拟轮枝镰孢和层出镰孢侵染玉米果穗的途径及镰孢菌病害防治

摘要

镰孢菌病害是世界玉米产区重要的真菌病害，因病原组成复杂，侵染机制不明，常给玉米生产造成重大经济损失;此外，国内外对玉米镰孢菌病害的防治研究也多局限于对单一致病菌的控制，且对病害的发病规律和防治措施研究的还不够深入。本研究通过原生质体转化的方法获得红色荧光蛋白(Red Fluorescence Protein)标记的拟轮枝镰孢，结合前期获得的绿色荧光标记的层出镰孢，监测其侵染玉米果穗的时空差异，初步确定其侵染路径。此外，在田间对常用玉米自交系进行了抗穗腐病、鞘腐病和茎腐病评价，研究了不同杀菌剂和杀虫剂对3种镰孢菌病害的控制效果，为探讨病害防治的新方法奠定了理论基础。主要研究结果如下:
　　(1)利用原生质体转化方法构建了红色荧光蛋白标记的拟轮枝镰孢转化子，从127株转化子中筛选出5株红色荧光信号较强的转化子进行致病性测定，其中的3株致病性无明显变化，2株致病性明显降低。选取致病力无变化的拟轮枝镰孢转化子Fv.4-7和本实验室前期构建的绿色荧光标记的层出镰孢转化子Fp-5，通过花丝注射法将孢悬液分别单独和复合接种到健康的玉米品种B73的果穗内，荧光和组织解剖学观察结果表明，单独接种72h后，层出镰孢侵染进入雌花外稃细胞，终止于子房基部细胞，而拟轮枝镰孢可继续侵染子房基部细胞;复合接种24h后，首次出现表观症状;接种48h时，穗尖下1cm处出现明显褐变症状，但拟轮枝镰孢从菌丝定殖的范围及菌丝量上均明显大于层出镰孢;在72-96h时，穗腐病的病症进一步蔓延且观察到拟轮枝镰孢出现汇聚现象;接种120-144h时，穗轴出现空隙，穗基部呈软化且探测到大量红色荧光信号;绝对定量PCR结果显示，拟轮枝镰孢侵染的范围和定殖的菌丝量均明显高于层出镰孢。上述结果表明，相比层出镰孢，拟轮枝镰孢在侵染玉米果穗时表现出竞争优势，镰孢菌可引起果穗中空症状。
　　(2)通过对18个玉米自交系进行抗镰孢菌评价，发现大部分玉米品种对鞘腐病均具有较好的抗性;玉米穗腐病的病情级别均高于40％，其中13-1077和掖473抗病评价为HS（高感），B73、郑58及B37等8个品种抗病评价为S（感病）;除PH4CV、掖473和9058等3个品种茎腐病发病率较低外，其余品种发病率均高于45％，其中B73、B37、PH6WC、PA91Ht3、A632和A619等6个品种被侵染茎节组织达到或超过果穗茎节部位，出现明显的果穗倒挂，植株倒伏黄枯现象。
　　(3)采用生长速率法分别测定了9种杀菌剂对层出镰孢、拟轮枝镰孢、禾谷镰孢的室内毒力，结果显示:苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、苯甲·嘧菌酯、咪鲜胺、硅唑·咪鲜胺和多福锌等6种杀菌剂对3种镰孢菌均有较好的抑制效果，其中对层出镰孢的EC50值分别为2.16mg/L，1.59mg/L，1.10mg/L，0.01mg/L，0.01mg/L，6.98mg/L;对拟轮枝镰孢的EC50值分别为2.20mg/L，2.01mg/L，2.20mg/L，1.75mg/L，13.98mg/L，3.40mg/L;对禾谷镰孢的EC50值分别为1.04mg/L，1.90mg/L，3.53mg/L，1.13mg/L,0.18mg/L,10.27mg/L。
　　(4)对上述6种杀菌剂进行田间防效筛选，统计结果显示，苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和咪鲜胺对玉米穗腐病和鞘腐病具有明显的防效，分别达到55.72％、62.54％、42.38％和62.86％、77.65％、60.47％。同时，与对照相比，施药处理的玉米产量明显增加。综合比较来看，这3种杀菌剂对玉米穗腐病和鞘腐病均有较高的防效，可用于下步复配试验。
　　(5)在田间，选取有效浓度为120g/hm2的苯醚甲环唑，300g/hm2的吡唑醚菌酯和648g/hm2的咪鲜胺，同时选取对玉米蚜和玉米螟效果较好的有效浓度为60g/hm2的吡虫啉和225g/hm2的杀螟丹进行复配。这些复配制剂分别对单独和复合感染玉米穗腐病、鞘腐病和茎腐病的植株喷施防治，结果显示:单剂复配杀虫剂后，平均防效有所提升，增产率同比上升8.04％-29.47％，伏马毒素积累量也有所降低。结果说明，杀菌剂及杀虫剂减量化复配后可以在一定程度上提高防效和产量，降低伏马毒素的积累。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．1 镰孢菌及所致病害

1．1．1 镰孢菌种的鉴定

1．1．2 镰孢菌病害的生产危害性

1．1．3 常见玉米镰孢菌病害

1．2 镰孢穗腐病菌侵染机制研究现状

1．2．1 拟轮枝镰孢对玉米的侵染

1．2．2 层出镰孢对玉米的侵染

1．3 玉米镰孢菌病害防控研究现状

1．4 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试玉米品种、菌株及质粒

2．1．2 仪器与设备

2．1．3 主要试剂、培养基及配制方法

2．2 拟轮枝镰孢红色荧光标记转化子的创制

2．2．1 原生质体的制备

2．2．2 原生质体转化

2．2．3 转化子稳定性检测

2．2．4 拟轮枝镰孢转化子的鉴定

2．3 镰孢菌侵染玉米花序观察

2．3．2 接种后取样

2．3．3 绝对定量标准曲线及样品浓度的测定

2．4．3 田间接种

2．4．4 品种抗性评价

2．4．5 玉米产量相关指标的测定

2．4．6 伏马毒素含量的测定

2．5 玉米穗腐病、鞘腐病及茎腐病的田间防治

2．5．1 玉米种植

2．5．2 杀菌剂的室内毒力测定

2．5．3 孢子悬浮液的制备

2．5．4 田间接种与药剂防治

3 结果与分析

3．1 拟轮枝镰孢转化子的获得

3．1．1 转化子的分子检测

3．1．2 转化子的荧光检测

3．2 转化子的致病性

3．2．1 层出镰孢GFP转化子的致病性

3．2．2 拟轮枝镰孢RFP转化子的致病性

3．3 镰孢菌侵染玉米籽粒的途径

3．3．1 健康玉米幼嫩籽粒的特征

3．3．2 拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒过程

3．3．3 层出镰孢侵染玉米籽粒过程

3．3．4 层出镰孢和拟轮枝镰孢在籽粒上的竞争侵染

3．4 侵染玉米花序过程中镰孢菌的定量分析

3．5 自交系对3种镰孢菌的抗性评价

3．6 不同杀菌剂对镰孢菌的室内毒力

3．7 杀菌剂的田间防效

3．7．2 杀菌剂单剂挽回产量损失的能力

3．7．3 复配药剂的田间防效

3．7．4 复配药剂挽回产量损失的能力

3．8 不同药剂处理下玉米籽粒中的毒素含量

4 讨论

4．2 抗性品种及其抗性机制

4．3 镰孢菌病害控制

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢