麦考酚酸在制备预防、治疗蓝耳病以及抗PRRSV的药物中的应用

摘要

本发明公开了麦考酚酸在制备预防、治疗蓝耳病以及抗PRRSV的药物中的应用。本发明在细胞实验中，验证了麦考酚酸能够显著抑制PRRSV的基因和蛋白表达，从而抑制PRRSV的复制和感染。

说明书

技术领域

本发明涉及兽药领域，特别涉及麦考酚酸在制备预防、治疗蓝耳病以及抗PRRSV的药物中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称蓝耳病，其接触传染性很高，有地方流行性特性。猪蓝耳由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起，其只会感染猪，其它动物不会感染，各种日龄、品种的猪都可以感染此病毒，其中日龄在1月以内的仔猪和妊娠母猪是最易感猪群。

蓝耳病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到PRRSV。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种是以Lelystad Virus(LV)毒株为代表的欧洲型，也称为PRRSV1型，另一种是以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型，也称为PRRSV 2型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。由于PRRSV具有免疫抑制性、变异快、抗体依赖增强性、持续性感染、维持时间长等特点，因此难以防控。

其中，PRRSV的免疫抑制性体现在PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞(Porcinealveolar macrophages，PAMs)，PAMs属于免疫细胞，PAMs被PRRSV感染以后，机体的免疫系统遭到损坏，免疫功能下降，即免疫抑制；PRRSV为RNA病毒，其变异速度快，因此疫苗的免疫效果有限，需不断地更新疫苗；抗体依赖性增强体现在低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对PRRSV的增殖有促进作用；病毒持续性感染体现在PRRSV感染后猪只后，在猪只体内持续时间可长达5个月。

目前用于防控PRRS主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，但是以上两种疫苗均存在一定缺点。其中，灭活疫苗存在免疫期短、免疫作用弱、产生免疫的时间长以及存在散毒的可能等缺点。而弱毒疫苗则存在毒力返强、重组等风险。此外，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株的疫苗不具有交叉保护力。

可见，现有技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供麦考酚酸在制备预防、治疗蓝耳病以及抗PRRSV的药物中的应用，旨在解决现有技术中防治蓝耳病的药物效果不佳的问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

麦考酚酸在制备预防蓝耳病的药物中的应用。

麦考酚酸在制备治疗蓝耳病的药物中的应用。

麦考酚酸在制备抗PRRSV的药物中的应用。

有益效果：

本发明公开了麦考酚酸对PRRSV具有显著的抗病毒作用，具体的，本发明通过Western Blot和qRT-PCR等技术在多个层面上证明了麦考酚酸能够显著抑制PRRSV感染和复制，具有显著的抗PRRSV作用，可以应用于制备预防蓝耳病的药物，以及用于制备抗PRRSV的药物。

附图说明

图1为不同浓度的麦考酚酸的细胞毒性结果。

图2为麦考酚酸、PRRSV共处理实验中，通过Western Blot检测细胞中PRRSV N蛋白表达量的结果。

图3为麦考酚酸、PRRSV共处理实验中，通过qRT-PCR检测细胞中PRRSV N基因表达量的结果。

图4为麦考酚酸前处理、PRRSV后感染实验中，通过Western Blot检测细胞中PRRSVN蛋白表达量的结果。

图5为麦考酚酸前处理、PRRSV后感染实验中，通过qRT-PCR检测细胞中PRRSV N基因表达量的结果。

图6为PRRSV先感染、麦考酚酸后处理实验中，通过Western Blot检测细胞中PRRSVN蛋白表达量的结果。

图7为PRRSV先感染、麦考酚酸后处理实验中，通过qRT-PCR检测细胞中PRRSV N基因表达量的结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

麦考酚酸(MPA)目前主要用于制作用于人体的免疫抑制药。MPA通过对次黄嘌呤单磷酸脱氢酶的抑制作用可使细胞停留于细胞周期的G1期。在T细胞，MPA可抑制细胞周期素依赖性激酶(CDK)的活性，阻断cDK抑制药p27(Kipl)的清除。

目前，未有报道公开将麦考酚酸用于治疗猪只的蓝耳病，而本发明的技术方案在于：麦考酚酸在制备预防、治疗蓝耳病以及抗PRRSV药物中的应用。

以下实施例为验证麦考酚酸安全性及药效的实验，实验结果通过统计学方法进行检验，所有试验均进行至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。

实施例1

麦考酚酸的细胞毒性实验

1.实验材料

麦考酚酸(Mycophenolic Acid,MPA)：纯度≥95％，由Sigma-Aldrich公司提供。

CCK-8：购自GlpBio公司，作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。

2.试验方法

用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至细胞汇合度为60～70％，弃去培养液，分别加入含麦考酚酸倍比稀释的营养液作用48h，以PBS作为对照组，然后加入10％(v/v)的CCK-8继续培养3h，使用多功能酶标仪读取450nm吸光度。

数据处理：以PBS对照组细胞活性作为100％，倍比稀释的麦考酚酸处理的细胞的吸光度比上PBS对照组吸光度，即为在不同浓度麦考酚酸下的相对细胞活性，结果如图1所示。

3.结果

由图1可知，当麦考酚酸浓度为1μM及以下时，其对Marc-145细胞没有毒性，细胞活性100％。

实施例2

实验一：麦考酚酸、PRRSV共处理对细胞抗PRRSV的影响

以PRRSV 2型毒株CHR6病毒为例研究麦考酚酸的抗PRRSV作用。

(1)在含10％胎牛血清的DMEM培养液的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度达70％时，弃去培养液，PBS洗3次，然后用MOI＝1的PRRSV感染Marc-145细胞，同时加入麦考酚酸(终浓度为0.5μM和1μM)进行培养，并设不加麦考酚酸对照组。培养24h后，弃去培养液，PBS洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，测定细胞蛋白浓度，并通过Western Blot测定细胞中PRRSV N蛋白的表达量，结果如图2所示。图中，MPA为麦考酚酸。

从图2的结果可以看出，麦考酚酸能够明显抑制PRRSV N蛋白表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明麦考酚酸能够明显抑制病毒蛋白表达。

(2)在含10％胎牛血清的DMEM培养液的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度达70％时，弃去培养液，PBS洗3次，然后用MOI＝1的PRRSV感染Marc-145细胞，同时加入麦考酚酸(终浓度为0.5μM和1μM)进行培养，并设不加麦考酚酸对照组。培养24h后，弃去培养液，PBS洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，提取细胞总RNA，然后进行反转录，通过qRT-PCR测定细胞中PRRSV-N基因/GADPH基因的相对表达量，结果如图3所示。

从图3的结果可以看出，麦考酚酸能够明显抑制PRRSV N基因表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明麦考酚酸能够明显抑制病毒基因表达。

实施例3

实验二：麦考酚酸前处理、PRRSV后感染对细胞抗PRRSV的影响

(1)在含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，在不同组别中分别加入不同浓度的麦考酚酸(0μM、0.5μM、1μM)，培养4h，然后用MOI＝1的PRRSV感染Marc-145细胞，在含2％胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养24h，培养结束后，弃去培养液，用PBS洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，测定细胞蛋白浓度，并通过Western Blot测定细胞中PRRSV N蛋白的表达量，结果如图4所示。

从图4的结果可以看出，麦考酚酸能够明显抑制PRRSV N蛋白表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明先加麦考酚酸后接毒能够明显抑制病毒蛋白表达。

(2)在含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，在不同组别中分别加入不同浓度的麦考酚酸(0μM、0.5μM、1μM)，培养4h，然后用MOI＝1的PRRSV感染Marc-145细胞，在含2％胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养24h，培养结束后，弃去培养液，用PBS洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，提取细胞总RNA，然后进行反转录，通过qRT-PCR测定细胞中PRRSV-N基因/GADPH基因的相对表达量，结果如图5所示。

从图5的结果可以看出，麦考酚酸能够明显抑制PRRSV N基因表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明先加麦考酚酸后接毒能够明显抑制病毒基因表达。

实施例4

实验三：PRRSV先感染、麦考酚酸后处理对细胞抗PRRSV的影响

(1)在含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝1接毒PRRSV培养4h，然后在不同组别中分别加入不同浓度的麦考酚酸(0μM、0.5μM、1μM)，在含2％胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养24h，培养结束后，弃去培养液，PBS洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，测定细胞蛋白浓度，并通过Western Blot测定细胞中PRRSV N蛋白的表达量，结果如图6所示。

从图6的结果可以看出，麦考酚酸能够明显抑制PRRSV N蛋白表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明先接毒后加麦考酚酸能够明显抑制病毒蛋白表达。

(2)在含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝1接毒PRRSV培养4h，然后在不同组别中分别加入不同浓度的麦考酚酸(0μM、0.5μM、1μM)，在含2％胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养24h，培养结束后，弃去培养液，PBS洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，提取细胞总RNA，然后进行反转录，通过qRT-PCR测定细胞中PRRSV-N基因/GADPH基因的相对表达量，结果如图7所示。

从图7的结果可以看出，麦考酚酸能够明显抑制PRRSV N基因表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明先接毒后加麦考酚酸能够明显抑制病毒基因表达。

本发明通过上述实施例在细胞实验水平上证明了，麦考酚酸在不同时期添加，均具有抑制病毒基因和蛋白表达的能力，能够应用于制备预防或治疗蓝耳病以及抗PRRSV的药物。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。