一种基于胶束-溶剂堆积对天然药物中多种砷形态同时在线堆积富集、分离方法

摘要

本发明公开一种基于胶束‑溶剂堆积对天然药物中多种砷形态同时在线堆积富集、分离方法。利用两性离子表面活性剂PAPS在共电渗流co‑EOF中通过电动注射和胶束到溶剂堆积MSS对As(Ⅴ)、As(Ⅲ)、MMA和DMA进行有效和灵敏的两步堆积毛细管区带电泳CZE。HDMB涂层熔融石英毛细管，以满足阴离子和毛细管之间相同EOF方向的条件。背景溶液为硼砂缓冲液。具体是胶束和目标分析物通过负压下的场增强样品注入堆叠；注射甲醇，其中被扫描的分析物由胶束带到MSS边界。本发明利用涂层毛细管电泳从胶束到溶剂堆积法检测天然药物中的砷，实现砷形态快速检测，提高毛细管电泳样品在线富集的灵敏度。

说明书

技术领域

本发明属于天然药物中砷形态的分离富集领域，涉及一种用毛细管电泳技术在线富集砷的方法，具体地说是一种基于胶束-溶剂堆积对天然药物中多种砷形态同时在线堆积富集、分离方法。

背景技术

砷(As)是地壳中的一种天然元素，含有50多种具有不同毒性的化合物，广泛分布于大气、水和土地。由于工业污染渗透到生活的方方面面，人们暴露于高浓度的无机砷，这是最有毒的物种。导致心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病或皮肤膀胱癌和肺癌的慢性砷中毒可由长期接触无机砷引起，主要通过饮用受污染的水、食用用此类水加工的食品以及用富砷水灌溉的食品。由于砷对人体的严重影响，被世界卫生组织(WHO)列为引起重大公共卫生问题的10种化学品之一。世卫组织关于饮用水中砷的最新指数为0.01mg/L，当剂量超过6×10

砷以无机形式(亚砷酸盐和砷酸盐)和有机形式(亚砷酸盐、砷胆碱、一甲基胂酸和二甲基胂酸)存在，不同种类的砷具有不同的毒性，其中无机砷化合物比有机砷化合物(如海产品中的砷化合物)更具毒性。迄今为止，电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和氢化物发生原子荧光光谱法(HG-AFS)是分离和分析砷物种最常用的组合技术。此外，还开发了其他重要的分析方法来检测实际样品中的痕量砷，如高效液相色谱法和电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)，ICP光学发射光谱法(ICP-OES)，和四极飞行时间质谱(ESI-qTOF-MS)。毛细管电泳(CE)具有很强的分离性能，但毛细管的短光程和小的进样量降低了其灵敏度。为了克服这些限制，CE中的各种在线样品预富集技术是富集砷物种的有效方法，包括现场强化样品注入(FESI)和瞬态等速电泳(t-ITP)。此外，许多与CE结合的技术，如CE与氢化物发生电热原子吸收光谱法(CE-HG-ETAAS)、CE-ICP-MS和CE与电喷雾质谱联用(CE-ESI-MS)，也是解决这些限制的理想方法。然而，毛细管电泳直接检测砷具有高效、简便的优点，具有巨大的吸引力。因此，应用一种新的高灵敏度预富集方法检测砷仍然是一个有趣的研究课题。

CE在线预浓缩的典型方法有FESI、t-ITP和动态pH连接。除上述富集技术外，胶束-溶剂堆积(MSS)是近年来新兴的在线样品浓缩技术之一。此外，瞬态捕获、通过胶束崩塌(AFMC)聚焦分析物以及胶束-环糊精堆叠(MCDS)对于类似地提高检测灵敏度是有利的。MSS最早由Joselito P.Quirino于2009年提出，通过在样品溶液中使用胶束和背景溶液(BGS)中使用有机溶剂逆转有机阳离子的有效电泳迁移方向来实现。聚焦效应是通过在胶束和有机溶剂修饰的BGS之间的边界区，目标分析物的有效电泳迁移率的反转来实现的。MSS优越的检测灵敏度引起了广泛关注，并在此基础上不断创新。创新主要集中在胶束的类型以及有机溶剂和胶束的位置。一般来说，以前的大多数研究都集中在使用阳离子表面活性剂检测和分离MSS中的阴离子分析物。MSS中通常有三种模型：BGS中有机溶剂和胶束中混合样品的一步堆叠，BGS中有机溶剂和样品及胶束注入的两步堆叠，以及有机溶剂、分析物和胶束注入的三步堆叠，分别用于检测各种化合物。在电动喷射和流体动力喷射之间选择喷射模型也可以显著提高性能，特别是在实现最低检测限方面。根据上述说法，开发一种更灵敏、更有效的MSS技术是值得探索的。

本发明建立了一种新的两步叠加模型，用于检测涂层毛细管区带电泳(CZE)中的四种砷。用海美溴铵(HDMB)对毛细管壁进行涂层，这是反转电渗流的重要步骤。两性离子表面活性剂3-(N，N-二甲基棕榈氨基)丙烷磺酸盐(PAPS)作为胶束和目标分析物混合后作为样品溶液通过负电压电动注入引入，然后再单独注入有机溶液，促进形成MSS边界，以实现样品堆积的关键步骤。研究了多种优化条件，包括胶束类型和浓度、甲醇百分比、硼砂缓冲液浓度和进样时间，以提高堆积效率和分辨率。该方法用于海带中砷的测定。

发明内容

本发明的目的针对现有技术的不足，提供一种基于胶束-溶剂堆积对天然药物中多种砷形态同时在线堆积富集、分离方法，比以往富集方法更加快速高效灵敏，适用于具有复杂基质的天然药物中砷的检测。

本发明方法采用以下技术方案实现：

步骤(1)、目标分析物样品制备：

将天然药物洗净干燥、粉碎后过筛与HNO

作为优选，所述天然药物指代海带；

作为优选，天然药物与HNO

作为优选，HNO

作为优选，离心的转速为4000-5000r/min；

步骤(2)、目标分析物样品富集、分离：

2-1、活化毛细管柱

采用1％(w/v,g/mL)海美溴铵(HDMB)涂层熔融石英毛细管20-25分钟，以满足阴离子和毛细管之间相同EOF方向的条件。

2-2、对活化毛细管柱进样前进行硼砂缓冲液冲洗5-10分钟。

作为优选，所述硼砂缓冲液浓度为25-100mM，优选为100mM。

作为优选，所述硼砂缓冲液pH为8.8-9.4，更为优选为9.2。

2-3、毛细管柱中，胶束和目标分析物混合后作为样品溶液在负压下注入堆叠30-240s，然后负压下注射作为有机溶剂的甲醇水溶液，被扫描的分析物由胶束带到MSS边界，以实现样品堆积、分离；其中所述胶束采用3-(N，N-二甲基棕榈氨基)丙烷磺酸盐PAPS。

作为优选，毛细管电泳条件：检测波长为192nm，分离负压为-20kV，温度为20℃。

作为优选，所述胶束浓度为10-40mM，更为优选为20mM。

作为优选，所述胶束的注入时间为180s。

作为优选，所述胶束的注入负压为-10kV。

作为优选，所述甲醇水溶液的进样参数为注射动力-10kV、注射压力50mbar、注射时间5s。

作为优选，所述甲醇水溶液体积含量为40-100％(v/v)，优选为60％(v/v)。

上述多种砷形态的富集因子分别为[As(Ⅴ)、As(Ⅲ)、MMA和DMA]1230、840、3820和1450。检测限(S/N＝3)范围为0.382至0.911ng/mL。毛细管内重复性(％RSD，N＝3)迁移时间为0.5-1.0％，峰面积为0.3-0.9％。

本发明的优点在于：

(1)本发明提出涂层CE中的电动进样辅助MSS。

(2)本发明提出两性离子表面活性剂3-(N，N-二甲基棕榈氨基)丙烷磺酸盐PAPS作为MSS中的胶束溶液，然后用海美溴铵HDMB逆转EOF。

(3)本发明提出与CZE中典型注射液相比，As(V)、As(Ⅲ)、MMA和DMA的富集因子分别为1230、840、3820和1450。

(4)本发明利用涂层毛细管电泳从胶束到溶剂堆积法检测天然药物中的砷，该方法不仅实现了砷形态的快速检测，也极大地提高了毛细管电泳样品在线富集的灵敏度。与传统的砷检测方法相比，该方法实现了典型砷形态的高效检测和分离。

附图说明

图1是本发明的富集机理图。

图2是胶束种类的影响(PAPS、CTAB、CTAC)；其中CE条件：样品溶液中胶束浓度为10mM，分析物浓度为10mg/L，-10kV下注射60s；MeOH(100％)在50mbar下注射5s；背景溶液：100mM硼砂缓冲液。

图3是PAPS浓度的影响(0,5,10,20,30,40mM)；其他CE条件与图2相同。

图4是甲醇含量的影响(40％,60％,80％,100％)；CE条件：与图2相同。

图5是硼砂浓度的影响(25,50,75,100mM)；A：电泳图，1-As(Ⅴ),2-MMA,3-DMA,4-As(Ⅲ)；(B)表观迁移率，CE条件：样品溶液中PAPS浓度为20mM，分析物浓度为10mg/L，-10kV下注射60s；MeOH(60％)在50mbar下注射5s；背景溶液：100mM硼砂缓冲液。

图6是缓冲液pH的影响(8.8,9.0,9.2,9.4)；其他条件与图5相同。

图7是样品注射时间的影响(30,60,120,180,240s)；分析物浓度为1mg/L，其他条件与图6相同。

图8A是最优条件下分析海带的加标电泳图60s(a)和5s(b)。

图8B是通过两步法叠加和典型注射标准溶液的电泳图；两步堆叠：将含有1mg/L分析物混标和20mM PAPS的样品溶液在-10kV下注入180s。甲醇(60％)50mbar注射5s，典型注射：无胶束的目标分析物50mbar注射3s，混合砷浓度为10.0mg/L。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，提出了本发明的技术方案，其主要是依据至少包括：1)本发明利用两性离子表面活性剂3-(N，N-二甲基棕榈氨基)丙烷磺酸盐(PAPS)在共电渗流(co-EOF)中通过电动注射和胶束到溶剂堆积(MSS)对四种砷物种[As(Ⅴ)、As(Ⅲ)、一甲基胂酸钠(MMA)和二甲基胂酸钠(DMA)]进行有效和灵敏的两步堆积毛细管区带电泳(CZE)。(2)用海美溴铵(HDMB)对毛细管壁进行涂层，逆转EOF，以满足阴离子和毛细管之间相同EOF方向的条件。(3)本发明将两性离子表面活性剂3-(N，N-二甲基棕榈氨基)丙烷磺酸盐(PAPS)作为胶束和目标分析物混合后作为样品溶液通过负电压电动注入引入，然后再单独注入有机溶液，形成MSS边界以实现样品堆积。当施加负分离电压时，在强反向EOF作用下，所有化合物都向阳极迁移。有机溶剂的存在使滞留因子(κ)降低。当κ降低到分析物有效电泳迁移率[μ

式中，μ

最后，在连续电场作用下，所有表面活性剂都穿过MSSB，堆叠的分析物通过CZE进行分离。由于四个As物种在电泳中具有不同的迁移速率，因此它们依次通过紫外检测器被检测分析。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

图1是本发明的富集机理图，一种基于胶束-溶剂堆积对天然药物中多种砷形态同时在线堆积富集、分离方法，包括如下步骤：

步骤(1)、目标分析物样品制备：

将天然药物洗净干燥、粉碎后过筛与HNO

作为优选，所述天然药物指代海带；

作为优选，天然药物与HNO

作为优选，HNO

作为优选，离心的转速为4000-5000r/min；

步骤(2)、目标分析物样品富集：

2-1、活化毛细管柱

采用1％(w/v,g/mL)海美溴铵(HDMB)涂层熔融石英毛细管20-25分钟，以满足阴离子和毛细管之间相同EOF方向的条件。

2-2、对活化毛细管柱进样前进行硼砂缓冲液冲洗5-10分钟。

作为优选，所述硼砂缓冲液浓度为25-100mM，优选为100mM。

作为优选，所述硼砂缓冲液pH为8.8-9.4，更为优选为9.2。

2-3、毛细管柱中，胶束和目标分析物混合后作为样品溶液在负压下注入堆叠30-240s，然后负压下注射作为有机溶剂的甲醇水溶液，被扫描的分析物由胶束带到MSS边界，以实现样品堆积、分离；其中所述胶束采用3-(N，N-二甲基棕榈氨基)丙烷磺酸盐PAPS。

作为优选，毛细管电泳条件：检测波长为192nm，分离负压为-20kV，温度为20℃。

作为优选，所述胶束浓度为10-40mM，更为优选为20mM。

作为优选，所述胶束的注入时间为180s。

作为优选，所述胶束的注入负压为-10kV。

作为优选，所述甲醇水溶液的进样参数为注射动力-10kV、注射压力50mbar、注射时间5s。

作为优选，所述甲醇水溶液体积含量为40-100％(v/v)，优选为60％(v/v)。

以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

CE条件为：

检测波长：192nm。柱温：20℃。

毛细管柱：内径50μm，外径375μm，长度60cm，有效长度51.5cm。在第一次使用之前，新的毛细管柱要用1.0M NaOH溶液冲洗20分钟，0.1M NaOH溶液冲洗15min，纯水冲洗10min，1％HDMB涂层30min,运行缓冲液冲洗10min。为了实现良好的重复性，两针间用0.1M NaOH溶液冲洗2分钟，纯水冲洗2分钟，运行缓冲液冲洗5分钟。

分离电压：-20kV。

数据记录：HP化学工作站(Agilent)。

实施例1.考察胶束种类对检测效果的影响

将海带洗净干燥，粉碎之后通过100目筛，然后各准确称取200mg样品并置于15mL离心管中，加入5mL的2％HNO

采用1％海美溴铵(HDMB)涂层熔融石英毛细管20分钟，以满足阴离子和毛细管之间相同EOF方向的条件。对活化毛细管柱进样前进行pH为9.2、100mM硼砂缓冲液冲洗5分钟。毛细管柱中，10mM胶束和10mg/L目标分析物混合后作为样品溶液在-10kV下注入堆叠60s，然后-10kV下50mbar注射100％MeOH5s，被扫描的分析物由胶束带到MSS边界，以实现样品堆积、分离；其中所述胶束采用3-(N，N-二甲基棕榈氨基)丙烷磺酸盐PAPS。毛细管电泳条件：检测波长为192nm，分离负压为-20kV，温度为20℃。

阳离子表面活性剂是形成MSS过程的关键因素，它显著地影响了富集和分离效率。本实施例采用三种表面活性剂溶液PAPS、CTAB或CTAC作为胶束，以评价胶束对四种目标分析物堆积效率的影响。

如图2所示，与使用CTAC(c)相比，CTAB(b)使用可以获得更长的迁移时间和更高的灵敏度，CTAC的基线比CTAB更不均匀。同时，当CTAB和CTAC作为胶束时，As(V)峰不明显。显然，当应用PAPS(a)时，四种分析物的检测灵敏度最高，令人满意的分辨率最高。这可能是由于PAPS是一种含有季铵盐阳离子和磺酸阴离子的季铵盐两性表面活性剂。由于CMC(0.79×10-4M)最低，两性离子表面活性剂可以逆转EOF，减少分析物和涂层壁的吸附。它具有良好的表面性能，并与被分析物具有明显的协同效应。因此，选择了PAPS作为后续工作的胶束。

实施例2.考察PAPS浓度对检测效果的影响

在实施例1的基础上，选择PAPS作为胶束，并将PAPS浓度更改为0、5、10、20、30、40mM，其他条件不变。

胶束的浓度是影响胶束到溶剂堆积边界(MSSB)形成的关键参数。因此，对样品溶液中不同PAPS浓度进行分析，结果如图3所示。当表面活性剂浓度为0-20mM变化时，As(V)、MMA和DMA的峰面积逐渐增加，而胶束浓度为5-10mM时，As(Ⅲ)的峰面积急剧减少。而PAPS浓度从20mM进一步增加到40mM，四种分析物的峰高均略有降低。证明PAPS浓度的增加对MSS过程中胶束的形成有负面影响，因为低浓度的有机溶剂不符合逆转高κ分析物的μ*ep(a’)的条件。如果其浓度过高，则两性离子表面活性剂与分析物之间的亲和力过强，无法逆转MSSB处的μep(a’)，从而导致MSS的失败。结果，在样品基质中选择了20mM的PAPS。

实施例3.考察甲醇含量对检测效果的影响

在实施例1的基础上，选择PAPS作为胶束，并将MeOH的浓度更改为40、60、80、100％(v/v)，其他条件不变。

甲醇通常是MSS中的一种有机溶剂，它影响分析物和胶束之间的相互作用，逆转有效的电泳迁移率以实现富集。本实施例将MeOH单独注入两步叠加，将MeOH的百分比优化在40-100％(v/v)范围内，以获得其他条件下分析物的最佳分辨率和富集。

所得结果如图4所示。除As(Ⅲ)外，当甲醇浓度为40％(v/v)时，其他三种化合物的峰面积均小于使用60％时的峰面积。但当MeOH含量为60％～100％(v/v)时，三种化合物[As(V)、MMA、DMA]的峰值强度降低，随着MeOH百分比的增加，分析物的迁移时间延长。其原因可以证明被分析物对胶束的亲和力较弱，导致了较低的κ值，这是在有机溶剂的存在下发生的。随着甲醇百分比的增加，由于分析物对胶束的亲和力降低，κ值降低，从而扩大了扫描区的长度。然而，当应用80％(v/v)MeOH时，As(III)的检测灵敏度最高。因此，选择60％(v/v)MeOH进行进一步研究。

实施例4.考察硼砂浓度对检测效果的影响

在实施例1的基础上，选择PAPS作为胶束，并将硼砂缓冲液的浓度更改为25、50、75、100mM，其他条件不变。

在BGS中使用硼砂缓冲液作为电解液，本实施例探究BGS中电解质的浓度对迁移时间和峰值强度均有显著影响。

图5A的电泳图显示，从25到100mM，表观迁移率(μapp)降低，与迁移时间成反比，结果如图5B所示。值得注意的是，溶液电流的增加是由于浓度的增加而引起的。证明EOF受硼砂缓冲液浓度的影响，缓冲液浓度随着BGS中硼砂缓冲液浓度的增加而降低。此外，增加的电流产生了更多的焦耳热量，这将导致基线噪声的增加(16-65μA)。综合考虑，本发明优选100mM的硼砂缓冲液。

实施例5.考察缓冲液pH对检测效果的影响

在实施例1的基础上，选择PAPS作为胶束，并将硼砂缓冲液的pH更改为8.8、9.0、9.2、9.4，其他条件不变。

砷化合物在CE中的迁移也受到其pKa值的影响，因此有必要研究BGS pH对砷种类分析的影响。本发明中砷种类为多基因酸，其表观电荷与它们自身的pKa以及BGS的pH有关。BGS pH为8.8-9.4，因为实验前研究表明，两步叠加在碱性pH下分析BGS更有效。此外，碱性条件确保了所有的As都以阴离子的形式迁移到阳极。

结果表明，当pH值为9.0时，表观迁移率达到了最大值(图6)。当pH从9.0上升到9.4时，表观迁移率开始下降，迁移时间延长。在共电渗流模式下，由于熔融二氧化硅的表面被HDMB修饰，因此As物种的迁移方向与EOF相同。因此，被分析物的分离速度更快。同时，当BGS的pH为9.2时，四种分析物之间的分离度良好，在pH为9.2时得到最大峰值。为了获得更高的灵敏度，当表观迁移率低于9.0时，最好选择pH为9.2作为BGS。

实施例6.考察样品注射时间对检测效果的影响

在实施例1的基础上，选择PAPS作为胶束，并将样品溶液的注入时间更改为30、60、120、180、240s，其他条件不变。

注入时间通过直接改变注入体积，影响了分析物在MSS中的检测灵敏度、令人满意的分离效率和高堆积性能。60％甲醇的注入时间保持在5s(50mbar)，样品溶液的注入时间变化为30-240s。

从图7可以看出，从直方图中可以看出，当注射时间为30-180s时，通过扩大注射体积，增加了目标分析物的峰面积，获得了令人满意的堆积效率。然而，随着注入时间的逐渐增加，峰形变宽，基线紊乱，分析时间相对较长。在240s注射时，与180s相比，峰面积没有进一步扩大，四个分析物峰的最小分辨率(1.17)出现，导致分析物的灾难性分离。基于上述结果，优选180s为最佳注入时间，以获得令人满意的堆积效率和良好的分辨率。

重复性考察

在上述最佳实验条件下，计算了四种砷物种的毛细血管内和毛细血管间重现性的线性、检测限(LODs)和定量(LOQs)(n＝3)。有关业绩的分析数字总结见表1。制备含砷0.05、0.10、0.25、0.50、1.00mg/L和20mM PAPS5种浓度水平的标准样品溶液，得到校准曲线。用As(V)、MMA、DMA和As(Ⅲ)的峰面积计算的决定系数(R

表1.线性回归数据、LOD和LOQ

回收率实验

通过分析1mg/L作为标准溶液的添加海带，评价了所开发技术的实用性。根据样品检测结果，海带样品中未检测到As(Ⅲ)和As(V)但含有痕量的MMA和DMA。加标样品的分析结果见表2。海带的回收率为89.3-120.6％。三次平行实验的目的是为了获得本方法的重现性。迁移时间和峰值面积的RSD％分别从5.3变化到6.2和0.9-4.1。

表2.加标样品的分析结果