一种Nup50A基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用

摘要

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种Nup50A基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，通过从番茄中分离和克隆到Nup50A基因，构建了番茄Nup50A基因敲除重组载体pTX‑Nup50A、基因敲除重组菌株LBA4404‑pTX‑Nup50A及其番茄Nup50A基因敲除纯合株系，本发明证实了敲除Nup50A基因可以有效提高番茄抗灰霉菌侵染的能力，番茄Nup50A基因敲除株系与野生型株系相比，叶片上的病斑直径及叶片中的灰霉量均明显减小。本发明通过实验证实Nup50A基因在提高番茄抗灰霉病方面具有应用价值，并为利用Nup50A基因培育抗病植株奠定良好的理论和应用基础。

说明书

技术领域：

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种Nup50A基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。

背景技术：

真核生物核孔蛋白复合物介导大分子物质如蛋白和RNA的核质间穿梭，在细胞生命活动的维持和调控中发挥着极其重要的作用。核孔复合物(nuclear pore complex，NPC)是细胞中最大的多蛋白复合体，研究显示其至少由30多种核孔蛋白(nucleoporin，Nup)以多拷贝的方式组成。其基本组成在脊椎动物、酵母及植物中具有高度保守性。植物核孔蛋白的相关研究尚不多见，仅有少数的几种植物核孔蛋白的功能得到了初步鉴定，现有研宄结果显示其广泛参与多种生理生化过程。

1、激素信号转导

拟南芥SAR1和SAR3，突变后会影响mRNA的核输出以及生长素响应转录抑制子IAA17蛋白的亚细胞定位，从而可以部分恢复axr-1对生长素抗性的表型，表明它们参与生长素信号转导途径。此外，拟南芥Trp/Mlp1p/Mlp2p突变也表现出与sar1和sar3类似的表型。除了参与生长素信号转导，Nup160突变还会增强拟南芥对乙稀的响应，表明其可能参与了生长素与乙烯信号间的互作。

2、对冷害胁迫的响应

拟南芥Nup160突变会在冷害胁迫下抑制CBF3的表达，降低植物对冷害胁迫的抗性。HOS1作为植物低温信号转导的负向调节因子，能够调节冷害及冻害胁迫相关基因的表达。拟南芥中过量表达HOS1可以抑制CBF家族基因的表达，增强拟南芥对冻害的敏感性，而hos1突变则会导致低温响应基因的高水平表达，提高植物对冷害胁迫的抗性。同时HOS1蛋白具有RING-finger结构域，能够行使E3泛素连接酶功能，在冷诱导条件下可以特异性介导ICE1蛋白的降解，从而削弱拟南芥对低温的响应。

3、植物开花及生长发育

拟南芥Nup160、Nup96及NUA/TPR及除参与上述生理过程外，还影响植物其他的发育过程，如开花时间和育性等。

4、植物对病原的响应和共生

拟南芥中MOS3(动物Nup96的同源基因)，突变后会增强拟南芥对病原的敏感性。MOS7(动物Nup88的同源基因)突变会导致拟南芥R蛋白介导的免疫性以及基础和系统获得性抗性缺陷。Seh1和Nup160突变也会破坏植物对病原的基础抗性。本氏烟中Nup75参与致病疫霉侵染后乙烯介导的植物保卫素的产生。核孔蛋白突变还会影响植物与微生物的共生。如百脉根Nup85,Nup133、和NENA(即SEC13的同源基因)突变会影响结瘤。

可以看出，核孔蛋白在植物生长发育及对环境胁迫的响应等各个方面均发挥着举足轻重的作用。然而目前我们对于植物核孔蛋白功能及分子机制的研究非常少且主要集中在拟南芥中。在小鼠细胞中，Nup50A为包含5个FG重复的亲水性蛋白，其定位可以在NPC和核质间移动，为细胞分化和原始生殖细胞生存所必须且参与DNA损伤修复。在植物中Nup50A的生物学功能未见任何报道。

发明内容：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足和缺陷，提供一种Nup50A基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。本发明从番茄中分离和克隆到Nup50A基因，构建了Nup50A基因敲除重组载体pTX-Nup50A及其纯合株系，并且证实了Nup50A基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种Nup50A基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，所述Nup50A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述应用包括以下步骤：

(1)构建Nup50A基因敲除重组载体：根据Nup50A基因的CDS序列设计引后，并以质粒pTX-043为模板，进行PCR扩增；扩增产物纯化后，使用限制性内切酶Bsa I对其进行酶切，回收酶切产物后与pTX-041质粒进行连接，得到NUP50A基因敲除重组载体；

(2)构建Nup50A基因敲除重组菌株：将所述Nup50A基因敲除重组载体转化至农杆菌中，得到Nup50A基因敲除重组菌株；

(3)构建Nup50A基因敲除株系：将所述Nup50A基因敲除重组菌株转化进植物子叶中，使用抗生素Kan对转化的愈伤组织进行筛选，并培养至得到再生植物，即得到Nup50A基因敲除株系。

进一步的，所述步骤(1)中引物的序列为

Nup50A-F0：

5’-ATATATGGTCTCGTTTGCCCCTTTGCAGCAATCCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；

Nup50A-R0：

5’-ATTATTGGTCTCGAAACGGCTGAAACCAAGGAAGGCACAAACTACACTGTTAGATTC-3’。

进一步的，所述质粒为pTX-Nup50A。

进一步的，所述基因敲除重组载体为pTX-Nup50A。

进一步的，所述农杆菌为LBA4404。

进一步的，所述步骤(3)中培养的条件为16h光照(26℃)/8h黑暗(18℃)。

进一步的，所述Nup50A基因敲除株系与野生型株系相比，叶子上的病斑直径明显减小。

进一步的，番茄Nup50A基因敲除株系与野生型株系相比，叶片上的灰霉量明显降低。

进一步的，所述植物为番茄。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果：本发明从番茄中分离和克隆到Nup50A基因，并进一步将Nup50A基因靶点信息连接到基因敲除载体pTX-041上，获得Nup50A基因敲除重组载体pTX-Nup50A，再利用农杆菌得到基因敲除重组菌株LBA4404-pTX-Nup50A，并侵染转化番茄子叶，得到纯合的Nup50A基因敲除株系，通过研究基因敲除转基因株系的表型，并将其与相同条件下生长的野生型番茄的叶子上的病斑进行比较。本发明通过实验分析首次证明了Nup50A基因具有调控番茄对灰霉病抗病性的功能，敲除Nup50A基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力；Nup50A基因敲除纯合株系叶子上的病斑明显减小，灰霉量也明显低于野生型番茄株系。本发明的技术方案对Nup50A基因在提高番茄对灰霉病的抗病性上具有应用价值，同时也为利用Nup50A基因培育抗病、高产的番茄品种奠定良好的理论和应用基础。

附图说明：

图1为Nup50A靶点序列的PCR扩增，其中M为DNA marker，1-3均为pTX-Nup50A靶点序列PCR产物。

图2为敲除载体构建结果，其中M为DNA marker，1-4为重组质粒的筛选。

图3为Nup50A基因T2代纯合敲除突变体突变位点序列比较结果。

图4为Nup50A基因敲除纯合株系的抗病性变化结果；

图5为Nup50A基因敲除纯合株系中叶片上病斑直径的结果，(**p<0.01)。

图6为Nup50A基因敲除纯合株系叶片中的灰霉量的结果，(**p<0.01)。

具体实施方式：

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为市售商品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所述的PQB载体、pTX-041载体和pTX-043载体，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1：

番茄Nup50A基因敲除突变体和纯合株系的获得

1、番茄Nup50A基因敲除突变体的获得

(1)载体构建

在GeneBank数据库中获得番茄NUP50A基因的CDS序列，其长度为1347bp，编码含有449个氨基酸的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(下划线为靶点序列)，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在CRISPR direct网站输入Nup50A基因全序列，根据结果筛选合适的靶点，其中选择的靶点分别为：CCCCTTTGCAGCAATCCGCT和GGCTGAAACCAAGGAAGGCA，并据此设计引物，引物序列如下：Nup50A-F0：

5’-ATATATGGTCTCGTTTGCCCCTTTGCAGCAATCCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3(SEQ IDNO.3)；

Nup50A-R0：

5’-ATTATTGGTCTCGAAACGGCTGAAACCAAGGAAGGCACAAACTACACTGTTAGATTC-3’(SEQID NO.4)。

以质粒pTX-043为模板，NUP50A-F0和Nup50A-R0为引物，并通过高保真酶对靶点序列进行PCR扩增，电泳结果如图1所示，将扩增产物进行回收、纯化；使用限制性内切酶Bsa I对纯化PCR产物和pTX-041质粒进行酶切，分别回收后，在T4连接酶的催化下进行过夜连接；连接完成后，将连接产物转化进大肠杆菌JM109，挑选含有重组质粒的阳性克隆送公司测序，最后将测序无误的重组质粒命名为pTX-Nup50A。其中，质粒筛选时所用引物的序列如下：

pTX-Fw：

5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’(SEQ ID NO.5)；

pTX-Rv：

5’-GCAGGCATGCAAGCTTATTGG-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)转基因植株的制备

将重组载体pTX-Nup50A转化至农杆菌LBA4404中，得到重组菌株LBA4404-pTX-NUP50A。

按照农杆菌介导的转基因方法利用重组菌株LBA4404-pTX-Nup50A对番茄子叶进行转化；再利用抗生素Kan对转化的愈伤组织进行筛选，同时设置转空载体作为对照；每2-3周更换培养基直到得到再生苗，其中培养条件为16h光照(26℃)/8h黑暗(18℃)。

分别提取再生苗的基因组DNA，对Nup50A基因包含靶点的部分序列进行PCR扩增，所用引物的序列为：

Nup50A-F1261：

5’-GACAATCCTG GTCTCGATGA TGAT-3’(SEQ ID NO.7)；

Nup50A-R1920：

5’-CCCAGTCCCT GAAAATCCTG TG-3’(SEQ ID NO.8)。

将得到的PCR产物经电泳检测后切胶送生物公司测序；如果序列靶点附近开始有套峰或者序列在两个靶点之间有部分缺失，则说明该植株为Nup50A敲除阳性植株。测序结果显示，本发明得到3个Nup50A敲除阳性植株，并分别标记为Nup50A-4-12、Nup50A-7-6和Nup50A-11-1。

2、番茄NUP50A基因敲除纯合株系的获得

收获T0代敲除阳性植株Nup50A-4、Nup50A-7和Nup50A-11的种子作为T1代；分别将得到的T1代种子播种，待2-3周后每个敲除系分别取5-10棵植株，提取其基因组DNA，用Nup50A-F1261和Nup50A-R1920引物对进行PCR扩增，PCR产物回收后连接pMD-18T载体，挑选阳性克隆送公司测序。每个敲除系的植株送4个样品去克隆。测序结果显示，每个敲除系植株的4个克隆样品均无套峰，且靶点位置发生突变或两个靶点之间发生部分缺失，由此确定样品均为Nup50A基因敲除纯合株系。

将鉴定得到的三株阳性Nup50A基因敲除纯合株系分别命名为敲除系Nup50A-4-12、Nup50A-7-6和Nup50A-11-1。与野生型植株相比，敲除系Nup50A-4-12基因第528位后多了一个T发生移码突变；敲除系Nup50A-7-6基因中缺失该基因的第528位，发生移码突变；敲除系Nup50A-11-1基因中缺失该基因的第528-531位，发生移码突变，具体的比对序列信息见图3。将得到的Nup50A基因敲除纯合株系移栽大盆，收取种子，用于后续的实验。

实施例2：

阳性番茄Nup50A基因敲除植株表型的鉴定

1、将Nup50A基因敲除株系Nup50A-4-12、Nup50A-7-6和Nup50A-11-1与野生型番茄(WT)的种子分别播种于营养土中，培养于温室中，其中培养条件为16h光照(26℃)/8h黑暗(18℃)。然后，选取4周左右、大小长势相同的NUP50A基因敲除纯合株系与野生型各3组，每组含3棵番茄植株，用孢子浓度为106的孢子液接种番茄叶片，将叶片置于塑料盒中，上面敷上一层保鲜膜以保持百分百湿度，在22℃下保持24-48小时后观察番茄叶片发病情况并进行数据统计。结果如图4和图5所示，与野生型相比，Nup50A基因敲除纯合株系叶子上的病斑直径明显减小。

2、对灰霉菌侵染后的番茄叶片提取总RNA，用qRT-PCR检测叶片中的灰霉量，并使用番茄Actin做内参，所用引物序列如下：

β-Tubulin-F：

5’-ACCGTTCCAGAGTTGACTCAA-3’(SEQ ID NO.9)；

β-Tubulin-R：

5’-GCAAGAAAGCCTTTCTTCTGA-3’(SEQ ID NO.10)。

结果如图6所示，NUP50A基因敲除纯合株系中的灰霉量明显低于野生型番茄。

以上证据表明Nup50A基因对番茄抵抗灰霉菌侵染有重要作用，且敲除Nup50A基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力，因此番茄Nup50A基因具有调控番茄抵抗灰霉菌侵染的功能。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表：

SEQ ID NO.1

ATGGGAGATGCCGAGAACTCTCTTCAACCATCAAAGAAAAGGGCAGCTATAAAGGAATTATCACGAGACAATCCTGGTCTCGATGATGATGAAAATGAAGCTGAGCTAGAGACTGGGTCTTTCAAGAAAGCAAGTGAGGAGGTGATGGCAAGTAGAAGAATTGTCAAAGTTCGTCGCAGTCAAACTACTTCATCTACAGCTACACCTTCAGCTAACCCCTTTGCAGCAATCCGCTTGGTTCCACCCACTGAGTCCAGTATCCCGTCTACTGTGATAACAAGTGAAGTTGAGAGTGGGATAACAAGTTCAGGTAAACCAGAAGATAAAAATGACATTGGTGAGGCAACTAGAAAGGAGACAAATGATGTGTGTAAGGAAGAGTTGAAGGAATCTGATCAAATTTCTAAGCCATCAGAAGGTAATGTTGATGAATCCAATGTTGTCAAGGAGAAAGTTGAAACTCCTAATGAGGCTGACAAACCTGAATCTGCTGAAGAGAAGGTAGCAGATGATGAGAAAGTCCAGGCTGAAACCAAGGAAGGCACAGTAGTTGAGAAGAGCGAAAATGACAGTAAGAAGGATGTGGAAGTCGAGAAAACAAAGAATGAAGAACAAAATGATGCTGGTGGTGAGAAAAGTGAGAAGGGTGCAGAAACTGCTTCTTTTAGCTCATTCCAACAACTCTCAAGTGGCCAAAATGCTTTCACAGGATTTTCAGGGACTGGGTTCTCCAGCACTACTTTCTCCTTTGGAGGTATTTCAAAAGAGGGATCTTCTCTAGGTTTTGGTTCTGAATCAGGTGCTGGTTCTCTCTTTGGAGCAAAAAGTGACCAGTCACCATTTGGACTTAATCTTCCTACTAATGGAAGTACTTCTCTGTTTGGAAACTCGGGGTCATCCCTTGTGAATAAGAGTGAGGGTACTGGATTTCCTTCCAAAGAAGAGGTCACTGTTGAAACAGGGGAGGAAAATGAAAAACCCGTATTCGCAGCTGATTCCGTGCTGTTTGAATATCTTAATGGAGGGTGGAAAGAGCGGGGGAAGGGAGAACTAAAGGTCAATGTTTCTACAACAGGGGAAGGAAAAGGTAGACTTGTTATGAGGACCAAAGGAAATTACAGATTGATCTTGAATGCCAGCCTTTTTCCAGAAATGAAGCTTGCTAATATGGACAAAAGAGGGGTCACTTTCGCTTGCTTGAATAGTGCTGCTGACGGAAAAGGACTTTCTACTATTGCTCTGAAGTTCAAGGATGCCTCCATCGTGGAAGATTTTCGTGCTGCTGTAGTGGAACATAAAGGTACTACAACTGGTTCTTTGAAGACACCAGAAAACTCTCCTAAAGCTTAA

SEQ ID NO.2

MGDAENSLQPSKKRAAIKELSRDNPGLDDDENEAELETGSFKKASEEVMASRRIVKVRRSQTTSSTATPSANPFAAIRLVPPTESSIPSTVITSEVESGITSSGKPEDKNDIGEATRKETNDVCKEELKESDQISKPSEGNVDESNVVKEKVETPNEADKPESAEEKVADDEKVQAETKEGTVVEKSENDSKKDVEVEKTKNEEQNDAGGEKSEKGAETASFSSFQQLSSGQNAFTGFSGTGFSSTTFSFGGISKEGSSLGFGSESGAGSLFGAKSDQSPFGLNLPTNGSTSLFGNSGSSLVNKSEGTGFPSKEEVTVETGEENEKPVFAADSVLFEYLNGGWKERGKGELKVNVSTTGEGKGRLVMRTKGNYRLILNASLFPEMKLANMDKRGVTFACLNSAADGKGLSTIALKFKDASIVEDFRAAVVEHKGTTTGSLKTPENSPKA

SEQ ID NO.3

ATATATGGTCTCGTTTGCCCCTTTGCAGCAATCCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

SEQ ID NO.4

ATTATTGGTCTCGAAACGGCTGAAACCAAGGAAGGCACAAACTACACTGTTAGATTCSEQ ID NO.5

AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

SEQ ID NO.6

GCAGGCATGCAAGCTTATTGG

SEQ ID NO.7

GACAATCCTG GTCTCGATGATGAT

SEQ ID NO.8

CCCAGTCCCT GAAAATCCTG TG

SEQ ID NO.9

ACCGTTCCAGAGTTGACTCAA

SEQ ID NO.10

GCAAGAAAGCCTTTCTTCTGA