用于扩增GJB2基因和SLC26A4基因的引物组、试剂盒和方法

摘要

本发明提出了一种引物组，所述引物组包括：48对引物，所述48对引物具有如SEQ IDNO：1～96所示的核苷酸序列。利用本发明的引物组通过两个反应即可扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，且根据引物组上的标签数量可实施多样本加到一个反应管中同时建库，可以一次同时检测上百甚至上千个样本，通量高并可规范操作，适用于非诊断目的的耳聋基因检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及用于扩增GJB2基因和SLC26A4基因的引物组、试剂盒和方法。

背景技术

目前，测序方法主要有如下几种：

(1)目标区域捕获测序：

目标区域测序(Target Region Sequencing,TRS)是根据感兴趣的基因组区域设计特异性探针，与基因组DNA进行液相杂交，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用第二代测序技术进行测序的研究策略。例如Agilent SureSelect Target EnrichmentSystem液相捕获，是基于120mer的RNA寡核苷酸探针或者叫“baits”。Baits上连接的生物素，可以被链霉亲和素标记的磁珠吸附。打断后的基因组片段，与baits进行杂交，捕获目标片段。利用磁珠吸附出带有baits的DNA片段后，进行磁珠洗脱、RNA探针降解，最终获得目标区域DNA片段。

(2)飞行时间质谱技术：

基于时间飞行质谱(MALDI-TOF)检测SNP(目标位点)原理如下：首先通过PCR扩增出含有SNP位点的一段DNA(SNP位点前后各50bp左右)，然后用SAP酶去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，然后加入一单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，采用四种ddNTP替代dNTP。这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。

(3)Sanger测序技术：

利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，终止点由反应中相应的双脱氧而定。

采用上述几种测序方法存在如下缺点：

目标区域捕获测序：实验流程复杂，建库时间长，通量低，成本高。

飞行时间质谱技术：主要适用SNP分型检测，不适用于对某个基因组区域的每个位点的检测。

Sanger测序：一个反应只能对应检测一个目标区域，通量低，成本较高。

多重聚合酶链反应(PCR)是在同一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区域进行特异性的扩增，从而得到多个目的片段。自1988年首次提出这个概念以来，该方法已成功应用于许多领域的DNA检测，包括基因缺失检测、多态性分析、定量分析和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等。将用于检测不同目的片段的多重PCR结合在一起，实现了对同一反应体系的同步检测，克服了成本高的缺点，并提高该测试的诊断能力。对于某些病原微生物、某些遗传病、癌基因等，型别比较多，多重PCR技术可提高其检出率，并鉴定其型别及突变等。多重PCR技术能够同时对多个目标区域进行检测，大幅提升检测效率的和能降低检测成本，因此得到广泛的应用。

耳聋是人类最常见的疾病，在新生儿发病率为1‰至31‰，随着年龄增长，耳聋患病率逐渐增高。在由遗传因素导致的耳聋患者中(约50％)，其中非综合征型耳聋为70％，综合征型耳聋为30％。非综合征性遗传性耳聋中，80％为常染色体隐性遗传(AR)，15％-20％为常染色体显性遗传(AD)，1％为X连锁或线粒体遗传。与非综合征型耳聋相关的最常见基因是GJB2基因，该基因占所有AR非综合征型耳聋的50％，占所有先天性耳聋的20％。SLC26A4基因被认为是AR非综合征性耳聋第二常见基因，仅次于GJB2基因。已经报道了超过500种不同的SLC26A4突变，每个民族都有自己特有的突变。另外与SLC26A4基因隐性突变相关的Pendred综合征是最常见的遗传性感音神经性耳聋综合征，约90％的Pendred综合征患者含有SLC26A4的致病突变。选择耳聋最常见的基因GJB2和SLC26A4进行检测，利用一种低成本通量高的检测技术鉴定基因状态，不仅可以辅助临床明确病因，而且还可以给耳聋高危人群或孕前人群进行生育指导。对于耳聋基因检测普及和推广具有重要意义。

然而，目前通过多重PCR技术同时对GJB2基因和SLC26A4基因进行扩增检测的方法仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了引物组和试剂盒及其用途、非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法、构建文库的方法、测序文库和测序方法，利用该引物组通过两个反应即可扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，且根据引物组上的标签数量可实施多样本加到一个反应管中同时建库，可以一次同时检测上百甚至上千个样本，通量高并可规范操作，适用于非诊断目的的耳聋基因检测。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种引物组。根据本发明的实施例，所述引物组包括：48对引物，所述48对引物具有如SEQ ID NO：1～96所示的核苷酸序列。根据本发明实施例的引物组可以分为两组，分别进行一步多重PCR反应，即可特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而可适用于对上述两个基因的科学研究和耳聋基因的非诊断目的检测。

根据本发明的实施例，上述引物组还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述48对引物中的每条引物的5’端进一步含有标签序列。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述引物组在扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因中的用途。如前所述，根据本发明实施例的引物组可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而实现上述两个基因的检测，可应用于科学研究和疾病的筛查诊断，例如耳聋疾病。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述引物组在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因。如前所述，根据本发明实施例的引物组可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而实现上述两个基因的检测。

根据本发明的实施例，所述试剂盒用于筛选携带耳聋基因突变的生物样本。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒含有前面所述引物组。由此，根据本发明实施例的试剂盒可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而实现上述两个基因的检测，可应用于科学研究和耳聋基因的非诊断目的检测。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：以前面所述引物组或试剂盒中的引物组作为引物，对DNA片段进行多重PCR扩增。利用前面所述引物组作为引物，可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域。

根据本发明的实施例，基于25μL的反应体系，所述扩增的反应体系如下：DNA片段的用量为1～5μL，浓度为3～6ng/μL；聚合酶液的用量为10～15μL；所述引物组的用量为1～4μL，浓度为0.1～0.3μM；水的用量为5～10μL。

根据本发明的实施例，所述扩增的反应程序如下：

在本发明的又一方面，本发明提出了一种构建文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法对DNA片段进行多重PCR扩增，并将所得扩增产物进行纯化，得到纯化产物；将所述纯化产物进行5’末端磷酸化、3’末端加碱基A和连接接头元件；将上步所得DNA片段进行PCR扩增，并将所得扩增产物进行纯化，得到测序文库。如前所述，根据本发明实施例的引物组可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因，将扩增产物进行纯化、5’末端磷酸化、3’末端加碱基A和连接接头元件后，再次进行PCR扩增，可以将片段进行富集，有助于后续测序结果的准确性。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种测序文库。根据本发明的实施例，所述测序文库是通过前面所述构建文库的方法获得的。由此，利用根据本发明实施例的测序文库进行测序，可以有效地获知GJB2基因和SLC26A4基因信息，有助于对这两个基因的科学研究或耳聋基因的非诊断目的检测。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前面所述测序文库进行测序。利用根据本发明实施例的测序方法可以有效地获知GJB2基因和SLC26A4基因信息，有助于对这两个基因的科学研究或耳聋基因的非诊断目的检测。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1和图2分别显示了根据本发明实施例1的检测流程示意图；

图3显示了根据本发明实施例2的目标区域捕获测序和多重PCR测序突变位点reads比例图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了引物组及其用途、试剂盒、非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法、构建文库的方法、测序文库和测序方法，下面将分别对其进行详细描述。

引物组

在本发明的一个方面，本发明提出了一种引物组。根据本发明的实施例，所述引物组包括：48对引物，所述48对引物具有如SEQ ID NO：1～96所示的核苷酸序列。

本发明使用Primer3设计一套多重引物，并对引物的特异性、多态位点和多重PCR引物间相互作用进行检查，最终设计了一组用于扩增GJB2基因(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004004.6)和SLC26A4基因(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000441.2？report＝fasta)的引物对组(共48对)。采用上述引物组可以分为两组，分别进行一步多重PCR反应，即可特异性扩增出GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域。

表1引物序列

根据本发明的实施例，48对引物中的每条引物的5’端进一步含有标签序列。表1中的各引物不含有标签序列，通过在每条引物上设置标签序列，可以将多个样本加到一个反应管中同时建库，实现依次同时检测上百甚至上千个样本，通量高并可规范化操作，适于大规模地基因研究或疾病筛查。具体地，可以在各条引物的5’端增加标签序列CTCACTAT。

用途

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述引物组在扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因中的用途。如前所述，根据本发明实施例的引物组可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而实现上述两个基因的检测，可应用于科学研究(例如云基因数据库的建立、基因功能、基因调控等研究)和疾病的筛查诊断，例如耳聋疾病。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述引物组在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因。如前所述，根据本发明实施例的引物组可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而实现上述两个基因的检测。

根据本发明的实施例，所述试剂盒用于筛选携带耳聋基因突变的生物样本。GJB2基因和SLC26A4基因为耳聋疾病的最常见基因，通过对这两个基因的检测，可以辅助临床诊断，及早地发现耳聋的致病原因。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对引物组所描述的特征和方法，同样适用于上述两方面的用途，在此不再赘述。

试剂盒

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒含有前面所述引物组。由此，根据本发明实施例的试剂盒可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而实现上述两个基因的检测，可应用于科学研究和疾病的筛查诊断，例如耳聋疾病。

非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：以前面所述引物组或试剂盒中的引物组作为引物，对DNA片段进行多重PCR扩增。利用前面所述引物组作为引物，可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域。

根据本发明的实施例，基于25μL的反应体系，所述扩增的反应体系如下：DNA片段的用量为1～5μL，浓度为3～6ng/μL；聚合酶液的用量为10～15μL；所述引物组的用量为1～4μL，浓度为0.1～0.3μM；水的用量为5～10μL。具体地，针对全血DNA-和干血片DNA(煮沸法提取)的反应体系分别如下。所述扩增的反应程序如下。采用该反应体系和反应程序，可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域。

表2全血DNA-反应体系：

表3干血片DNA-反应体系：

表4扩增反应程序

根据本发明实施例的干血片提取DNA的步骤如下：

(1)采用手动打孔仪将血片打入扳中；

(2)加核酸提取试剂：向管中加入120μl的试剂后，盖好管盖。

(3)100℃温浴：放入100℃的恒温混匀仪中温浴10min。

(4)样本保存：取出离心管，待冷却至室温后，进行4000rpm离心5min。将样本放入冰箱中保存。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对引物组和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法，在此不再赘述。

构建文库的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种构建文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法对DNA片段进行多重PCR扩增，并将所得扩增产物进行纯化，得到纯化产物；将所述纯化产物进行5’末端磷酸化、3’末端加碱基A和连接接头元件；将上步所得DNA片段进行PCR扩增，并将所得扩增产物进行纯化，得到测序文库。并且，该构建方法通量高，成本低，适于规模化应用。

利用前面所述引物对DNA片段进行扩增(多重PCR)。将进行5’末端磷酸化、3’末端加碱基A和连接接头元件后的DNA片段进行PCR扩增(采用通用引物)，以便于富集目标片段，利于后续测序。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法所描述的特征和优点，同样适用于该构建文库的方法，在此不再赘述。

测序文库

在本发明的又一方面，本发明提出了一种测序文库。根据本发明的实施例，所述测序文库是通过前面所述构建文库的方法获得的。由此，利用根据本发明实施例的测序文库进行测序，可以有效地获知GJB2基因和SLC26A4基因信息，有助于对这两个基因的科学研究或耳聋基因的非诊断目的检测。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对构建文库的方法所描述的特征和优点，同样适用于该测序文库，在此不再赘述。

测序方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前面所述测序文库进行测序。利用根据本发明实施例的测序方法可以有效地获知GJB2基因和SLC26A4基因信息，有助于对这两个基因的科学研究或耳聋基因的非诊断目的检测。并且，检测通量高，成本低，适于规模化应用。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对测序文库所描述的特征和优点，同样适用于该测序方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

参考图1和图2，采用如下方法进行测序，目标基因为GJB2基因和SLC26A4基因。

1、提取DNA

全血提取：按MagPure Blood DNA KF Kit说明书进行提取

1)按下表将样品和试剂转移DW Plate中，并用标鉴笔标下板的名称。

2)启动KingFisher Bindit 3.3程序，导入MagPure_Blood_DNA_Std_FL程序。

3)执行程序，按提示将装有样品或试剂的96孔板放到仪器对应的槽中。

4)约12分钟后，机器暂停。

5)取出样品板(Sample Plate)，每孔加入400μl Buffer BD(已用乙醇稀释)。Buffer BD使用前须用无水乙醇进行稀释。

6)把样品板放回仪器中，继续启动程序。约35分钟后程序执行完毕。

7)取出DNA样品，用Qbit进行定量。

2、引物的订购与引物mix配制

订购的含有不同序列标签的引物干粉，8000rpm离心5min，按照管壁要求加入TE溶解，并振荡离心，此时引物浓度为100μM。然后配制引物Mix1(表1中组1的引物，并在每条引物的5'端增加一个标签序列CTCACTAT)和引物Mix2(表1中组2的引物，并在每条引物的5'端增加一个标签序列CTCACTAT)。

3、多重PCR(一个样本需要两个反应)

1)将Templet DNA、2×KAPA 2G Fast Multiple Mix、Primer Mix(含有标签序列)从-20℃取出，待融化之后涡旋振荡混匀。

2)准备2个96孔板，依次加入全血DNA(5ng/ul)或干血片DNA、2×KAPA 2G FastMultiple Mix、Primer Mix1(well1)和Mix2(well2)和Nuclease-Free H

3)将加好试剂的96孔板放入PCR仪，按照以下表中程序设置并运行，运行完毕后放冰箱4℃保存。

反应体系和程序如下：

4、Pooling和纯化

1)well1和well2两个PCR产物板各吸出5μl混合到一个离心管中，10000rpm离心5min。

2)取60μl混合液上清液放入1.5ml的离心管中，加入1倍体积的已经振荡混匀的磁珠，充分混匀后静置10min。

3)将1.5ml离心管放在磁力架上，待磁珠完全吸附到管壁一侧后，将上清移除。

4)向1.5ml离心管中加入约500μl 80％乙醇对磁珠进行清洗，静置1min后将80％乙醇吸出，反复两次。

5)待磁珠表面风干后，将1.5ml离心管从磁力架上取下，并用约60μl的Nuclease-Free H

6)将1.5ml离心管放在磁力架上，待磁珠完全吸附到管壁一侧后，将上清吸出放到另一新的离心管中，并用Qubit 2.0定量。

5、文库构建

(1)加“A”和磷酸化

a)5:1dATP:dNTP(1mM)工作液配方

b)反应体系：

c)反应条件：37℃20min；75℃15min；4℃hold.

具体步骤如下：

1)根据上一步Qbit检测结果投入300ngDNA，并加水至40ul。

2)将10×T4 PNK Buffer、dATP和dNTP Mix(10mM)从-20℃条件下取出解冻，按照加“A”和磷酸化反应体系配制反应MIX，完成后向每个样本中加10ulMIX，最后涡旋混匀离心。

3)37℃条件下反应20min，75℃条件下反应15min。

(2)Adapter连接

a)反应体系：

b)反应条件：23℃20min；4℃hold。

具体步骤如下：

1)将2×Rapid Ligation Buffer、ATP和PE Adapter(12.5μM)从-20℃条件下取出解冻，按照加“Adapter连接”反应体系配制反应MIX，完成后向每个样本中加26μl MIX(注意每管加入不同的Adapter，每管加4μl)，最后涡旋混匀离心。

2)23℃条件下反应20min。

3)反应结束后，用1×磁珠纯化，纯化过程如下：

a)将上述反应产物放入1.5ml的离心管中，加入0.8倍体积的已经振荡混匀的磁珠，充分混匀后静置10min。

b)将1.5ml离心管放在磁力架上，待磁珠完全吸附到管壁一侧后，将上清移除。

c)向1.5ml离心管中加入约500μl 80％乙醇对磁珠进行清洗，来回转动离心管将磁珠清洗后将80％乙醇吸出，反复两次。

d)待磁珠表面风干后，将1.5ml离心管从磁力架上取下，并用22μl Nuclease-FreeH

e)将1.5ml离心管放在磁力架上，待磁珠完全吸附到管壁一侧后，将上清吸出放到另一新的离心管中。

(3)PCR反应

a)反应体系

b)反应程序

具体步骤如下：

1)将2×KAPA HiFi Mix、Primer-F(20μM)、Primer-R(20μM)从-20℃条件下取出解冻，融化后涡旋混匀。按照PCR反应体系配制反应MIX，完成后向每个样本中加30ulMIX，最后涡旋混匀离心。

2)将加好试剂的PCR管放入PCR仪，按照以下程序设置并运行：95℃预变性3min，98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，4个循环之后，72℃延伸5min，12℃保存。

3)将PCR反应产物用1×磁珠纯化，纯化过程如下：

3-1)将上述PCR产物放入1.5ml的离心管中，加入1倍体积的已经振荡混匀的磁珠，充分混匀后静置10min。

3-2)将1.5ml离心管放在磁力架上，待磁珠完全吸附到管壁一侧后，将上清移除。

3-3)向1.5ml离心管中加入约500μl 80％乙醇对磁珠进行清洗，来回转动离心管将磁珠清洗后将80％乙醇吸出，反复两次。

3-4)待磁珠表面风干后，将1.5ml离心管从磁力架上取下，并用约60μl Nuclease-Free H2O重新溶解磁珠，吸打混匀后静置10min。

3-5)将1.5ml离心管放在磁力架上，待磁珠完全吸附到管壁一侧后，将上清吸出放到另一新的离心管中，并用Qubit 2.0定量。

6、高通量平台测序

基于华大MGISEQ-2000平台的常规文库环化、Make DNB与上机，采用PE100的测序方式。

7、信息分析

经过Q20+、Q30+质控合格的测序数据，经过reads质量过滤、index拆分和样本分析(reads比对，统计有效深度与变异，INDEL重比对，碱基质量值校正，局部组装检测变异)最后整合结果，即可获得样本目标区域的变异信息。

检测80份样本，所有样本的目标区域覆盖度均在30X以上，平均深度在5000X以上。其中58例样本阳性样本共113个位点(经sanger验证)全部正确检出，敏感性100％，阴性结果全部一致，特异性100％。具体结果参见下表：

实施例2

将65个样本同时测试目标区域捕获测序和实施例1的多重PCR测序，其中，目标区域捕获测序方法参考文献(Sun Y,Yuan J,Wu L,et al.Panel-based NGS revealsdisease-causing mutations in hearing loss patients using BGISEQ-500platform[J].Medicine,2019,98(12).)。结果如图3所示，本发明中所设计的引物组对能够覆盖全部目标区域，且深度30X以上区域的覆盖度100％。本发明技术对于突变位点reads比例范围正常，在纯合突变reads比例上表现的目标区域捕获测序更优(更接近于1)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大基因股份有限公司

<120> 用于扩增GJB2基因和SLC26A4基因的引物组、试剂盒和方法

<130> PIDC3206087

<160> 98

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

gtctccctgt tctgtcctag c 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2

<400> 2

ggtgtgggga gatgagcag 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3

<400> 3

gagtgaattt aaggacatcg aggag 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4

<400> 4

ggcccacgga gaagactgt 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5

<400> 5

ggctgcagct aacaggtga 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 6

<400> 6

gctgcagcta catggtgtcg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 7

<400> 7

ggctccccaa ataccgagtc a 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8

<400> 8

tcggatatgg tctctactct gct 23

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 9

<400> 9

atggcccccg acgaaca 17

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 10

<400> 10

aggtttctat ctcaggcaaa ca 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 11

<400> 11

gcgtgtagca gcaggaagta t 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12

<400> 12

agaaagttca gcattatttg gttga 25

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 13

<400> 13

tggtggtcaa atcttcacag cat 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14

<400> 14

cttcctgaaa tactcagcga aggtc 25

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 15

<400> 15

gacacaaggg agaaggacga 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 16

<400> 16

cggtcttggc agctgttgta a 21

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 17

<400> 17

tttttcccta ggttatctgg gtgtt 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 18

<400> 18

tccttgctaa gtagccagaa atgta 25

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 19

<400> 19

taggtgccag gcattttaag taac 24

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 20

<400> 20

acagtgtgta ggtcttttgg at 22

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 21

<400> 21

ctctgagctt ccagtcaaag tga 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 22

<400> 22

tgactacgac cagttatggg a 21

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 23

<400> 23

caaaacattg tgtctttctt ttga 24

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 24

<400> 24

actctatcta cagaaccaag tgaaa 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 25

<400> 25

acccttgaat taatagaaac agagc 25

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 26

<400> 26

cacgctgcag acgatcctg 19

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 27

<400> 27

ccacatccgg ctatgggc 18

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 28

<400> 28

cgccttcatg tacgtcttct atgt 24

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 29

<400> 29

cctctggctc gcaggtcat 19

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 30

<400> 30

tggttgtgac tgagattgga ttga 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 31

<400> 31

actgtaactt tggtttgtga atgt 24

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 32

<400> 32

tgcagacaca ttgaacattt gtgat 25

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 33

<400> 33

tacagctaga gtcctgattg cca 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 34

<400> 34

ctttggttgg tggcttcaca aca 23

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 35

<400> 35

tttcactgct ggattgctca 20

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 36

<400> 36

ccatttcata tggagccaac ctgg 24

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 37

<400> 37

ttgttctcgg agatgctggc 20

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 38

<400> 38

cattgccttt gggatcagca ac 22

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 39

<400> 39

atcatcacat ggaaaaccat tccc 24

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 40

<400> 40

atcacatgat ggtacctgat acatt 25

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 41

<400> 41

tattccaaaa tacggctgtt cca 23

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 42

<400> 42

tgaagaacct caaggagtga agatt 25

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 43

<400> 43

gcgctgagga aaatacagaa act 23

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 44

<400> 44

tcataagtga tgctgtttca acaaa 25

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 45

<400> 45

tatgggcaga taaggttgtt aattg 25

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 46

<400> 46

ctggagcaat gcgggttct 19

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 47

<400> 47

ggagcatcag gtgggttgat g 21

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 48

<400> 48

gcagacttaa ggagaattca gttgt 25

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 49

<400> 49

tccaatgctg gtggagtgtt 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 50

<400> 50

cacgtgcatg gccactagga 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 51

<400> 51

tgcatggaga agccgtcgta 20

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 52

<400> 52

tccctctcat gctgtctatt tctt 24

<210> 53

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 53

<400> 53

tactcgggga gctgcg 16

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 54

<400> 54

cgctccgctt ctctctacg 19

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 55

<400> 55

gctggagacc agaactctca atc 23

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 56

<400> 56

agccaaaaca ctttaaacat gagc 24

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 57

<400> 57

acctgtataa ttccaaccag caga 24

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 58

<400> 58

agctgtgaga ccagcacttg 20

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 59

<400> 59

ccttaactgc catacagacg ac 22

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 60

<400> 60

cccccttggg atggatttaa ca 22

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 61

<400> 61

acactgcaat agcataagcc acc 23

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 62

<400> 62

cagtggtggc cacaaaacaa gag 23

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 63

<400> 63

tgcaatcggt atgcagagaa 20

<210> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 64

<400> 64

ggcaggaagc atataagaac caaat 25

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 65

<400> 65

ttgttctgtt tataggaaat ctggg 25

<210> 66

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 66

<400> 66

aaaccatcga cattgccata gaa 23

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 67

<400> 67

acctttgttg ctcttaattg tccac 25

<210> 68

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 68

<400> 68

tcctcatcag gctcaaaagc a 21

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 69

<400> 69

ctattgccaa agctccaaat gtat 24

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 70

<400> 70

tgtgtccttt ctaatgttgt cgt 23

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 71

<400> 71

tgtgtccttt ctaatgttgt cgt 23

<210> 72

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 72

<400> 72

actagacttg tgtaatgttt gcca 24

<210> 73

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 73

<400> 73

gggaattatg ttccctgaca gttc 24

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 74

<400> 74

gcagggtgtt gcagacaaag 20

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 75

<400> 75

ttcgatgcgg accttctgg 19

<210> 76

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 76

<400> 76

cagcaggatg caaattccag aca 23

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<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 77

<400> 77

cagcgtcttg cgctcct 17

<210> 78

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 78

<400> 78

aatgacgtca ctaagcagcc a 21

<210> 79

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 79

<400> 79

actgagatat gtcttgatgt tcca 24

<210> 80

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 80

<400> 80

atacagttcc attgctgctg g 21

<210> 81

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 81

<400> 81

ggggtcttgc ttactatttt agcac 25

<210> 82

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 82

<400> 82

tctggaatga acagtgaccc at 22

<210> 83

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 83

<400> 83

tcaaccaaat aatgctgaac tttct 25

<210> 84

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 84

<400> 84

ggagtatcag tgaaatgaag cttgt 25

<210> 85

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 85

<400> 85

agccctataa aaccagttca gca 23

<210> 86

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 86

<400> 86

attcctcgac ttgttctctg agatg 25

<210> 87

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 87

<400> 87

acacagctgc ataaacatcc ct 22

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 88

<400> 88

cagccccaga atgatggaca 20

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 89

<400> 89

taaacccaag tccagcaaat gtc 23

<210> 90

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 90

<400> 90

ctattcctga ttggacccca gt 22

<210> 91

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 91

<400> 91

taactgctct catcagggaa agg 23

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 92

<400> 92

ggattggcac tttgggaacg 20

<210> 93

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 93

<400> 93

gtgaccacag tcccagatag g 21

<210> 94

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 94

<400> 94

aaatggaacc ttgaccctct tga 23

<210> 95

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 95

<400> 95

tcctggacat caagttcttc ttcc 24

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 96

<400> 96

gctcatagag acctcccgaa 20

<210> 97

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 97

<400> 97

gaacgacatg gctacga 17

<210> 98

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 98

<400> 98

tgtgagccaa ggagttg 17