一种检测香米特征香味成分2-乙酰基-1-吡咯啉的方法

摘要

本发明涉及一种检测香米特征香味成分2‑乙酰基‑1‑吡咯啉的方法，包括步骤：向香米样品中加入2，4，6‑三甲基吡啶，再加入无水乙醇，进行超声萃取、离心、浓缩、过滤处理，得到供试品溶液；将供试品溶液注入液相色谱‑串联质谱联用仪中检测。本发明所采用的液相色谱‑串联质谱检测方法，样品前处理时使用无水乙醇作为萃取剂，不需要高温蒸馏、萃取，萃取后所得的供试品溶液也无需任何衍生化反应流程，可直接进入液相色谱‑串联质谱联用仪检测，解决了现有技术在检测2‑AP过程中，由于采用高温的前处理方法所导致的2‑AP因挥发、热分解及新生成等引起的测定结果不准确，以及萃取液必须经复杂的衍生化反应才能进入液相色谱‑串联质谱联用仪测定的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及香味成分检测技术领域，特别涉及一种检测香米特征香味成分2-乙酰基-1-吡咯啉的方法。

背景技术

2-乙酰基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2-AP)是香米中的特征性香味成分，具有烤面包、坚果、爆米花的香气，2-AP在优质香米品质评价、香稻遗传育种、香米掺假识别等相关领域得以广泛应用。

目前，在检测香米中2-乙酰基-1-吡咯啉的过程中，对检测样品通常采用高温蒸馏或高温萃取的高温前处理方法，处理后的样品再由气相色谱或气相色谱-质谱进测定。由于2-乙酰基-1-吡咯啉具有热不稳定性，在高温条件下易挥发，因此采用高温的前处理方法会导致2-乙酰基-1-吡咯啉的检测结果不准确。为避免这一问题，2019年和2021年德国的Marcus A.Glomb研究组和Thomas F.Hofmann研究组分别提出了样品在室温条件下萃取后由液相色谱-串联质谱进行检测的新型检测方法(J.Agric.Food Chem.,2019,67,3046-3054；J.Agric.Food Chem.,2021,69,1405-1412.)，但这两种方法都需要在样品萃取后，加入特定的衍生试剂，将2-乙酰基-1-吡咯啉进行衍生后才能检测，衍生化过程甚至需要在暗室环境下反应24h，非常复杂繁琐，导致整个检测效率受到了很大的影响。

发明内容

基于此，本发明提供一种检测香米特征香味成分2-乙酰基-1-吡咯啉的方法，在实现对2-乙酰基-1-吡咯啉进行检测的同时，解决了现有技术中由于采用高温的前处理方法而导致检测结果不准确以及样品提取后需要复杂的衍生化反应流程等问题。

一种检测香米特征香味成分2-乙酰基-1-吡咯啉的方法，包括步骤：

向香米样品中加入内标物2，4，6-三甲基吡啶，得到含有内标物的香米样品溶液；

向所述香米样品溶液中加入无水乙醇，得到混合液；

对所述混合液进行超声萃取处理，将萃取后得到的第一上清液进行离心处理，并将离心后得到的第二上清液进行浓缩处理，得到浓缩液，将所述浓缩液用微孔滤膜过滤后得供试品溶液；

将所述供试品溶液注入液相色谱-串联质谱联用仪中进行检测。

优选地，在所述超声萃取步骤中，超声的频率为45kHz。

优选地，在所述超声萃取步骤中，温度为60℃。

优选地，所述微孔滤膜为聚四氟乙烯。

优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。

优选地，色谱条件为：

色谱柱：Waters XBridge C18，100mm×2.1mm，3.5μm；

流动相A为体积分数为0.1％氨水-水溶液，流动相B为乙腈。

优选地，在所述色谱条件中，流动相流速为0.3mL/min。

优选地，在所述色谱条件中，进样量为5.0μL。

优选地，在所述色谱条件中，柱温为40℃。

优选地，质谱条件为：

离子源为电喷雾电离源；

扫描方式为正离子扫描；

雾化气体为氮气；

气帘气为5psi氮气；

碰撞气体为2psi氮气；

电喷雾电压为5500V；

电喷雾离子源温度为550℃；

检测模式为多反应检测模式。

与现有方案相比，本发明具有以下有益效果：

在本发明中，本发明所采用的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，在本分析方法前处理的样品提取过程中，使用无水乙醇作为萃取剂，结合超声辅助萃取技术，不需要高温蒸馏或高温萃取的高温前处理方法，解决了现有技术中在检测2-AP过程中，由于采用高温的前处理方法所导致的挥发、热分解引起的测定结果不准确问题。此外，由于2-AP在乙醇萃取液中能够长时间保持稳定，无需复杂的衍生化流程将2-AP衍生后再进入液相色谱-串联质谱仪进行检测，从而极大地提升了检测效率和通量。

附图说明

图1为2-AP在香米样品待测溶液中的色谱图；

图2为TMP在香米样品待测溶液中的色谱图；

图3为2-AP在香米样品加标后待测溶液中的色谱图；

图4为TMP在香米样品加标后待测溶液中的色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

另外，全文中的“和/或”包括三个方案，以A和/或B为例，包括A技术方案、B技术方案，以及A和B同时满足的技术方案；另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本要求的保护范围之内。

一种检测香米特征香味成分2-乙酰基-1-吡咯啉的方法，包括步骤：

S100、向香米样品中加入2，4，6-三甲基吡啶(TMP)内标物，得到含内标物的香米样品溶液。

具体地，在步骤S100中，香米样品的用量优选为2g，2，4，6-三甲基吡啶的用量为400～800ng；

将香米样品进行冷冻处理磨碎后再加入2，4，6-三甲基吡啶，以使得香米样品具有更大比表面积，进而使香米样品与2，4，6-三甲基吡啶、以及步骤S200、S300中的无水乙醇接触更充分，以提高萃取率。

S200、向所述香米样品溶液中加入无水乙醇，得到混合液；

S300、对混合液进行超声萃取处理，将萃取后得到的第一上清液进行离心处理，并将离心后得到的第二上清液进行浓缩处理，得到浓缩液，将浓缩液用微孔滤膜过滤后得供试品溶液。

具体地，步骤S300的具体步骤包括：

将香米样品溶液、无水乙醇置于密封的容器中并置于水浴环境下，进行超声萃取，萃取结束将容器静止，待沉淀完全，将沉淀物与上清液分离，向沉淀物中添加少量乙醇重复3～5次超声萃取步骤，将每次萃取分离出的上清液合并，得到第一上清液，将第一上清液进行离心处理，并将离心后得到的第二上清液转用氮气吹扫浓缩处理，得到浓缩液，将浓缩液用微孔滤膜过滤后得供试品溶液。

进一步地，对浓缩液过滤，以去除浓缩液中大于0.22μm的颗粒，防止后续经处理后的样品中颗粒物杂质进入到色谱系统中造成堵塞。

在一些实施例中，在超声萃取步骤中，超声的频率为30～60kHz。

在一些实施例中，在超声萃取步骤中，温度为50～70℃。

在一些实施例中，微孔滤膜为聚四氟乙烯材质。

在一些实施例中，微孔滤膜的孔径为0.22μm。

S400、将所述供试品溶液注入液相色谱-串联质谱联用仪中进行检测。

在本发明中，本发明所采用的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，在本分析方法前处理的样品提取过程中，使用无水乙醇作为萃取剂，结合超声辅助萃取技术，不需要高温蒸馏或高温萃取的高温前处理方法，解决了现有技术中在检测2-AP过程中，由于采用高温的前处理方法所导致的挥发、热分解引起的测定结果不准确问题。此外，由于2-AP在乙醇萃取液中能够长时间保持稳定，无需复杂的衍生化流程将2-AP衍生后再进入液相色谱-串联质谱仪进行检测，从而极大地提升了检测效率和通量。

在一些实施例中，色谱条件为：

色谱柱：Waters XBridge C18，100mm×2.1mm，3.5μm；

流动相A为体积分数为0.1％氨水-水溶液，流动相B为乙腈。

色谱的梯度洗脱程序设置如下表1所示。

表1梯度洗脱程序

在一些实施例中，在色谱条件中，流动相流速为0.2～0.4mL/min。

在一些实施例中，在色谱条件中，进样量为5.0μL。

在一些实施例中，在色谱条件中，柱温为30～50℃。

在一些实施例中，质谱条件为：

离子源为电喷雾电离源；

扫描方式为正离子扫描；

雾化气体为氮气；

气帘气为5psi氮气；

碰撞气体为2psi氮气；

电喷雾电压为5500V；

电喷雾离子源温度为550℃；

检测模式为多反应检测模式。

质谱的检测参数设置如表2所示。

表2检测参数设定表

2-AP、TMP的其他检测参数如下：

去簇电压(DP)为80V，入口电压(EP)为10V；

碰撞室出口电压(CXP)为11V，所有通道的驻留时间均为100ms。

对2-AP定量分析时，依据内标校准曲线，根据2-AP(112.0/70.0)和TMP(121.6/106.1)之间的峰面积比，计算样品中的2-AP浓度。

以下为具体实施例部分

实施例1

基质标准曲线的制作和检出限、定量限的确定

超高效液相色谱-串联质谱分析测试条件如下：

(a)色谱条件：

色谱柱：Waters XBridge C 18，100mm×2.1mm，3.5μm；

柱温为40℃；

流动相A为体积分数为0.1％氨水-水溶液，流动相B为乙腈；

进样量为5.0μL；

流动相流速为0.3mL/min，进行等梯度洗脱，其梯度如表1所示。

(b)质谱条件：

离子源为电喷雾电离源；

扫描方式为正离子扫描；

雾化气体为氮气；

气帘气为5psi氮气；

碰撞气体为2psi氮气；

电喷雾电压为5500V；

电喷雾离子源温度为550℃；

检测模式为多反应检测模式，检测参数设置如表2所示。

2-AP、TMP的其他检测参数如下：

去簇电压(DP)为80V，入口电压(EP)为10V；

碰撞室出口电压(CXP)为11V，所有通道的驻留时间均为100ms。

称取5.0mg 2-AP标准品至小烧杯中，用无水乙醇溶解后，转移至5mL容量瓶中，并用无水乙醇定容，得到浓度为1000μg/mL的2-AP标准储备溶液，并在-18℃下保存。

称取2，4，6-三甲基吡啶标准品10.0mg到烧杯中，用无水乙醇溶解后，转移至10mL容量瓶中，并用无水乙醇定容，得到浓度为1000μg/mL内标标准储备溶液，并在-18℃下保存。

为了有效降低样品基质效应及样品前处理过程对测定结果的影响，选择事先验证未检测到2-AP的大米样品作为空白基质，以无水乙醇为溶剂，采用逐级稀释法，配制浓度为10μg/mL的内标标准工作液和浓度为20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05μg/mL的2-AP标准工作液，从不同浓度的2-AP标准工作液中移取相应体积的2-AP至2g的大米空白基质中，再分别加入60μL内标标准工作液及4mL无水乙醇后，将锥形瓶盖上并用封口膜密封。

将密封后的样品置于45kHz，60℃的超声水浴中，超声提取60min，第一轮提取完成后，将锥形瓶取出并静置，待样品完全沉淀后，将上清液转移至15mL离心管中。之后每次添加3mL乙醇，重复萃取三次。将4次的上清液合并后进行离心。离心条件设置为15000rpm，温度10℃，时间20min。离心后将所得的上清液转移至新的离心管中，并用氮气吹扫浓缩器浓缩至1.5mL，然后分别通过0.22μm PTFE针头过滤器过滤到进样小瓶中，随后进行高效液相色谱-串联质谱检测分析。

以添加2-AP的大米空白基质样品中的2-AP含量为X轴，2-AP(112.0/70.0)和TMP(121.6/106.1)之间的峰面积比为Y轴，绘制基质匹配标准曲线并用于外标法定量。

以信噪比S/N＝3对应的含量为方法的检出限(LOD)，以信噪比S/N＝10对应的含量为方法的定量限(LOQ)。

上述基质标准曲线相关参数、LOD及LOQ相关信息见表3

表3 2-AP基质标准曲线相关参数、LOD及LOQ相关信息

实施例2

收集不同类型香米样品，共7种实际样品进行检测和加标回收实验，以验证本发明方法的可行之处。按照下列步骤进行处理：

称取研磨后的香米粉末2g到50mL锥形瓶中，并在锥形瓶中加入600ng TMP及4mL无水乙醇后，将锥形瓶盖上并用封口膜密封。

将密封后的样品置于45KHz，60℃的超声水浴中，超声提取60min，第一轮提取完成后，将锥形瓶取出并静置，完全沉淀后，将上清液转移至15mL离心管中；之后每次添加3mL乙醇，再重复萃取三次，将4次的上清液合并后进行离心；离心条件设置为15000rpm，温度10℃，时间20min。离心后将所得的上清液转移至新的离心管中，并用氮气吹扫浓缩器浓缩至1.5mL，然后分别通过0.22μm PTFE针头过滤器过滤到进样小瓶中，随后进行高效液相色谱-串联质谱检测分析。

加标回收实验中，在称量样品并添加TMP之后，再加入40～300ng的2-AP标准品，其他步骤与上述香米样品提取相同。

本实例中的检测和加标回收率实验结果见表4。

表4不同类型香米样品的检测及加标回收实验数据(n＝3)

由表4可以看出，7种香米中的2-AP检测性能指标的相对标准偏差(RSD)均在8％以内，说明本方法具有较好的稳定性。

回收率在85％～115％，说明本方法符合分析检测的基本需求。

2-AP和TMP在香米待测溶液中的典型色谱图见图1～4。

由图1～4可知，TMP、2-AP的出峰时间不同，且峰形尖锐，说明本发明对2-AP的定性是可行的，根据软件计算得出峰面积，再对应标准品溶液的工作曲线根据峰面积得到浓度以达到对2-AP的定量分析。因此，本发明液相色谱-串联质谱联用法可以满足对2-AP的定性、定量检测要求。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。