一种云上黑山羊SNP标记及其在鉴定云上黑山羊品种中的应用

摘要

本发明涉及一种云上黑山羊SNP标记及其在鉴定云上黑山羊品种中的应用，所述云上黑山羊SNP标记包括26个位点，检测待测羊基因组中上述26个SNP位点的分型结果，将所得26个SNP位点的分型结果带入以参考群数据构建的模型中，计算出每一个SNP位点的分型结果所对应的“是”和“非”的概率值，将26个SNP位点的概率值求和，获得“是”和“非”的总和鉴定概率值，若“是”的总和鉴定概率值大于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为云上黑山羊。本发明首次提出用于鉴定云上黑山羊品种的参考群数据模型，采用本发明提供的这26个SNP位点及鉴定技术，对云上黑山羊的鉴定准确率高达89.58％，为今后云上黑山羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供了有力的技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及动物品种鉴定技术领域，具体涉及一种云上黑山羊SNP标记及其在鉴定云上黑山羊品种中的应用。

技术背景

云上黑山羊是针对本地山羊生长速度慢、产肉少、产羔率低、泌乳性能差、不适宜规模化养殖等不足，由云南省畜牧兽医科学院联合云南省种羊繁育推广中心和相关养殖企业，以努比山羊为父本、云岭黑山羊为母本，经22年5个世代系统选育而成的肉用黑山羊新品种。云上黑山羊具有被毛全黑、生长发育快、常年发情、繁殖力高、产肉性能好、适应性强和耐粗饲等优良特性。周岁公羊体重达53.17kg、母羊41.47kg，成年公羊体重达75.79kg、母羊56.49kg；母羊可两年三产，初产母羊产羔率为181.73％、经产母羊为232.00％，羔羊断奶成活率为90％以上；公羊日增重达257.78g、料肉比5.87:1，母羊日增重188.56g、料肉比7.27:1；6月龄以上公母羊的屠宰率均在53％以上。近10年来，云上黑山羊已在云南省16个州(市)120个县以及北京、天津、上海、重庆、河北、山西、辽宁、安徽、江西、山东、湖北、湖南、广东、海南、四川、贵州、甘肃、青海、广西、宁夏和新疆等21个省(市、自治区)推广应用，共推广种羊14.8万只，改良本地羊1107万只，表明云上黑山羊适宜于舍饲、放牧+补饲或全放牧的饲养方式，并能广泛适应与低海拔河谷地区(低于1000m)到较高海拔(2000m左右)的冷凉区，适合在我国南方山羊养殖主产区推广，具有广阔的应用前景。

随着云上黑山羊产业规模不断扩大、养殖企业逐步增多，为保证云上黑山羊的品种特征、区分真假个体、建立优质优价的市场经营体系、保护云上黑山羊种质资源及其优良性状、提升该品种的品牌价值，需要从基因组层面开展云上黑山羊的品种鉴定工作，深度挖掘该品种特有基因组位点信息。通过基因(SNP)身份证鉴定技术将为云上黑山羊品种鉴定工作提供有力的技术支撑。目前尚无关于用于鉴定云上黑山羊品种的SNP位点的报道，现有技术中对利用SNP位点鉴定羊品种的应用方法也多为通过位点组合或位点匹配的方式来进行鉴定，耗时长且结果准确度还有待于提高。

发明内容

本发明提供了一种云上黑山羊SNP标记及其在鉴定云上黑山羊品种中的应用，用于解决以上问题。

本发明提供的云上黑山羊SNP标记在鉴定云上黑山羊品种中的应用，所述云上黑山羊SNP标记包括26个位点，各位点的位置及多态性如下：

3_116568146位于3号染色体第116568146位，其脱氧核苷酸为C或A；

4_27534255位于4号染色体第27534255位，其脱氧核苷酸为G或A；

5_27394846位于5号染色体第27394846位，其脱氧核苷酸为G或T；

5_96914121位于5号染色体第96914121位，其脱氧核苷酸为A或G；

5_112308839位于5号染色体第112308839位，其脱氧核苷酸为A或G；

7_480924位于7号染色体第480924位，其脱氧核苷酸为C或T；

7_19019153位于7号染色体第19019153位，其脱氧核苷酸为T或A；

7_67980454位于7号染色体第67980454位，其脱氧核苷酸为T或C；

9_4210890位于9号染色体第4210890位，其脱氧核苷酸为A或G；

9_6480114位于9号染色体第6480114位，其脱氧核苷酸为C或A；

9_19778462位于9号染色体第19778462位，其脱氧核苷酸为C或T；

11_52712411位于11号染色体第52712411位，其脱氧核苷酸为G或A；

13_72160967位于13号染色体第72160967位，其脱氧核苷酸为A或C；

15_1341438位于15号染色体第1341438位，其脱氧核苷酸为G或A；

15_35311828位于15号染色体第35311828位，其脱氧核苷酸为A或G；

21_9035839位于21号染色体第9035839位，其脱氧核苷酸为G或T；

21_26850780位于21号染色体第26850780位，其脱氧核苷酸为C或T；

23_33685044位于23号染色体第33685044位，其脱氧核苷酸为T或A；

23_34234088位于23号染色体第34234088位，其脱氧核苷酸为G或T；

23_35769794位于23号染色体第35769794位，其脱氧核苷酸为T或G；

24_5617052位于24号染色体第5617052位，其脱氧核苷酸为C或G；

24_7388496位于24号染色体第7388496位，其脱氧核苷酸为T或C；

24_37720766位于24号染色体第37720766位，其脱氧核苷酸为C或T；

24_60570385位于24号染色体第60570385位，其脱氧核苷酸为A或G；

28_14160630位于28号染色体第14160630位，其脱氧核苷酸为C或T；

28_43951753位于28号染色体第43951753位，其脱氧核苷酸为T或C；

上述SNP位点的物理位置是基于山羊全基因组标准序列而定，版本号为GCF_001704415.1_ARS1，所述版本号的标准序列记载在如下网址中https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001704415.1。

进一步，所述应用为，检测待测羊基因组中上述26个SNP位点的分型结果，将所得26个SNP位点的分型结果带入以参考群数据构建的模型中，计算出每一个SNP位点的分型结果所对应的“是”和“非”的概率值，“是”表示“是云上黑山羊”，“非”表示“非云上黑山羊”，将26个SNP位点的概率值求和，获得“是”和“非”的总和鉴定概率值，若“是”的总和鉴定概率值大于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为云上黑山羊；反之，若“是”的总和鉴定概率值小于“非”，则该待测羊鉴定为非云上黑山羊。

进一步，所述以参考群数据构建的模型是以经过表型鉴定的云上黑山羊和非云上黑山羊为参考群，检测所述26个SNP位点的分型结果，计算出参考群中的每个SNP位点的分型结果对应羊品种的概率值。

进一步，所述的以参考群数据构建的模型中的每个SNP位点的分型结果对应羊品种的概率值为P(A|B)取自然对数得到的数值，所述P(A|B)的计算公式为P(A|B)＝P(B|A)*P(A)/P(B)，其中，P(A)为参考群中该位点的该分型经表型鉴定为是云上黑山羊的概率，P(B)为参考群中该位点的该分型经表型鉴定为非云上黑山羊的概率，P(A|B)为以参考群数据构建的模型中该位点的该分型鉴定为云上黑山羊的概率值，P(B|A)是根据参考群的分型数据计算得出的系数值。

进一步，以参考群数据构建的模型之一为，所述26个位点的各分型在不同品种间出现的概率值如下：

进一步，采用以下生物材料中任一种检测待测羊基因组中的所述26个SNP位点的分型结果：

1)成套引物，所述成套引物包括扩增SNP位点的多重引物；

2)含有1)的试剂；

3)含有1)或2)的试剂盒。

进一步，所述扩增SNP位点的多重引物由以下序列1-79所示的单链DNA分子组成：

本发明的有益效果如下：

1、本发明首次提出云上黑山羊最具代表性的26个差异SNP位点。

2、本发明首次提出用于鉴定云上黑山羊品种的参考群数据模型，该数据模型数据规模较大，可以作为云上黑山羊品种鉴定的通用参考群数据模型。

3、本发明通过双盲鉴定、判断模型调优和试剂盒开发，对384个样本进行基因(SNP)身份证鉴定和现场专家鉴定小组鉴定，结果双盲验证，确定了这26个SNP位点可以成功鉴定云山黑山羊品种，采用本发明提供的这26个SNP位点及鉴定技术，对云上黑山羊的鉴定准确率高达89.58％。

4、本发明为今后云上黑山羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供了有力的技术支持。

附图说明

图1为云上黑山羊差异性SNP位点筛选流程图；

图2为实施例2对26个羊差异性SNP位点进行盲测的结果对比图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1第一次筛选云上黑山羊差异性SNP位点

针对4个品种(云上黑山羊、杂交羊F2代、云岭黑山羊和川中黑山羊)共160样本数据，包含31768735位点。为了获得品种间高质量的差异位点，首先对样本及位点进行过滤，在此基础之上进行差异位点的筛选，具体流程图如图1。

对过滤后保留的110个样本及质控后剩余位点进行GWAS分析与Fst分析，从而进行品种间差异位点筛选。该项目中，存在4个品种，因此在gwas分析与Fst分析时，我们将样本分为2组(例如YSH.vs.Other，YSH:云上黑山羊),分别获取显著性差异位点。根基GWAS与Fst的结果，筛选出组间显著差异的TOP 23个SNP位点，如下所示：

11_50365909位于11号染色体第50365909位，其脱氧核苷酸为T或C；

11_52715918位于11号染色体第52715918位，其脱氧核苷酸为T或C；

15_35311828位于15号染色体第35311828位，其脱氧核苷酸为A或G；

21_9035839位于21号染色体第9035839位，其脱氧核苷酸为G或T；

23_33685044位于23号染色体第33685044位，其脱氧核苷酸为T或A；

23_34179239位于23号染色体第34179239位，其脱氧核苷酸为T或G；

23_34234088位于23号染色体第34234088位，其脱氧核苷酸为G或T；

23_34435666位于23号染色体第34435666位，其脱氧核苷酸为A或G；

23_34463361位于23号染色体第34463361位，其脱氧核苷酸为C或G；

23_34615247位于23号染色体第34615247位，其脱氧核苷酸为G或A；

23_34635186位于23号染色体第34635186位，其脱氧核苷酸为T或C；

23_34649302位于23号染色体第34649302位，其脱氧核苷酸为T或C；

23_34910560位于23号染色体第34910560位，其脱氧核苷酸为T或C；

23_34990766位于23号染色体第34990766位，其脱氧核苷酸为T或C；

23_35047942位于23号染色体第35047942位，其脱氧核苷酸为T或G；

23_35327798位于23号染色体第35327798位，其脱氧核苷酸为T或C；

23_35470876位于23号染色体第35470876位，其脱氧核苷酸为G或A；

23_35769794位于23号染色体第35769794位，其脱氧核苷酸为T或G；

23_35959171位于23号染色体第35959171位，其脱氧核苷酸为C或T；

23_36215905位于23号染色体第36215905位，其脱氧核苷酸为G或A；

24_60570385位于24号染色体第60570385位，其脱氧核苷酸为A或G；

4_27242973位于4号染色体第27242973位，其脱氧核苷酸为C或T；

7_67980454位于7号染色体第67980454位，其脱氧核苷酸为T或C；

使用质谱检测方法对4个品种的2304样本的这23个位点的分型进行检测，建库完成后对这些样本进行分析和鉴定，其中1755样本鉴定成功，准确率76.17％，其中云上黑山羊的鉴定成功率为76.11％，具体统计结果见下表。

表1通过质谱检测法采用23个SNP位点对4个品种山羊进行鉴定

盲测：

使用质谱检测方法对384个未经表型鉴定的样本进行分型检测，结束后使用鉴定数据库对样本进行鉴定，其中283样本鉴定成功，准确率73.70％，其中云上黑山羊的鉴定成功率为72.99％，具体统计结果见下表。

表2采用23个SNP位点对样本进行盲测验证

结论：采用第一次筛选获得的23个位点，云上黑山羊、F2杂交羊和川中黑山羊准确度较低。其中F2杂交羊相比于F1代可能会发生性状分离，不同个体中云上黑山羊的遗传背景相差较大，影响了云上黑山羊及杂交羊的鉴定。对于川中黑山羊，PCA结果中与云上黑山羊聚类有部分重复，进化树显示云上黑山羊与川中黑山羊聚在同一个大的分支，说明两者之间遗传距离较近，基因相似性较高。

实施例2第二次筛选云上黑山羊差异性SNP位点

考虑到鉴定准确率及位点在全基因组的分布情况，根据重测序数据分析结果进行第二次选点，筛选原则为选择品种间差异较大的位点，并且尽量保证在全基因组范围内均匀分布，新选择的26位点分布在3、4、5等12条染色体，位点详细信息见下表。

表3第二次筛选的26个SNP位点

建库及盲测：

使用质谱检测方法对4个品种384样本26个位点的分型进行检测，建库完成后对盲测样本进行鉴定，具体统计结果见图2。

由图2可知，云岭黑山羊鉴定成功率最高，100％正确；其次是F2杂交羊，鉴定准确率90％；云上黑山羊鉴定成功率89.08％。

综上，第二次筛选的26个SNP位点比第一次筛选的23个SNP位点作为鉴定云上黑山羊的鉴定位点时具有更高的准确度。

实施例3构建鉴定云上黑山羊和非云上黑山羊的参考群数据模型

采集1013只云上黑山羊(双柏县云南祥鸿农牧业有限公司、大姚县石羊镇个体户等)和1291只非云上黑山羊(双柏县爱尼山海资底大村、大姚县三岔河乡、四川资阳市乐至县川宗羊业公司等)血液或耳组织的基因组DNA，然后进行Sequenom检测。其中，Sequenom检测具体操作步骤如下：

1.引物设计

使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，，并交由生物公司合成。每个SNP的引物信息如表4序列1-79所示：

表4待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物信息

2.DNA质检

待实验样本用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/μl，转移至96孔板，-20℃储存备用。

3.引物稀释

(1)每个SNP，有三条引物(表1)，将这三条引物的编号标记在引物合成管的管盖上。

(2)Forward PCR引物、Reverse PCR引物先离心空甩后加水，加水量与OD值相关(引物管和引物设计表均有标识)，每1OD加36μl水。加水后室温放置30min后震荡混匀备用。(3)每个Well中多重SNP的Forward PCR引物、Reverse PCR引物混合时计算方法：每个SNP的Forward PCR引物、Reverse PCR引物各取2.5μl加水量(μl)＝500-重数×2.5×2(重数：well中SNP个数)

4.PCR扩增

PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl。

(1)在一个新的2.0ml EP管中配制PCR master mix溶液，具体如表5所示。

表5 PCR master mix溶液

PCR primer mix由表1中每个SNP位点的Forward PCR引物和Reverse PCR引物组成，且每条引物在最终反应体系PCR master mix溶液中的浓度均为0.0039μM。

(2)将配制好的PCR master mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为4μl，在384孔板的每个加样孔中加入PCR master mix液。该384孔板即为PCR反应板。

(3)取出已经制备好的DNA样品96孔板，使用8通道加样器，调节加样体积为1μl，加至相对应的384PCR反应板，贴上封口膜，震荡混匀后空甩。

(4)在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件如下表6所示。

表6 PCR反应条件

5.PCR产物碱性磷酸酶处理

(1)在PCR反应结束后，384反应板取出并空甩。

(2)配制碱性磷酸酶处理反应液，SAP Mix，具体如表7所示。

表7碱性磷酸酶处理反应液SAP Mix

(3)将配制好的SAP Mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μl，将SAP Mix加入384孔PCR反应板。贴上封口膜，震荡混匀后空甩。反应体系总体积为7μl(其中PCR产物5μl，SAP混合液2μl)。

(4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件如表8所示。

表8 PCR反应条件

启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理反应。

6.单碱基延伸

(1)在碱性磷酸酶处理结束后，将384反应板取出后空甩，在进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。

(2)配制单碱基延伸反应液，EXTEND Mix，如表9所示。(注意：Extend primer Mix与Well数一定要对应正确)

表9单碱基延伸反应液EXTEND Mix

上述Extend primer Mix由表4中每个SNP位点的单碱基延伸引物组成，且每条引物在最终反应体系EXTEND Mix中的浓度均为0.019μM。

(3)将配制好的EXTEND Mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μl，将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl及EXTEND Mix液2μl，总体系9μl。

(4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件，如下表10所示。

启动PCR仪进行单碱基延伸反应。

7.树脂纯化

将反应产物加16μl水进行稀释，稀释后使用树脂进行脱盐。

8.芯片点样

将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。

表10 PCR反应条件

9.质谱检测

上机(Agena Bioscience公司的Sequenom-核酸质谱分析平台)进行质谱检测，并收集数据；获得26个位点的基因分型。

10.通过参考群体的表型值和迭代条件期望算法计算出参考群贝叶斯模型中的每个SNP位点的对应羊品种的概率值；计算公式为：P(A|B)＝P(B|A)*P(A)/P(B)。根据检测到的分型结果，计算每个位点各分型在不同品种之间的差异。通过计算得出的概率值为实际概率值去自然对数后的结果，该数值越大，说明出现的概率越大。表11为构建的参考群数据模型。

表11参考群26个位点各分型在不同品种间出现的概率

实施例4、盲测验证本方法的准确率

检测待测羊基因组中上述26个SNP位点的分型结果，将所得26个SNP位点的分型结果带入实施例3构建的参考群数据模型中，计算出每一个SNP位点的分型结果所对应的“是”和“非”的概率值，“是”表示“是云上黑山羊”，“非”表示“非云上黑山羊”，将26个SNP位点的概率值求和，获得“是”和“非”的总和鉴定概率值，若“是”的总和鉴定概率值大于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为云上黑山羊；反之，若“是”的总和鉴定概率值小于“非”，则该待测羊鉴定为非云上黑山羊。

选取384只山羊个体进行品种鉴定盲测，将鉴定结果与专家给出的真实结果进行比对，检验鉴定准确率。实验结果：盲测共鉴定出269份云上黑山羊样本和75份非云上黑山羊样本，与专家给定的样本实际品种进行对比，计算得出鉴定准确率为89.58％。

其中，部分样本的判定方式如下：

表12样本F127判定表

表13样本L506判定表

表14样本H292判定表

表15样本S838判定表

注：在计算中获得的概率值为(ln)，因此为负数。我们在计算中将所有的位点概率值进行相加，得到的云上样概率值总和与非云上羊概率值总和进行对比，数值大的对应结果即我们判定的最终结果。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 一种云上黑山羊SNP标记及其在鉴定云上黑山羊品种中的应用

<160> 78

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> goat

<400> 1

acgttggatg gggaggaaaa gggagcaac 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 2

acgttggatg acgatcattg cacacgcttc 30

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> goat

<400> 3

ctccccagaa gacga 15

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 4

acgttggatg tgagtgcagc agtttcacag 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 5

acgttggatg tatttagggc ttcccaggtg 30

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> goat

<400> 6

tgcaggagca gcagc 15

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 7

acgttggatg gttgtgaaaa agacgaaggc 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 8

acgttggatg ttttccacaa ccgaactgcc 30

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> goat

<400> 9

gacgaaggcc gtatgt 16

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 10

acgttggatg ctgggaagcc catacaaaag 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 11

acgttggatg tcttaccaag cccatgttac 30

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> goat

<400> 12

cccatgttac tgcccaa 17

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 13

acgttggatg ctccagtgac aagagaaagc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 14

acgttggatg acgtcacttc catctacacc 30

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> goat

<400> 15

gcacctccgt taaaaaa 17

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 16

acgttggatg tctcaaataa cctgggttgc 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 17

acgttggatg ttttgcgtgt gcagtgaagc 30

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> goat

<400> 18

agtgaagctc agttgtg 17

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 19

acgttggatg ccagggaagt tcaggttttg 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 20

acgttggatg tcacatcaca gagatggtgg 30

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> goat

<400> 21

gatatagggg tggcttg 17

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 22

acgttggatg gtcaggacga ctctgtcaac 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 23

acgttggatg tgccctcaga gacacataag 30

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> goat

<400> 24

tcccggcaca gcccagcac 19

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 25

acgttggatg caacagcctc agatatgcag 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 26

acgttggatg ctcatcagga ggctctttag 30

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> goat

<400> 27

ataataccac cctaatggc 19

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 28

acgttggatg ccttgagaac cccatgtatg 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 29

acgttggatg gctccactga tctccagtag 30

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> goat

<400> 30

tgatctccag tagcatatt 19

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 31

acgttggatg tttggagcta agacatctgg 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 32

acgttggatg cttaaccagc tacgcaaccg 30

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> goat

<400> 33

aaatcaagat ccagaaagg 19

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 34

acgttggatg gttctatcta ttctgtctcc 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 35

acgttggatg ttgagcacct agcagagttg 30

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> goat

<400> 36

gtggcaagga aaaataagcg 20

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 37

acgttggatg gtgagggaaa gcctaaacag 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 38

acgttggatg gctccgtgca attaaatcgc 30

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> goat

<400> 39

ccccgaggag ctataccaac c 21

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 40

acgttggatg tacagttcac gggatcgcag 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 41

acgttggatg ccctacacat gattttgtgc 30

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> goat

<400> 42

gtctaataac cagtgcattt g 21

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 43

acgttggatg gatcttgctg ttcaagggac 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 44

acgttggatg cataaatgag tctgagtgcc 30

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> goat

<400> 45

tgcgtctgag tgccaaaaaa t 21

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 46

acgttggatg cagatacagt gagtaactcc 30

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 47

acgttggatg ggaagaggat ggaaatctgc 30

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> goat

<400> 48

ggggtctgca tgtagagtaa gc 22

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 49

acgttggatg gtgttcttgc ctggagaatc 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 50

acgttggatg gctgctaagt cacttcagtc 30

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> goat

<400> 51

cccacgtcac ttcagtcgtg tcc 23

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 52

acgttggatg gctaagattc ctttcccctg 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 53

acgttggatg gcactgaagt tatcacctgc 30

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> goat

<400> 54

cccatggcct tggaaaagtc tcc 23

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 55

acgttggatg gtggtcaaac aagagatggc 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 56

acgttggatg aaattcaccc attccagtcc 30

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> goat

<400> 57

gggcttccta caatgtcgat gtt 23

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 58

acgttggatg agcattagca cctacttccc 30

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 59

acgttggatg cgtgttctcc acaaacattg 30

<210> 60

<211> 23

<212> DNA

<213> goat

<400> 60

gtcttaagag ttagattttg act 23

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 61

acgttggatg ccatgctctt ggattggaag 30

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 62

acgttggatg tgcttgttcc tagttctgtg 30

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> goat

<400> 63

gaggaaatct gcagattgct ttgg 24

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 64

acgttggatg ccaaatgcca agaatcagcc 30

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 65

acgttggatg caggcttgct tcccagttac 30

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> goat

<400> 66

tcccagttac ttactaaatt actcc 25

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 67

acgttggatg tctgcccatg taagtgacag 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 68

acgttggatg cttaggggat cccatcatgc 30

<210> 69

<211> 25

<212> DNA

<213> goat

<400> 69

cccccagcac ggggcaccgc agcac 25

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 70

acgttggatg agaaaagtca ggcctttcag 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 71

acgttggatg gagtacaaga ctgagagtgg 30

<210> 72

<211> 25

<212> DNA

<213> goat

<400> 72

cagtaaaaac gttattaaag catct 25

<210> 73

<211> 29

<212> DNA

<213> goat

<400> 73

acgttggatg caactcatca aaatgtgtg 29

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 74

acgttggatg ctgttgctgt tggatgagtg 30

<210> 75

<211> 26

<212> DNA

<213> goat

<400> 75

cccgcatcaa aatgtgtgaa atgacc 26

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 76

acgttggatg gaatccacct tgcaatgcag 30

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> goat

<400> 77

acgttggatg agagtctgac tgagcaactg 30

<210> 78

<211> 26

<212> DNA

<213> goat

<400> 78

gggcggactg agcaactgaa caatgt 26