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一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法

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本发明公开一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法，包括步骤一、以野生型拟轮枝镰孢菌为出发菌制备原生质体，步骤二、向原生质体中导入拟轮枝镰孢菌尿嘧啶合成路径关键基因pyrG的上下游同源臂和CRISPR/Cas9载体，步骤三、敲除pyrG基因的全部序列得到尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体ΔFvpyrG；本发明以尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体为出发菌，对伏马菌素合成路径的关键基因FUM1进行敲除，实现了pyrG筛选标记在拟轮枝镰孢菌中的循环利用，对植物病原真菌拟轮枝镰孢菌的基因功能研究以及应用开发具有重要的意义。

著录项

公开/公告号CN114774456A

专利类型发明专利
公开/公告日2022-07-22

原文格式PDF
申请/专利权人中国农业科学院农产品加工研究所;
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申请/专利号CN202210412150.8
发明设计人郭维;唐婷婷;
展开▼

申请日2022-04-19
分类号C12N15/80;C12N15/60;C12N15/113;C12N1/21;C12N15/31;C12R1/77;
代理机构北京众合诚成知识产权代理有限公司;
代理人刘妮
地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号院
入库时间 2023-06-19 16:06:26

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2022-07-22

公开

发明专利申请公布

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法。

背景技术

拟轮枝镰孢菌是一种重要的植物病原真菌，可侵染玉米、高粱、小麦等多种作物。拟轮枝镰孢菌引起的玉米茎穗腐病以及真菌毒素污染是玉米产业健康发展的一大限制因素，其产生的伏马毒素FB1和FB2等均被世界卫生组织国际癌症研究机构列为2B类致癌物，因此对拟轮枝镰孢菌进行基因功能研究以寻找药物靶标来开发农药具有重要的经济意义。

传统的丝状真菌遗传转化中所使用的尿嘧啶营养缺陷型菌株主要依靠紫外诱变等方法获得，但是该方法得到的尿嘧啶营养缺陷型菌株残留相关基因片段，且可能带有未知表型的其他突变，对后续在该菌株基础上进行基因改造和功能研究存在一定的隐患，因此，本发明提出一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法以解决现有技术中存在的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提出一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法，该营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法通过具有剪切功能的Cas9蛋白以及具有识别功能的sgRNA，即可实现对特异性靶标位点的剪切，诱发生物体内的自我修复机制，在导入同源片段的情况下，实现基因序列的完全敲除。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法，包括以下步骤：

步骤一、以野生型拟轮枝镰孢菌为出发菌制备得到原生质体；

步骤二、向步骤一中制备的原生质体导入拟轮枝镰孢菌尿嘧啶合成路径关键基因pyrG的上下游同源臂和靶向pyrG基因前端位点的CRISPR/Cas9载体PFC332_pyrG_sgRNA-7G；

步骤三、将pyrG基因的上游-53bp至下游+107bp共1754bp序列完全敲除，得到尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体ΔFvpyrG。

进一步改进在于：所述步骤二中的pyrG的上下游同源臂为pyrG基因的上游1201bp片段和下游1202bp片段的融合片段，其中上游1201bp片段为-1254bp到-54bp之间的片段，下游1202bp片段为+108bp到+1309bp之间的片段。

进一步改进在于：所述步骤二中靶向pyrG基因前端位点的CRISPR/Cas9载体为PFC332_pyrG_sgRNA-7G，所述CRISPR/Cas9载体PFC332_pyrG_sgRNA-7G靶向的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法构建的营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体在基因敲除中的应用。

本发明的有益效果为：本发明以尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌为出发菌，对伏马菌素合成路径的关键基因FUM1进行敲除，实现了pyrG筛选标记在拟轮枝镰孢菌中的循环利用，对植物病原真菌拟轮枝镰孢菌的基因功能研究以及应用开发具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例一拟轮枝镰孢菌突变体构建流程图。

图2为本发明实施例一基因敲除中的应用流程图。

图3为本发明实施例一含有pyrG筛选标记基因的FUM1上下游同源片段构建流程图。

图4为本发明实施例一敲除载体pLBKOpyrG构建流程图。

图5为本发明实施例二突变体ΔFvpyrG菌株构建流程图。

图6为本发明实施例三突变体菌株ΔFvpyrG在FUM1基因敲除中的应用流程图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例一

根据图1-4所示，本实施例提供了一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法，包括以下步骤：

步骤一、以野生型拟轮枝镰孢菌为出发菌制备得到原生质体；

其中的pyrG的上下游同源臂为pyrG基因的上游1201bp片段和下游1202bp片段的融合片段，其中上游1201bp片段为-1254bp到-54bp之间的片段，下游1202bp片段为+108bp到+1309bp之间的片段；

靶向pyrG基因前端位点的CRISPR/Cas9载体为PFC332_pyrG_sgRNA-7G，所述CRISPR/Cas9载体PFC332_pyrG_sgRNA-7G靶向的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤三、将pyrG基因的上游-53bp至下游+107bp共1754bp序列完全敲除，得到尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体ΔFvpyrG。

根据上述方法构建的尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体在基因敲除中的应用，包括以下步骤：

S1、以得到的营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体ΔFvpyrG为出发菌制备得到原生质体；

S2、向S1中制备得到的原生质体中导入含有来源于拟轮枝镰孢菌的pyrG筛选标记基因的FUM1上下游同源片段以及靶向FUM1基因前后两个位点的CRISPR/Cas9载体PFC332_FUM1_sgRNA65+7845，对FUM1基因上游-274bp至内部的8114bp共8388bp序列的敲除；

其中含有pyrG筛选标记基因的FUM1上下游同源片段通过以下方法构建：

F1、RCP扩增FUM1基因的上游1478bp同源臂FUM1_UP及下游1371bp同源臂FUM1_DOWN；

F2、将F1中的FUM1_UP及FUM1_DOWN分别构建至含有pyrG筛选标记基因的敲除载体pLBKOpyrG上，构建得到FUM1敲除载体pLBKOpyrG_FUM1_U+D；

敲除载体pLBKOpyrG是通过以下方法构建的：

G1、以PZKO载体为模板，以RES_PtrpC_F/PtrpC_R为引物对扩增PtrpC启动子序列；

G2、以拟轮枝镰孢菌的基因组DNA为模板，以PtrpC_pyrG_CDS_F/pyrG_CDS_RES_R为引物对扩增pyrG基因的CDS序列；

G3、以RES_PtrpC_F/pyrG_CDS_RES_R为引物对，进行融合PCR，得到PtrpC_pyrG片段，其左端含有SacI、KpnI以及BamHI酶切位点，右端含有EcoRI和PacI酶切位点；

G4、通过pLB零背景快速克隆试剂盒，将PtrpC_pyrG片段连接至pLB载体中，得到pLBKOpyrG载体；

F3、以pLBKOpyrG_FUM1_U+D为模板，PCR扩增得到含有pyrG筛选标记基因的FUM1上下游同源臂片段pyrG_FUM1_U+D；

S3、通过平板筛选及PCR验证得到FUM1基因敲除突变体FvpyrGΔFUM1。

所用引物PtrpC_R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；引物PtrpC_pyrG_CDS_F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；引物RES_PtrpC_F核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；引物pyrG_CDS_RES_R核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，PCR扩增所得FUM1_UP核苷酸序列如SEQ IDNO.51所示；FUM1_DOWN核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示；PtrpC启动子核苷酸序列如SEQ IDNO.48所示；pyrG基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示；PtrpC_pyrG核苷酸序列如SEQID NO.50所示；pyrG_FUM1_U+D核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示。

实施例二

根据图5所示，本实施例以拟轮枝镰孢菌野生型菌株为出发菌，利用CRISPR/Cas9技术对pyrG基因进行敲除，构建了pyrG营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体ΔFvpyrG菌株，具体如下：

一、用于pyrG基因敲除的CRISPR/Cas9载体的构建

以PFC334载体为模板，以PFC334_PacI_F/pyrG_sgRNA-7G_R、pyrG_sgRNA-7G_F/PFC334_PacI_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行PCR，扩增得到pyrG_sgRNA-7G_1和pyrG_sgRNA-7G_2片段；

以pyrG_sgRNA-7G_1和pyrG_sgRNA-7G_2片段为模板，以PFC334_PacI_F/PFC334_PacI_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行融合PCR，扩增得到pyrG_sgRNA-7G片段。该片段为用于pyrG基因敲除的sgRNA表达框，其两端为PFC332载体PacI酶切位点左右两侧序列的同源臂；

限制性内切酶PacI单酶切PFC332载体，利用

引物PFC334_PacI_F核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，引物pyrG_sgRNA-7G_R核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，引物pyrG_sgRNA-7G_F核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，引物PFC334_PacI_R核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，PCR扩增所得pyrG_sgRNA-7G_1核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；pyrG_sgRNA-7G_2核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；pyrG_sgRNA-7G核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示。

二、用于pyrG基因敲除的同源臂片段的构建

以拟轮枝镰孢菌基因组DNA为模板，以pyrG_-1254F/pyrG_-53R、pyrG_+110F/pyrG_+1309R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行PCR，扩增得到pyrG_UP和pyrG_DOWN片段，其中，pyrG_UP为pyrG基因上游同源臂，pyrG_DOWN为pyrG基因下游同源臂；

以pyrG_UP和pyrG_DOWN片段为模板，以pyrG_-1254F/pyrG_+1309R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行融合PCR，扩增得到pyrG_U+D片段，该片段为用于pyrG基因敲除的同源臂片段。

所用引物pyrG_-1254F核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，引物pyrG_-53R核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，引物pyrG_+110F核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，引物pyrG_+1309R核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，PCR扩增所得pyrG_UP核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；pyrG_DOWN核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；pyrG_U+D核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示。

三、PEG介导的拟轮枝镰孢菌原生质体转化以及营养缺陷型突变体筛选

提前在PDA平板上活化拟轮枝镰孢菌，25℃培养7天。

第一天晚上：收集孢子，置于150ml YEPD液体培养基中，25℃，150rpm过夜摇培10h；

第二天早上：收集幼植体，加入含有0.1g Lysing enzymes和0.05g Driselase的0.7M NaCl中，配制为20ml混合液，28℃，100rpm摇培3h酶解。

第二天下午：收集原生质体并将浓度调整为10

第三天早上：将复壁后的混合液倒含50μg/ml潮霉素的FRA板，25℃培养。

待长出单个转化子后，再用含1.5g/L 5-FOA，0.7g/L uracil和1.5g/L uridine的水琼脂和PDA平板筛选两次，将筛选得到的转化子转接至含0.7g/L uracil和1.5g/Luridine的单个PDA平板扩大培养后，保存甘油菌，剩余菌丝提取基因组DNA；以野生型和转化子基因组DNA为模板，设计引物进行PCR鉴定，鉴定结果表明已成功形成pyrG营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体；

选取一株突变体，以该突变体的基因组DNA为模板，设计引物，扩增包含敲除位点的序列并送生工生物工程有限公司进行测序验证，测序结果显示pyrG基因的编码序列已被完全敲除，将该菌株命名为ΔFvpyrG。

将野生型拟轮枝镰孢菌和ΔFvpyrG分别接种至MM、MM_UU、MM_UU+5-FOA、MM_UU+Hyg培养基上(MM:Minimal Medium；UU:0.7g/L uracil+1.5g/L uridine；Hyg：50μg/mlHyg)，进行表型观察。结果表明，与野生型菌株相比，营养缺陷型突变株只能在外源添加营养物质uracil和uridine的情况下正常生长，并且对5-FOA抗生素表现抗性，对Hyg抗生素表现敏感。表型观察结果进一步说明营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体菌株ΔFvpyrG的基因组中已不含pyrG基因，同时在后期无Hyg抗性筛选压力的情况下，CRISPR/Cas9载体已经从突变菌株中丢失，不会影响后续利用该菌株对其他基因进行敲除。

所用引物pyrG_-1838F核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，引物pyrG_+666R核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。

实施例三

根据图6所示，pyrG营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体菌株ΔFvpyrG在FUM1基因敲除中的具体应用，包括：

一、用于FUM1基因敲除的CRISPR/Cas9载体的构建

以PFC334载体为模板，以PFC334_PacI_F/FUM1_sgRNA65_R、FUM1_sgRNA65_F/PFC334_PacI_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行PCR，扩增得到FUM1_sgRNA65_1和FUM1_sgRNA65_2片段；

以FUM1_sgRNA65_1和FUM1_sgRNA65_2片段为模板，以PFC334_PacI_F/PFC334_PacI_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行融合PCR，扩增得到FUM1_sgRNA65片段。该片段为靶向FUM1基因前端的sgRNA表达框，其两端为PFC332载体PacI酶切位点左右两侧序列的同源臂；

以PFC334载体为模板，以PFC334_MauBI_F/FUM1_sgRNA7845_R、FUM1_sgRNA7845_F/PFC334_MauBI_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行PCR，扩增得到FUM1_sgRNA7845_1和FUM1_sgRNA7845_2片段；

以FUM1_sgRNA7845_1和FUM1_sgRNA7845_2片段为模板，以PFC334_MauBI_F/PFC334_MauBI_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行融合PCR，扩增得到FUM1_sgRNA7845片段。该片段为靶向FUM1基因尾端的sgRNA表达框，其两端为PFC332载体MauBI酶切位点左右两侧序列的同源臂；

限制性内切酶PacI单酶切PFC332载体，利用

限制性内切酶MauBI单酶切PFC332_FUM1_sgRNA65载体，利用

所用引物PFC334_PacI_F核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，引物FUM1_sgRNA65_R核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物FUM1_sgRNA65_F核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，引物PFC334_PacI_R核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，引物PFC334_MauBI_F核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，引物FUM1_sgRNA7845_R核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，引物FUM1_sgRNA7845_F核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，引物PFC334_MauBI_R核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，PCR扩增所得FUM1_sgRNA65_1核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；FUM1_sgRNA65_2核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示；FUM1_sgRNA65核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；FUM1_sgRNA7845_1核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；FUM1_sgRNA7845_2核苷酸序列如SEQ IDNO.46所示；FUM1_sgRNA7845核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示。

二、含pyrG抗性筛选标记的载体的构建

以PZKO载体为模板，以RES_PtrpC_F/PtrpC_R为引物对，利用PrimeSTAR MaxPremix(2X)进行PCR，扩增得到PtrpC启动子片段，其中左端添加了SacI、KpnI和BamHI酶切位点；

以拟轮枝镰孢菌基因组DNA为模板，以PtrpC_pyrG_CDS_F/pyrG_CDS_RES_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行PCR，扩增得到pyrG基因的CDS片段，其中左端为PtrpC启动子片段的同源臂，右端添加了EcoRI和PacI酶切位点；

以PtrpC启动子和pyrG基因的CDS片段为模板，以RES_PtrpC_F/pyrG_CDS_RES_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行融合PCR，扩增得到PtrpC_pyrG片段；

利用pLB零背景快速克隆试剂盒，将PtrpC_pyrG片段连接至pLB载体中，得到重组载体pLBKOpyrG，热激转化至TG-1大肠杆菌，筛选验证后提取质粒。

所用引物RES_PtrpC_F核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，引物PtrpC_R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，引物PtrpC_pyrG_CDS_F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，引物pyrG_CDS_RES_R核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，PCR扩增所得PtrpC启动子核苷酸序列如SEQ IDNO.48所示，pyrG基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示，PtrpC_pyrG核苷酸序列如SEQID NO.50所示。

三、用于FUM1基因敲除的同源臂片段的构建

以拟轮枝镰孢菌基因组DNA为模板，以KpnI_FUM1_-1752F/KpnI_FUM1_-275R和PacI_FUM1_8115F/PacI_FUM1_+1234R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行PCR，扩增得到FUM1_UP和FUM1_DOWN片段；

限制性内切酶KpnI单酶切pLBKOpyrG，利用

限制性内切酶PacI单酶切pLBKOpyrG_FUM1_U，利用

以pLBKOpyrG_FUM1_U+D载体为模板，FUM1_-1752F/FUM1_+1234R为引物对，PCR扩增得到pyrG_FUM1_U+D片段。

所用引物KpnI_FUM1_-1752F核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，引物KpnI_FUM1_-275R核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，引物PacI_FUM1_8115F核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，引物PacI_FUM1_+1234R核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，引物FUM1_-1752F核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，引物FUM1_+1234R核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，PCR扩增所得FUM1_UP核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示，FUM1_DOWN核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示，pyrG_FUM1_U+D核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示。

四、PEG介导的pyrG营养缺陷型拟轮枝镰孢菌原生质体转化以及FUM1敲除突变体的筛选

提前活化pyrG营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体ΔFvpyrG，在含0.7g/L uracil和1.5g/L uridine的PDA平板上，25℃培养7天；收集孢子，在含0.7g/L uracil和1.5g/Luridine的YEPD液体培养基中，过夜摇培后收集幼植体，0.1g Lysing Enzymes和0.05gDriselase酶解后，收集原生质体，将浓度调整为1×10

取10μg PFC332_FUM1_sgRNA65+7845载体和10μg pyrG_FUM1_U+D片段，进行原生质体转化后倒无抗FRA板，用无抗平板筛选2次后，即可挑取单个转化子至单个的无抗PDA平板扩大培养，提取转化子基因组DNA，以野生型拟轮枝镰孢菌以及pyrG营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体的基因组DNA为对照，设计4对引物进行PCR验证，结果表明成功得到FUM1基因敲除突变体。用于验证的引物序列如下：

第1对引物为FUM1基因内部引物，用于检验FUM1基因是否还存在于基因组内，具体引物序列如下：

引物FUM1_4941F核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；引物FUM1_5940R核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

第2对引物为筛选标记pyrG基因内部引物，用于检验pyrG筛选标记是否被整合至基因组中，具体引物序列如下：

引物PtrpC_pyrG_371F核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；引物PtrpC_pyrG_1202R核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示

第3对引物为FUM1基因上游同源臂的左侧和筛选标记pyrG基因内部搭起来的引物对，用于检验pyrG筛选标记是否被整合至FUM1基因所在的位置，具体引物序列如下：

引物FUM_-2254F核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；引物PtrpC_pyrG_783R核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

第4对引物为筛选标记pyrG基因内部与FUM1下游同源臂的右侧搭起来的引物对，用于检验pyrG筛选标记是否被整合至FUM1基因所在的位置，具体引物序列如下：

引物PtrpC_pyrG_1136F核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；引物FUM1_+1602R核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。

以上结果均说明实施例1中的pyrG营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体菌株可用于基因功能验证以及其它基因工程应用。

载体靶向序列表

引物序列表

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中国农业科学院农产品加工研究所

<120> 一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法

<130> 00002

<160> 53

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> CRISPR/Cas9 carrier PFC332_pyrG_sgRNA-7G

<400> 1

ttaggtaaag aagagactgt 20

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> PtrpC_R

<400> 2

ttggatgctt gggtagaata ggtaagt 27

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> PtrpC_pyrG_CDS_F

<400> 3

acttacctat tctacccaag catccaaatg tcgccgcatc ctaccct 47

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> RES_PtrpC_F

<400> 4

gagctcggta cccggggatc cggcttggct ggagctagtg gaggtcaa 48

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> pyrG_CDS_RES_R

<400> 5

ttaattaaga attcttaacg aacccgctcc gtgtaag 37

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> PFC334_PacI_F

<400> 6

tagctgtttc cgctgagggt ttaatgcgta agctccctaa ttggc 45

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> FUM1_sgRNA65_R

<400> 7

gacgagctta ctcgtttcgt cctcacggac tcatcaggag atgcggtgat gt 52

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> FUM1_sgRNA65_F

<400> 8

tgaggacgaa acgagtaagc tcgtcgagat ggctcaagcc atcacgtttt agagc 55

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> PFC334_PacI_R

<400> 9

ctgctgtctc ggctgaggtc ttaatgagcc aagagcggat tcctc 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> PFC334_MauBI_F

<400> 10

cggggtctga cgctcagtgg aacgagcgta agctccctaa ttggc 45

<210> 11

<211> 52

<212> DNA

<213> FUM1_sgRNA7845_R

<400> 11

gacgagctta ctcgtttcgt cctcacggac tcatcaggcc ggacggtgat gt 52

<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213> FUM1_sgRNA7845_F

<400> 12

tgaggacgaa acgagtaagc tcgtcgccgg atcctccaag ataccgtttt agagc 55

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> PFC334_MauBI_R

<400> 13

gaccaaaatc ccttaacgtg agttagagcc aagagcggat tcctc 45

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> KpnI_FUM1_-1752F

<400> 14

tcagcaagat gagctcggta ccgtccagac gttgcaacta cac 43

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> KpnI_FUM1_-275R

<400> 15

ccaagccgga tccccgggta cctcccaata gtttgctaga gttcc 45

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> PacI_FUM1_8115F

<400> 16

ggttcgttaa gaattcttaa ttaactctga acagactgat ggtgatg 47

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> PacI_FUM1_+1234R

<400> 17

agatcttcta gaaagattta attaaccgct cttctgagtc tcactga 47

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> FUM1_-1752F

<400> 18

cgtccagacg ttgcaactac ac 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> FUM1_+1234R

<400> 19

ccgctcttct gagtctcact ga 22

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> FUM1_4941F

<400> 20

gattatgggc atcttacctg gatg 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> FUM1_5940R

<400> 21

gtccttatca accgccatag tcag 24

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> PtrpC_pyrG_371F

<400> 22

cagtcgagct gagacagcta c 21

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> PtrpC_pyrG_1202R

<400> 23

gtcatcctcg ggttctgtgt tg 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> FUM_-2254F

<400> 24

gatttccgta ctagcggcac t 21

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> PtrpC_pyrG_783R

<400> 25

tatcaccaaa cttgcgatcc tcg 23

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> PtrpC_pyrG_1136F

<400> 26

ggaacacaag aacttcgtca tg 22

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> FUM1_+1602R

<400> 27

aacaatgcgc aaaggctatg 20

<210> 28

<211> 52

<212> DNA

<213> pyrG_sgRNA-7G_R

<400> 28

gacgagctta ctcgtttcgt cctcacggac tcatcaggtt aggcggtgat gt 52

<210> 29

<211> 56

<212> DNA

<213> pyrG_sgRNA-7G_F

<400> 29

tgaggacgaa acgagtaagc tcgtcgttag gtaaagaaga gactgtgttt tagagc 56

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> pyrG_-1254F

<400> 30

cctgccgtca ggtcagtatt atc 23

<210> 31

<211> 48

<212> DNA

<213> pyrG_-53R

<400> 31

aagtgagtta ctccatggat actccagtga aaagtgacga tccacagc 48

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> pyrG_+110F

<400> 32

ggagtatcca tggagtaact cactt 25

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> pyrG_+1309R

<400> 33

tatcggatag tactgccagt tgaa 24

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> pyrG_-1838F

<400> 34

ctagctcatc tcactgccgg 20

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> pyrG_+666R

<400> 35

cggatacgaa tgactgatcc c 21

<210> 36

<211> 565

<212> DNA

<213> pyrG_sgRNA-7G_1

<400> 36

tagctgtttc cgctgagggt ttaatgcgta agctccctaa ttggcccatc cggcatctgt 60

agggcgtcca aatatcgtgc ctctcctgct ttgcccggtg tatgaaaccg gaaaggccgc 120

tcaggagctg gccagcggcg cagaccggga acacaagctg gcagtcgacc catccggtgc 180

tctacactcg acctgctgag gtccctcagt ccctggtagg cagctttgcc ccgtctgtcc 240

gcccggtgtg tcggcggggt tgacaaggtc gttgcgtcag tccaacattt gttgccatat 300

tttcctgctc tccccaccag ctgctctttt cttttctctt tcttttccca tcttcagtat 360

attcatcttc ccatccaaga acctttattt cccctaagta agtactttgc tacatccata 420

ctccatcctt cccatccctt attcctttga acctttcagt tcgagctttc ccacttcatc 480

gcagcttgac taacagctac cccgcttgag cagacatcac cgcctaacct gatgagtccg 540

tgaggacgaa acgagtaagc tcgtc 565

<210> 37

<211> 454

<212> DNA

<213> pyrG_sgRNA-7G_2

<400> 37

tgaggacgaa acgagtaagc tcgtcgttag gtaaagaaga gactgtgttt tagagctaga 60

aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 120

gcttttggcc ggcatggtcc cagcctcctc gctggcgccg gctgggcaac atgcttcggc 180

atggcgaatg ggactgattt aatagctcca tgtcaacaag aataaaacgc gtttcgggtt 240

tacctcttcc agatacagct catctgcaat gcattaatgc attggacctc gcaaccctag 300

tacgcccttc aggctccggc gaagcagaag aatagcttag cagagtctat tttcattttc 360

gggagacgag atcaagcaga tcaacggtcg tcaagagacc tacgagactg aggaatccgc 420

tcttggctca ttaagacctc agccgagaca gcag 454

<210> 38

<211> 994

<212> DNA

<213> pyrG_sgRNA-7G

<400> 38