果是：1.利用该发明可以得出，牛蒡中含量最丰富的MIR8175具有极高的表达量和稳定性。2.利用该发明可以得出，牛蒡中MIR8175可以减轻高脂饮食诱导的肥胖小鼠体重。3.利用该发明可以得出，牛蒡中MIR8175可以改善肥胖小鼠的胰岛素抵抗。4.利用该发明可以得出，牛蒡中MIR8175可以改善小鼠的高血脂。

附图说明

图1牛蒡中活性成分的发现。图为牛蒡汤的miRNA成分的solexa测序结果。

图2通过Q-PCR对牛蒡miRNA成分分析及验证。其中，A为牛蒡干片中miRNA的表达量。B为牛蒡汤中miRNA的表达量。C为牛蒡干片中MIR8175和MIR6300表达量的比对。D为牛蒡汤中MIR8175和MIR6300的表达量比对。

图3高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型构建。其中，A为高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型的构建流程图。B为CD(日常饮食)和HFD(高脂饮食)的营养成分表。

图4牛蒡MIR8175对体重的作用。其中，A为灌胃MIR8175对体重的影响。B为每只小鼠的每天食物摄入量。

图5牛蒡MIR8175对血糖作用。其中，A为灌胃前的空腹血糖值。B为灌胃7周后的空腹血糖值。

图6牛蒡MIR8175对ITT和GTT的影响。其中，A为灌胃MIR8175对胰岛素耐受性(ITT)的影响。B为灌胃MIR8175对葡萄糖耐受性(GTT)的影响。

图7牛蒡MIR8175对血脂的作用。其中TG为甘油三酯水平，T-CHO为总胆固醇水平，LDL为低密度脂蛋白水平，HDL为高密度脂蛋白水平。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1牛蒡中活性成分的发现、牛蒡miRNA成分分析及验证，具体操作如下：

通过solexa测序筛选出牛蒡中的活性成分(图1)，然后提取牛蒡干片和牛蒡汤中RNA，进行RT-PCR和Q-PCR验证。我们发现，在众多miRNA中，牛蒡干片和牛蒡汤中的MIR8175(序列为5’-GAUCCCCGGCAACGGCGCCA-3’)含量都远远高于其他miRNA(图2A、B)。随后我们选取了miRNA中另一种含量最高的MIR6300(序列为5’-GUCGUUGUAGUAUAGUGG-3’)行验证，发现牛蒡干片和牛蒡汤中的MIR8175的含量都远远高于MIR6300，这说明牛蒡MIR8175蒸煮前后都具有较高的稳定性(图2C、D)。

实施例2高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型构建，具体操作如下：

由集萃药康提供的8周龄大雄性C57BL/6J小鼠，分为以下三组，分别为：日常饮食(CD)+无菌水，高脂饮食(HFD)+ncRNAncRNA(NC)和高脂饮食(HFD)+MIR8175。三组小鼠每日同一时间灌胃给药，每只小鼠给药1nmol，持续7周。

高脂饮食(HFD)+MIR8175组灌胃所用的人工合成的MIR8175(agomir-miR-8175)是由上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma)提供，其序列为5’-GAUCCCCGGCAACGGCGCCA-3’，高脂饮食(HFD)+ncRNA(NC)组灌胃所用的ncRNA为人工合成的MIR8175组的阴性对照，其序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，日常饮食(CD)+无菌水组灌胃等量的生理盐水(图3)。

实施例3牛蒡MIR8175对体重的作用，具体操作如下：

第一次灌胃之前，称每只小鼠的体重，之后每周称一次小鼠的体重，第7周灌胃结束后，统计三组小鼠每周体重的变化。

为了排除食物摄入量对小鼠体重的影响，每天需要记录小鼠的食物摄入量，具体操作如下：

第一次灌胃之前，测每只小鼠的食物摄入量，之后每天同一时间测每只小鼠的食物摄入量，第7周灌胃结束后，统计三组小鼠每天的平均食物摄入量。

结果分析：三组小鼠的每日食物摄入量没有差异的前提下，CD组小鼠的平均体重增加了约16％；灌ncRNA的HFD组小鼠的平均体重增加了约33％；灌MIR8175的HFD组小鼠平均体重增加约24％(图4)。表明牛蒡MIR8175在不影响摄食量的情况下可以减轻高脂饮食诱导的肥胖。

实施例4牛蒡MIR8175对血糖作用，具体操作如下：

第一次灌胃之前，用由鱼跃电子商务有限责任公司提供的血糖仪和血糖试纸，采用尾端取血的方式，测每只小鼠的空腹血糖，第7周灌胃结束后，再测每只小鼠的空腹血糖，最后统计三组小鼠血糖的平均值，比较给药前后血糖的变化。

结果分析：在灌胃之前，HFD+NC组和HFD+MIR8175组的血糖水平与CD组的血糖水平相同(图5A)；第7周结束时，HFD+NC组的血糖显着高于CD组，而HFD+MIR8175组的血糖与CD组相近(图5B)。这表明牛蒡MIR8175对胰岛素抵抗导致的血糖升高有改善作用。

实施例5牛蒡MIR8175对ITT和GTT的影响，具体操作如下：

ITT：灌胃给药7周后，小鼠禁食6h。在实验开始之前，称小鼠体重，并采集各组0h的血。各组分别腹腔注射剂量为0.75U/kg的胰岛素。尾端取血，利用血糖仪和血糖试纸(鱼跃)检测0、15、30、45、60、90、120min的血糖值。

GTT：灌胃给药7周后，小鼠禁食14h。在实验开始之前，称小鼠体重，并采集各组0h的血。各组分别腹腔注射剂量为1g/kg的葡萄糖。尾端取血，利用血糖仪和血糖试纸(鱼跃)检测0、15、30、45、60、90、120min的血糖值。

结果分析：灌胃ncRNA的HFD小鼠表现出胰岛素抵抗和葡萄糖耐受性受损，灌胃MIR8175的HFD小鼠表现出改善的胰岛素敏感性和葡萄糖耐量，此外，用CD组小鼠作对照，排除了普通核酸对ITT和GTT的影响(图6)。这表明牛蒡MIR8175对胰岛素抵抗有改善作用。

实施例6牛蒡MIR8175对血脂的作用，具体操作如下：

第七周结束处死小鼠，采用摘眼球取血的方法取血，血液静置两小时后，3500r/min离心10min，取上层血清，用由南京建成赛浩科技有限公司提供的测血脂试剂盒，检测血清中TG，TC，LDL和HDL的水平。

结果分析：与CD组小鼠相比，HFD+NC组的TG水平更高，但不显着，HFD+MIR8175组的TG水平与CD组相同；HFD+NC组与HFD+MIR8175组的T-CHO水平相同，均显着高于CD组；HFD+NC组小鼠LDL水平较CD组有明显升高，HFD+MIR8175组与HFD+NC组小鼠LDL水平相近；三组小鼠HDL水平相同(图7)。因此，牛蒡MIR8175在一定程度上能改善对HFD引起的TG和LDL异常，但对T-CHO水平没有影响。