一种荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO及其制备方法和应用，该荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO以色酮‑3‑甲醛和异喹啉酰肼为荧光基团，其结构如下式I所示。本发明的荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO对锌离子拥有很强的选择性，响应时间快，低检出限以及肉眼可见的颜色变化，而且在环境水溶液和细胞锌离子检测中具有良好的应用。本发明以色酮‑3‑甲醛和异喹啉酰肼为荧光基团，通过缩合反应制备希夫碱型荧光探针ENO，该荧光探针制备方法简单，原料易得，所得产品为淡黄色固体粉末，易于存储。

说明书

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于色酮-异喹啉为母体的荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO及其制备方法和应用。

背景技术

有机小分子荧光探针由于其选择性好，灵敏度高，检测时间短，操作简单，检测成本低，毒性低以及可视化等优点在检测环境和生物中微量重金属的研究中引起了广泛的关注。在各类金属中，锌离子(Zn

色酮衍生物是存在于几种植物中的天然含氧杂环化合物。由于其高抗氧化活性，它们表现出多种健康益处和多种医学应用，例如抗炎、抗真菌、抗血小板、抗菌活性和抗癌。希夫碱荧光探针作为一种常见的荧光传感器，由于其具有很强的金属识别能力和一步合成工艺而受到越来越多的关注。为了确保希夫碱传感器的优异性能，引入强荧光团是必要的。色酮衍生物，作为一类含氧的杂环有机小分子，具有良好的光谱性质，是一种优良的荧光母体。综上所述，设计开发具有高灵敏度、高选择性，低检出限以及溶解性好的具有色酮骨架的席夫碱荧光探针检测环境和生命中痕量锌离子具有重要的使用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO，该荧光探针ENO对锌离子具有很高的选择性，低检出限，响应时间短，可以快速地检测环境和生物系统中微量的锌离子。

本发明还提供了荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO的制备方法和应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO，以具有生物活性的色酮和异喹啉为荧光母体，其结构式如下式Ⅰ所示：

作为优选，所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO以色酮-3-甲醛和异喹啉酰肼为荧光基团，具有大π共轭体系和较强的金属络合能力。

本发明所述的荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO的制备方法，包括如下步骤：

将异喹啉羧酸通过酯化反应得到中间体异喹啉羧酸甲酯，然后以异喹啉羧酸甲酯为原料和水合肼通过取代反应得到异喹啉酰肼，以异喹啉酰肼和化合物色酮-3-甲醛通过缩合反应得到荧光探针ENO。

其中，所述异喹啉羧酸加入并溶解到有机溶剂甲醇中，然后加入浓硫酸，回流搅拌，待反应完全后，除去有机溶剂，得到的中间体异喹啉羧酸甲酯粗品，直接加入水合肼，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，萃取，分液，干燥，除去溶剂后，通过柱层析得到最终目标原料A异喹啉酰肼。

其中，所述异喹啉酰肼和色酮-3-甲醛溶解于有机溶剂甲醇中，将混合物料回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针ENO。

作为优选，所述将异喹啉酰肼和色酮-3-甲醛溶解于甲醇溶剂中，在N

作为优选，所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO制备的反应路线如下所示：

所述反应路线中：中间体为异喹啉酰肼(A)；色酮-3-甲醛(B)；(E)-N'-((4-氧代-4-氢-色-3-基)亚甲基)异喹啉-1-碳酰肼(ENO)为本发明所述检测锌离子荧光探针分子。

作为优选，所述ENO的制备过程包括：

(1)异喹啉酰肼(A)的制备

将异喹啉羧酸溶解于甲醇溶剂中，加入浓硫酸作为催化剂，将混合物料加热回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过用二氯甲烷进行萃取，分液，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物1-异喹啉羧酸甲酯。然后，将粗产品异喹啉羧酸甲酯和水合肼溶于甲醇溶剂中，加热回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:3)得到目标原料异喹啉酰肼(A)。

(2)制备荧光增强型锌离子荧光探针ENO

将异喹啉酰肼(A)和色酮-3-甲醛(B)溶解于甲醇溶剂中，在N

本发明所述的荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO在痕量锌离子检测中的应用。

其中，所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO在检测细胞中痕量锌离子的应用。

其中，所述荧光增强型锌离子检测荧光探针ENO通过荧光试纸在检测环境溶液中痕量锌离子中的应用。

本发明所述锌离子检测荧光探针ENO以色酮-3-甲醛和异喹啉酰肼为荧光基团，且通过一步希夫碱缩合而制备。本发明设计了一种全新结构的以基于色酮-3-甲醛为母体的席夫碱型荧光探ENO。该锌离子检测荧光探针母体结构中，色酮-3-甲醛衍生物存在于几种植物中的天然含氧杂环化合物。由于其高抗氧化活性，它们表现出多种健康益处和多种医学应用。异喹啉酰肼衍生物具有刚性平面结构和大π键共轭体系，同时具有细胞毒性低，结构可修饰等优点，是很好的发色团。本探针与现有技术中以嘌呤为母体的探针(PTAHN)以及以1,8-萘酰亚胺为母体的探针(NFP)相比，合成路线短，产率高，原料成本低，而且对Zn

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过利用一步法通过色酮-3-甲醛和异喹啉酰肼缩合制备具有色酮-异喹啉为母体的荧光探针。该荧光探针对锌离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高，对溶液中Zn

本发明设计开发的荧光增强型荧光探针ENO是具有高灵敏度、高选择性，低检出限以及溶解性好的有色酮骨架的席夫碱荧光探针，对于检测环境和生命中痕量锌离子具有重要的使用价值。

附图说明

图1为实施例1中制得的锌离子荧光探针在(EtOH:H

图2为实施例1中制得的锌离子荧光探针在(EtOH:H

图3为实施例1中制得的荧光探针在(EtOH:H

图4为实施例1中制得的荧光探针在(EtOH:H

图5为实施例1中制得的荧光探针在(EtOH:H

图6为实施例1中制得的荧光探针检测锌离子时的响应时间图；

图7为实施例1中制得的荧光探针在(EtOH:H

图8为实施例1制得的荧光探针以及荧光探针与锌离子络合后的最优构型图；

图9为实施例1制得的荧光探针制备的荧光试纸，在测试不同浓度锌离子的颜色变化图；

图10为实施例1中制得的荧光探针细胞毒性检测结果图；

图11为实施例1中制得的荧光探针在活性HeLa细胞中检测痕量锌离子的应用；

图12为实施例1中制得的荧光探针的质谱

图13为实施例1中制得的荧光探针的质谱Ms谱图；

图14为实施例1中制得的荧光探针的红外IR谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。

其中，实施例中各种属离子溶液是由纯度为99％以上的氯化盐化学试剂如无水氯化锌、无水氯化铁、氯化锌等加去离子水配置而成的。

实施例1

基于色酮-3-甲醛为母体的荧光探针ENO的具体合成路线：

(1)制备中间体1-异喹啉酰肼

将异喹啉-1-羧酸(1.73g,10mmol)溶解于甲醇溶剂(50mL)中，搅拌溶解的条件下，滴加市售浓硫酸(98％)(1mL)作为催化剂，然后将反应体系升温至70℃搅拌回流12个小时。将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗产物异喹啉羧酸甲酯。向含有粗产品的圆底烧瓶加入水合肼(0.1g,20mmol)和有机溶剂甲醇(30mL)，继续升温至70℃搅拌回流3个小时。反应结束后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，粗产物通过柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:3)得到目标原料异喹啉酰肼(1.45g，78％)。

所得到的中间体异喹啉酰肼结构式为：

(2)制备基于色酮-3-甲醛为母体的锌离子荧光探针ENO

在50mL含有20ml有机溶剂甲醇的圆底烧瓶中，分别加入异喹啉酰肼(A)(0.187g,1mmol)和色酮-3-甲醛(B)(0.174g,1mmol)，搅拌溶解后，将反应体系升温至80℃回流搅拌3个小时。TLC跟踪反应检测，反应完成后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶(DMSO:H

所得到的荧光探针化合物结构式为：

本荧光探针的表征数据

实施例1中制得的荧光探针的氢谱(

实施例2

将实施例1制得的锌离子检测荧光探针ENO用EtOH配置成1mM的探针储备液，各金属离子用去离子水配置成3mM的金属离子储备液，向3mL的空白溶液(EtOH:H

取两个比色皿，分别加入3mL含有探针储备液(30μL)的混合溶液(EtOH:H

如图2所示，锌离子检测荧光探针对各种常见金属离子选择性荧光光谱图。向3mL的空白溶液(EtOH:H

如图3所示，锌离子检测荧光探针对不同浓度锌离子(Zn

如图4所示，锌离子检测荧光探针在不同干扰金属离子存在的情况下与锌离子反应后的荧光强度柱状图。向3mL的空白溶液(EtOH:H

如图5所示，通过Job's plot方法研究了探针与Zn

如图6所示，向3mL的空白缓冲液(EtOH:H

如图7所示，用1M HCl和1M NaOH调节分别含有探针ENO储备液(10μL)以及[ENO-Zn

如图8所示，荧光探针以及[ENO-Zn

如图9所示，将滤纸浸入含有荧光探针(10μM)的EtOH:H

如图10所示，将HeLa细胞以每孔约7000个细胞的密度接种到96孔培养板中，并在37℃下在5％CO

上述实验说明以异喹啉酰肼和色酮-3-甲醛为荧光基团，通过缩合反应制备具有色酮-异喹啉为母体荧光探针ENO，该探针对溶液中Zn