一种龙葵果提取物的提取方法

摘要

本发明涉及一种用于调控Ⅱ型糖尿病胰岛素通路及胰岛素增敏的龙葵果提取物的提取方法，该提取方法包括龙葵果原料预处理、浸泡、浸提以及浓缩与干燥等步骤。采用本发明提取法得到的龙葵果提取物能明显改善糖尿病大鼠血糖偏高的症状，且能很好地恢复到正常水平，具有明显的抑制效果。

说明书

【技术领域】

本发明属于天然产物提取技术领域。更具体地，本发明涉及一种用于调控Ⅱ型糖尿病胰岛素通路及胰岛素增敏的龙葵果提取物的提取方法。

【背景技术】

Ⅱ型糖尿病(Diabetes mellitus type 2，T2DM)，是一种慢性代谢疾病，定义为胰岛素分泌缺陷，导致糖代谢异常及相关代谢紊乱。目前90％以上糖尿病患者均为Ⅱ型糖尿病，并且糖尿病逐渐趋于年轻态。研究发现，Ⅱ型糖尿病主要特征为胰岛素抵抗，且大多与胰岛素信号通路异常及胰岛素脱敏相关。

龙葵果(Solanum nigrum Linn)别名苦葵、天茄子、野茄子等，为一年生草本茄科茄属植物，在我国各地均有分布。龙葵果为龙葵的成熟果实，含有多种活性物质，包括生物碱、皂苷类、多糖类、多酚类和多种氨基酸及维生素等。我国药学典籍记载龙葵及龙葵果具有清热，解毒，活血，消肿的功效。目前研究发现其提取物可以治疗跌打扭伤，慢性气管炎，急性肾炎等，还发现它具有抗菌抗炎、抗肿瘤等作用，国外也有研究报道龙葵果提取物具有降血糖的作用。

常见的天然药物活性成提取方法主要包括水提，醇提及半仿生提取等提取方法，且不同提取方法对其活性成分也有影响，所得提取物的主要成分也有所不同。目前，对于龙葵降血糖的研究匮乏，且无法明确其降糖机制，也无法通过提取得到效果最佳的提取物来针对高血糖患者。因此，如何从龙葵果中获得更多的提取物且最大限度保留其活性药效成分仍是一个难题。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种用于调控Ⅱ型糖尿病胰岛素通路及胰岛素增敏的龙葵果提取物的提取方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种用于调控Ⅱ型糖尿病胰岛素通路及胰岛素增敏的龙葵果提取物的提取方法。

该龙葵果提取物的提取步骤如下：

A、龙葵果原料预处理

新鲜龙葵果清洗干净，自然风干，使用粉碎设备粉碎，使用筛分设备筛分，收集粒度为60目以下的龙葵果粉；

B、浸泡

在室温下，把步骤A得到的龙葵果粉加到蒸馏水中充分浸泡，得到龙葵果粉浸泡物；

C、浸提

步骤B得到的龙葵果粉浸泡物在常压下进行酸碱浸提、醇浸提或半仿生浸提，接着抽滤，收集提取液；

D、浓缩与干燥

步骤C得到的提取液使用旋转蒸发设备进行浓缩，得到的浓缩液接着进行真空冷冻干燥，于是得到所述的龙葵果提取物。

根据本发明的一种优选实施方式，在步骤A中，龙葵果自然风干直至达到其水含量为以龙葵果重量计10％以下。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，按照以克计龙葵果粉与以毫升计蒸馏水的比为1：1～2，让所述的龙葵果粉在蒸馏水中浸泡2～4h。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的酸浸提是让步骤B得到的龙葵果粉浸泡物与浸提液按照以体积计1：40～60、在沸腾温度与pH 1.5～2.5的条件下浸提110～130min，接着以同样的浸提方式重复进行2～4次，这些浸出液合并，接着将其pH值调节至6.5～7.5，得到一种酸浸出液；

所述的碱浸提与所述的酸浸提相同，只是碱浸提的pH值是8.5～9.5。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的浸提液是盐酸无机酸水溶液，或者是氢氧化钠无机碱水溶液。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，无机酸浸提的龙葵果提取物收率是16.5～18.5％，它含有以重量计25～30％总生物碱、10～13％总皂苷、5～10％总多酚与10～15％总多糖；无机碱浸提的龙葵果提取物收率是15.5～17.5％，它含有以重量计15～20％总生物碱、12～15％总皂苷、25～30％总多酚与10～15％总多糖。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述乙醇浸提是让步骤B得到的龙葵果粉浸泡物与乙醇溶液浸提液按照以体积计1：40～60，在浓度为以体积计80％乙醇溶液中在温度80℃下加热回流浸提110～130min，接着以同样的浸提方式重复进行2～4次，这些浸出液合并，于是得到一种乙醇浸出液；它的龙葵果提取物收率是17.5～19.5％，它含有以重量计17～20％总生物碱、20～25％总皂苷、20～27％总多酚与14～18％总多糖。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的半仿生浸提是让步骤B得到的龙葵果粉浸泡物与蒸馏水按照以体积计1：40～60混合，接着使用盐酸溶液将其pH调节至1.5～2.5，在温度36.5～37.5℃与搅拌器转速100～120rpm的条件下浸提110～130min提取1次，再使用氢氧化钠溶液将其pH调节至7.5～9.5，在同样条件下提取2次，这些浸出液合并，接着将其pH值调节至6.5～7.5，得到一种半仿生浸出液；它的龙葵果提取物收率是20～23％，它含有以重量计21～25％总生物碱、15～20％总皂苷、17～23％总多酚与12～15％总多糖。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，滤液在旋转蒸发温度35～40℃下浓缩得到水含量为以重量计10～15％的稠膏状浓缩液。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的稠膏状浓缩液在温度-80℃预冻24小时以上，再在冷阱温度-78～-82℃与真空度0.1～0.5Pa的条件下真空冷冻干燥，直至龙葵果提取物水含量为以重量计5％以下。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种用于调控Ⅱ型糖尿病胰岛素通路及胰岛素增敏的龙葵果提取物的提取方法。

该龙葵果提取物的提取步骤如下：

A、龙葵果原料预处理

新鲜龙葵果清洗干净，自然风干，使用粉碎设备粉碎，使用筛分设备筛分，收集粒度为60目以下的龙葵果粉；

本发明使用的新鲜龙葵果采集自陕西省汉中市秦巴山区的野生龙葵在7～9月成熟的黑色浆果。由于陕西省汉中市秦巴山区自然地理环境及气候状况，这种成熟黑色浆果的主要活性成分含量高。

根据本发明，龙葵果自然风干目的在于保证其中的活性成分不会被破坏。龙葵果风干达到的水含量为以龙葵果重量计10％以下。如果风干龙葵果原料水含量高于10％，不仅龙葵多糖及淀粉类物质容易吸潮无法筛分，而且难以获得良好的提取效果。

龙葵果的水含量是根据105℃质量恒定法(仲裁法)检测得到的。

本发明使用的粉碎设备与筛分设备都是本技术领域里通常使用的设备，例如由上海比朗仪器制造有限公司以商品名高速万能粉碎机销售的粉碎设备、由天台环球筛网有限公司以商品名60目筛销售的筛分设备。

B、浸泡

在室温下，把步骤A得到的龙葵果粉加到蒸馏水中充分浸泡，得到龙葵果粉浸泡物；

根据本发明，龙葵果粉在水中浸泡的主要目的在于将龙葵果粉与水充分接触浸湿以促进龙葵果主要活性成分更易浸出。

在浸泡中，按照以克计龙葵果粉与以毫升计蒸馏水的比为1：1～2，让所述的龙葵果粉在蒸馏水中浸泡2～4h。浸泡时间为2～4h时，如果龙葵果粉与水的比大于1：1，则龙葵果的有效成分没有充分溶解，影响其提取效率；如果龙葵果粉与水的比小于1：2，则会延长浸泡时间，且后续浓缩时间也要延长；因此，龙葵果粉与水的比为1：1～2是合适的，优选地是1：1.3～1.6；

龙葵果粉与水的比为1：1～2时，如果浸泡时间短于2h，则龙葵果的有效成分没有充分溶解，影响其提取效率；如果浸泡时间长于4h，则增加其提取成本；因此，浸泡时间为2～4h是恰当的，优选地是2.5～3.5h。

C、浸提

步骤B得到的龙葵果粉浸泡物在常压下进行酸碱浸提、醇浸提或半仿生浸提，接着抽滤，收集提取液；

在这个步骤中，所述的酸浸提是让步骤B得到的龙葵果粉浸泡物与浸提液按照以体积计1：40～60、在沸腾温度与pH 1.5～2.5的条件下浸提110～130min，接着以同样的浸提方式重复进行2～4次，这些浸出液合并，接着将其pH值调节至6.5～7.5，得到一种酸浸出液；所述的浸提液是盐酸无机酸水溶液；

所述的碱浸提与所述的酸浸提相同，只是碱浸提的pH值是8.5～9.5。所述的浸提液是氢氧化钠无机碱水溶液。

在本发明中，在沸腾温度、浸提液pH值与浸提时间在所述的范围内，如果龙葵果粉浸泡物与浸提液的体积比大于1：40，则其含有的有效成分未能充分浸出；如果龙葵果粉浸泡物与浸提液的体积比小于1：60，则能够有效降低抽滤、浓缩成本；因此，龙葵果粉浸泡物与浸提液的体积比为1：40～60是合理的，优选地是1：46～54；

在龙葵果粉浸泡物与浸提液的体积比、沸腾温度与浸提时间在所述的范围内，如果浸提液的pH值小于1.5，则酸度过大影响有效成分活性，破坏其化学结构；如果浸提液的pH值大于2.5，则无法达到模拟在人体胃液中的浸提效果；因此，浸提液的pH值为1.5～2.5是恰当的，优选地是1.8～2.2；

在龙葵果粉浸泡物与浸提液的体积比、沸腾温度与浸提液pH值在所述的范围内，如果浸提时间短于110min，则无法保证对有效活性成分的充分提取；如果浸提时间长于130min，则增加时间成本；因此，浸提时间为110～130min是合适的，优选地是116～124min；

在本发明中，酸碱浸提都以同样的浸提方式重复进行2～4次，得到的这些浸出液合并，接着使用0.2～0.6N盐酸或氢氧化钠水溶液将其合并浸出液的pH值调节至6.5～7.5。该合并浸出液的pH值超过所述的范围是不行的，因为近中性条件下能较好的保证有效成分活性，过酸过碱均会对其产生负面影响。

根据天然产物提取率由下述计算公式计算得到：

式中：

A

无机酸浸提的龙葵果提取物收率是16.5～18.5％，无机碱浸提的龙葵果提取物收率是15.5～17.5％。

根据紫外分光光度法操作规程(2015版药典)，使用日本岛津Shimadzu公司的UV-2100紫外可见分光光度计检测该酸浸出液的总生物碱、总皂苷、总多酚与总多糖，具体地，参见黄越燕等人在CN105115925A、发明名称“一种测定龙葵中总生物碱含量的方法”中描述的方法检测总生物碱；丁霞等人，在题目“超声醇提龙葵总皂苷工艺及定量测定研究”，《中成药》，2011，33(08)，pp1442-1444中描述的方法检测总皂苷；薛勇闯等人，在题目“龙葵果提取物抗氧化活性及抗疲劳作用的研究”，《粮食与油脂》，2020，33(11)，pp126-128中描述的方法检测总多酚；苏依拉其木格与苏秀兰，在题目“龙葵多糖提取工艺优化研究”，《内蒙古医学院学报》，2011，33(02)，pp134-137中描述的方法检测总多糖。

该酸浸出液含有以重量计25～30％总生物碱、10～13％总皂苷、5～10％总多酚与10～15％总多糖；该碱浸出液含有以重量计15～20％总生物碱、12～15％总皂苷、25～30％总多酚与10～15％总多糖。

所述乙醇浸提是让步骤B得到的龙葵果粉浸泡物与乙醇溶液浸提液按照以体积计1：40～60，在浓度为以体积计80％乙醇溶液中在温度80℃下加热回流浸提110～130min，接着以同样的浸提方式重复进行2～4次，这些浸出液合并，于是得到一种乙醇浸出液；

按照前面描述的方法计算得到，该乙醇浸出液的龙葵果提取物收率是17.5～19.5％。按照前面描述的分析方法得到，该乙醇浸出液含有以重量计17～20％总生物碱、20～25％总皂苷、20～27％总多酚与14～18％总多糖。

所述的半仿生浸提是让步骤B得到的龙葵果粉浸泡物与蒸馏水按照以体积计1：40～60混合，接着使用盐酸溶液将其pH调节至1.5～2.5，在温度36.5～37.5℃与搅拌器转速100～120rpm的条件下浸提110～130min提取1次，再使用氢氧化钠溶液将其pH调节至7.5～9.5，在同样条件下浸提2次，这些浸出液合并，接着将其pH值调节至6.5～7.5，得到一种半仿生浸出液；

按照前面描述的方法计算得到，该半仿生浸出液的龙葵果提取物收率是20～23％，按照前面描述的分析方法得到，该半仿生浸出液含有以重量计21～25％总生物碱、15～20％总皂苷、17～23％总多酚与12～15％总多糖。

D、浓缩与干燥

步骤C得到的浸出液经过滤后使用旋转蒸发设备进行浓缩，得到的浓缩液接着进行真空冷冻干燥，于是得到所述的龙葵果提取物。

步骤C得到的浸出液使用真空抽滤装置进行抽滤，得到的滤液使用旋转蒸发设备在旋转蒸发温度35～40℃下浓缩得到水含量为以重量计10～15％的稠膏状浓缩液。本发明使用的真空抽滤装置与旋转蒸发设备都是目前市场上销售的产品，例如由天津鑫博得仪器有限公司以商品名SHB-III型循环水式多用真空泵、天津津腾科技有限公司以商品名玻璃砂芯过滤装置销售的布氏漏斗抽滤装置、由上海亚荣生化仪器厂公司以商品名旋转蒸发器RE-3000B销售的旋转蒸发设备。

所述的稠膏状浓缩液在温度-80℃预冻24小时以上，再在冷阱温度-78～-82℃与真空度0.1～0.5Pa的条件下真空冷冻干燥，直至龙葵果提取物水含量为以重量计5％以下。

在本发明中，所述的稠膏状浓缩液进行预冻的目的在于使提取物中的水分结冰，便于在冻干时直接升华。

预冻的稠膏状浓缩液进行真空冷冻干燥的目的在于得到粉末状的提取物，便于后续测定提取率及主要活性成分。

龙葵果提取物水含量是根据前面描述的分析方法检测得到的。

本发明使用的预冻装置与真空冷冻干燥设备都是目前市场上销售的产品，例如由辽宁一林集团有限公司以商品名-80度超低温冰箱销售的预冻装置、由上海舜制仪器制造有限公司以商品名菌种保藏真空冻干机销售的FD-1C-80型真空冷冻干燥。

[有益效果]

本发明的有益效果是：本发明从新鲜龙葵果中提取龙葵果提取物的方法工艺简单，效率高，易于实现工业化。采用本发明提取法得到的龙葵果提取物能明显改善糖尿病大鼠血糖偏高的症状，能很好地恢复到正常水平，具有明显的抑制效果，能有效增强糖尿病GK大鼠胰岛素通路及胰岛素增敏相关蛋白的表达量。

【附图说明】

图1是胰岛素信号通路局部图；

图2是蛋白WB实验结果及灰度分析统计图。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1：龙葵果提取物的提取

该实施例的实施方式如下：

A、龙葵果原料预处理

新鲜龙葵果清洗干净，自然风干达到它的水含量为以龙葵果重量计9.8％，使用粉碎设备粉碎，使用筛分设备筛分，收集粒度为60目以下的龙葵果粉；

B、浸泡

在室温下，按照以克计龙葵果粉与以毫升计蒸馏水的比为1：1.5，把步骤A得到的龙葵果粉加到蒸馏水中浸泡3.2h，得到龙葵果粉浸泡物；

C、浸提

步骤B得到的龙葵果粉浸泡物，按照它与盐酸无机酸水溶液浸提液的体积计1：50、在常压、沸腾温度与pH 1.5的条件下使用0.4N盐酸水溶液浸提120min，接着以同样的浸提方式重复进行3次，这些浸出液合并，接着将其pH值调节至6.8，得到一种酸浸出液；根据本申请说明书描述的方法计算得到，无机酸浸提的龙葵果提取物收率是18.5％，该酸浸出液含有以重量计25％总生物碱、13％总皂苷、5％总多酚与15％总多糖；

D、浓缩与干燥

步骤C得到的提取液使用布氏漏斗抽滤装置过滤，再使用旋转蒸发设备在旋转蒸发温度35℃下浓缩得到水含量为以重量计14％的稠膏状浓缩液，得到的稠膏状浓缩液接着在温度-80℃预冻24.2小时，再在冷阱温度-78℃与真空度0.3Pa的条件下真空冷冻干燥，直至龙葵果提取物水含量为以重量计4.5％，于是得到所述的龙葵果提取物(SNL1)。

实施例2：龙葵果提取物的提取

该实施例的实施方式如下：

A、龙葵果原料预处理

新鲜龙葵果清洗干净，自然风干达到它的水含量为以龙葵果重量计9.9％，使用粉碎设备粉碎，使用筛分设备筛分，收集粒度为60目以下的龙葵果粉；

B、浸泡

在室温下，按照以克计龙葵果粉与以毫升计蒸馏水的比为1：2.0，把步骤A得到的龙葵果粉加到蒸馏水中浸泡3.6h，得到龙葵果粉浸泡物；

C、浸提

步骤B得到的龙葵果粉浸泡物，按照它与盐酸无机酸水溶液浸提液的体积计1：40、在常压、沸腾温度与pH 2.5的条件下使用0.2N盐酸水溶液浸提110min，接着以同样的浸提方式重复进行2次，这些浸出液合并，接着将其pH值调节至6.5，得到一种酸浸出液；根据本申请说明书描述的方法计算得到，无机酸浸提的龙葵果提取物收率是16.5％，该酸浸出液含有以重量计30％总生物碱、13％总皂苷、5％总多酚与15％总多糖。

D、浓缩与干燥

步骤C得到的提取液使用布氏漏斗抽滤装置过滤，再使用旋转蒸发设备在旋转蒸发温度40℃下浓缩得到水含量为以重量计13％的稠膏状浓缩液，得到的稠膏状浓缩液接着在温度-80℃预冻24.6小时，再在冷阱温度-80℃与真空度0.1Pa的条件下真空冷冻干燥，直至龙葵果提取物水含量为以重量计4.8％，于是得到所述的龙葵果提取物(SNL1)。

实施例3：龙葵果提取物的提取

该实施例的实施方式如下：

A、龙葵果原料预处理

新鲜龙葵果清洗干净，自然风干达到它的水含量为以龙葵果重量计9.4％，使用粉碎设备粉碎，使用筛分设备筛分，收集粒度为60目以下的龙葵果粉；

B、浸泡

在室温下，按照以克计龙葵果粉与以毫升计蒸馏水的比为1：1.0，把步骤A得到的龙葵果粉加到蒸馏水中浸泡2.0h，得到龙葵果粉浸泡物；

C、浸提

步骤B得到的龙葵果粉浸泡物，按照它与氢氧化钠无机碱水溶液浸提液的体积计1：60、在常压、沸腾温度与pH 8.5的条件下使用0.6N氢氧化钠水溶液浸提130min，接着以同样的浸提方式重复进行3次，这些浸出液合并，接着将其pH值调节至7.2，得到一种碱浸出液；根据本申请说明书描述的方法计算得到，无机碱浸提的龙葵果提取物收率是15.5％，该碱浸出液含有以重量计20％总生物碱、15％总皂苷、30％总多酚与10％总多糖。

D、浓缩与干燥

步骤C得到的提取液使用布氏漏斗抽滤装置过滤，再使用旋转蒸发设备在旋转蒸发温度38℃下浓缩得到水含量为以重量计15％的稠膏状浓缩液，得到的稠膏状浓缩液接着在温度-80℃预冻24.8小时，再在冷阱温度-78℃与真空度0.2Pa的条件下真空冷冻干燥，直至龙葵果提取物水含量为以重量计4.9％，于是得到所述的龙葵果提取物(SNL2)。

实施例4：龙葵果提取物的提取

该实施例的实施方式如下：

A、龙葵果原料预处理

新鲜龙葵果清洗干净，自然风干达到它的水含量为以龙葵果重量计9.6％，使用粉碎设备粉碎，使用筛分设备筛分，收集粒度为60目以下的龙葵果粉；

B、浸泡

在室温下，按照以克计龙葵果粉与以毫升计蒸馏水的比为1：1.6，把步骤A得到的龙葵果粉加到蒸馏水中浸泡2.4h，得到龙葵果粉浸泡物；

C、浸提

步骤B得到的龙葵果粉浸泡物，按照它与氢氧化钠无机碱水溶液浸提液的体积计1：50、在常压、沸腾温度与pH 9.5的条件下使用0.5N氢氧化钠水溶液浸提120min，接着以同样的浸提方式重复进行4次，这些浸出液合并，接着将其pH值调节至7.5，得到一种碱浸出液；根据本申请说明书描述的方法计算得到，无机碱浸提的龙葵果提取物收率是17.5％，该碱浸出液含有以重量计15％总生物碱、12％总皂苷、30％总多酚与15％总多糖。

D、浓缩与干燥

步骤C得到的提取液使用布氏漏斗抽滤装置过滤，再使用旋转蒸发设备在旋转蒸发温度35℃下浓缩得到水含量为以重量计10％的稠膏状浓缩液，得到的稠膏状浓缩液接着在温度-80℃预冻24.9小时，再在冷阱温度-78℃与真空度0.2Pa的条件下真空冷冻干燥，直至龙葵果提取物水含量为以重量计4.9％，于是得到所述的龙葵果提取物(SNL2)。

实施例5：龙葵果提取物的提取

该实施例的实施方式如下：

A、龙葵果原料预处理

新鲜龙葵果清洗干净，自然风干达到它的水含量为以龙葵果重量计10.0％，使用粉碎设备粉碎，使用筛分设备筛分，收集粒度为60目以下的龙葵果粉；

B、浸泡

在室温下，按照以克计龙葵果粉与以毫升计蒸馏水的比为1：1.2，把步骤A得到的龙葵果粉加到蒸馏水中浸泡2.8h，得到龙葵果粉浸泡物；

C、浸提

把步骤B得到的龙葵果粉浸泡物添加到浓度为以体积计80％乙醇溶液中，在龙葵果粉浸泡物与乙醇溶液浸提液的体积计比1：50与温度80℃下加热回流浸提120min，接着以同样的浸提方式重复进行3次，这些浸出液合并，于是得到一种乙醇浸出液；根据本申请说明书描述的方法计算得到，该乙醇浸出液的龙葵果提取物收率是18.5％。按照前面描述的分析方法得到，该乙醇浸出液含有以重量计20％总生物碱、20％总皂苷、24％总多酚与16％总多糖；

D、浓缩与干燥

步骤C得到的提取液使用布氏漏斗抽滤装置过滤，再使用旋转蒸发设备在旋转蒸发温度40℃下浓缩得到水含量为以重量计12％的稠膏状浓缩液，得到的稠膏状浓缩液接着在温度-80℃预冻24.1小时，再在冷阱温度-80℃与真空度0.4Pa的条件下真空冷冻干燥，直至龙葵果提取物水含量为以重量计4.6％，于是得到所述的龙葵果提取物(SNL3)。

实施例6：龙葵果提取物的提取

该实施例的实施方式如下：

A、龙葵果原料预处理

新鲜龙葵果清洗干净，自然风干达到它的水含量为以龙葵果重量计9.2％，使用粉碎设备粉碎，使用筛分设备筛分，收集粒度为60目以下的龙葵果粉；

B、浸泡

在室温下，按照以克计龙葵果粉与以毫升计蒸馏水的比为1：1.4，把步骤A得到的龙葵果粉加到蒸馏水中浸泡4.0h，得到龙葵果粉浸泡物；

C、浸提

按照龙葵果粉浸泡物与蒸馏水的体积计比1：60，将步骤B得到的龙葵果粉浸泡物与蒸馏水混合，接着使用盐酸溶液将其pH调节至2.0，在温度37.0℃与搅拌器转速120rpm的条件下浸提110min提取1次，再使用氢氧化钠溶液将其pH调节至8.5，在同样条件下浸提2次，这些浸出液合并，接着将其pH值调节至7.0，得到一种半仿生浸出液；按照前面描述的方法计算得到，该半仿生浸出液的龙葵果提取物收率是23％，按照前面描述的分析方法得到，该半仿生浸出液含有以重量计23％总生物碱、18％总皂苷、20％总多酚与13％总多糖。

D、浓缩与干燥

步骤C得到的提取液使用布氏漏斗抽滤装置过滤，再使用旋转蒸发设备在旋转蒸发温度38℃下浓缩得到水含量为以重量计11％的稠膏状浓缩液，得到的稠膏状浓缩液接着在温度-80℃预冻24.8小时，再在冷阱温度-82℃与真空度0.5Pa的条件下真空冷冻干燥，直至龙葵果提取物水含量为以重量计4.0％以下，于是得到所述的龙葵果提取物(SNL4)。

试验实施例：本发明制备龙葵果提取物对血糖影响、调控Ⅱ型糖尿病胰岛素通路及胰岛素增敏能力测定

该试验实施例的实施方式如下：

1、实验动物准备

实验大鼠是鼠龄四周大雄性GK大鼠、与GK大鼠体重相近的非糖尿病Wistar大鼠，它们都购自SLAC Laboratory Animal Co.Ltd(Shanghai,China)，这些大鼠按照NIH动物饲养原则饲养。

实验方案如下：

将这些鼠分三大组，总计六小组，每小组三只鼠，具体如下：

Wistar对照组、GK对照组、GK实验组(喂养龙葵果提取物)；

GK实验组分别喂食实施例1制备的SNL1、实施例3制备的SNL2、实施例5制备的SNL3与实施例6制备的SNL4；

GK实验组按照50mg龙葵果提取物/Kg/day饲喂量喂食；

Wistar对照组以及GK对照组按照与GK实验组相同体积的生理盐水喂水。

2、动物实验血糖浓度测定

在这些鼠饲养一个月期间，每周都使用Boxbio血糖含量检测试剂盒(GOPODFormat)检测一次空腹血糖浓度、进食1h血糖浓度与进食2h血糖浓度测定。下表1列出这些鼠第四周血糖测定结果。

表1：第四周鼠血糖测定结果，mmol/L

由表1列出的结果可以清楚看出，与正常Wistar大鼠相比，GK大鼠的血糖值明显偏高，而喂食SNLGK大鼠的血糖浓度明显得到改善，因此，本发明制备的龙葵果提取物能够使GK大鼠血糖值保持在正常水平内，对GK大鼠血糖升高具有明显的抑制效果。因此，本发明得到的龙葵果提取物能明显改善糖尿病大鼠血糖偏高的症状。

3、动物实验WB检验

在这些鼠饲养一个月后，各组选择一只生长状况良好、血糖指标相对稳定的大鼠，收集肝脏及脂肪组织置于温度-80℃下保存。

实验时，提取肝脏及脂肪组织蛋白，进行Ⅱ型糖尿病相关靶点酶的蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting,WB)，所选蛋白为与胰岛素信号通路相关靶点的酶和胰岛素增敏相关酶，其中包括mTORC1、FoxO1、GSK-3β、IKK-β、JNK及内参蛋白β-actin作为对照。

具体实验方法参见相应说明书及文献：黄思颖，题目“”NAFLD小鼠模型的建立及GLP-1干预下内质网应激PERK-eIF2α-ATF4通路探索”，《福建医科大学》，2019中描述的方法进行。使用江苏碧云天生物(Beyotime)的蛋白提取及浓度测定试剂盒，WB实验使用相应的试剂盒。胰岛素信号通路局部图见图1，蛋白WB实验结果及灰度分析统计见图2。

图2的结果进一步证实，通过龙葵果提取物治疗，GK大鼠的胰岛素信号通路相关靶点的酶和胰岛素增敏相关酶表达量与Wistar大鼠基本相同，由此可见，采用本发明提取法得到的龙葵果提取物能明显改善糖尿病大鼠血糖偏高的症状，且能很好地恢复到正常水平。