低分子量肝素获取程序以及由此获得的低分子量肝素

摘要

本发明涉及一种获得具有高稳定性低分子量肝素的程序。该程序包括用H

说明书

发明领域

本发明设计一种低分子量肝素(LMWH)的制备程序，以及通过该程序获得的低分子量肝素。

发明背景

肝素是糖胺聚糖家族的一种多糖，由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸)和D-葡萄糖胺交替结合而成。L-艾杜糖醛酸可以被2-O-硫酸化，而D-葡萄糖醛酸可以被N-硫酸化和/或6-O-硫酸化，并在较小程度上被N-乙酰化或3-O-硫酸化。肝素优选用作钠盐，也可以用作其他碱金属或碱土金属的盐，它主要用作抗血栓和抗凝药物。

肝素可以根据其分子量，分类为普通肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)和极低分子量肝素(VLMWH)。低分子量肝素和极低分子量肝素来自原始普通肝素分子的解聚。

在现有技术中已经有了用于制备LMWH的各种方法。其中之一是通过β-消除机制进行碱解聚。

第EP0040144号专利文件描述了一种通过以下阶段进程获得LMWH的方法：苄索肝素钠中肝素盐的转化、苄索肝素钠与苄基氯的酯化反应、肝素苄酯钠盐的纯化和获得、用氢氧化钠解聚、酯皂化并纯化产物。

第EP1070503号专利文件描述了一种通过包括以下阶段获得LMWH的方法：苯扎氯铵肝素中的肝素盐的转化，在非水介质中用Triton B解聚、纯化产物。

第EP2881404号专利文件描述了一种通过以下阶段获得LMWH的方法：第一阶段转化，磷腈基或胍衍生基的解聚和最后阶段的转化。

需要更可重复且稳定的方法来获得LMWH，尤其是具有更高稳定性的LMWH。

发明说明

本发明的发明人发现了一种制备具有优异稳定性的低分子量肝素(LMWH)的方法，同时保持了其良好的抗-FXa和抗-Flla活性。这种制备LMWH的方法包括使用H

首先，本发明涉及一种获得平均分子量分布在3至3.8kDa之间的低分子量肝素(LMWH)的方法，包括以下步骤：

a)制备肝素钠溶液；

b)向步骤(a)的溶液中加入苯扎氯铵，得到苯扎氯铵肝素。

c)将步骤(b)中得到的苯扎氯铵肝素溶解在Cl

d)对步骤c)中获得的解聚肝素至少进行两次H

本发明的第二方面涉及可通过本发明的程序获得的低分子量肝素。

已发现获得的LMWH含有1至15％的1，6-无水残基。因此，本发明的第三方面涉及平均分子量在3至3.8千道尔顿之间的低分子量肝素，在其寡糖链的还原末端1，6-无水残基含量为1至15％。

针对一个方面描述的定义和实施例同样适用于本发明的其他方面。

在本发明中，“低分子量肝素”或“LMWH”应理解为欧洲药典第9版，肝素，低分子质量专论，第0828页定义中提出的作为从肝素获得的、平均分子量小于8,000道尔顿并且其总质量的至少60％的分子量小于8,000道尔顿的多糖混合物。本发明的LMWH的平均分子量通过《欧洲药典》(第9版)中的程序来确定。(《欧洲药典》第9版)。

在本发明中，“1，6-无水残基”应理解为解聚过程中在LMWH末端位置产生的各种化学基团。这些基团的非限制性实例是2-磺基氨基-1，6-脱水-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(1，6-脱水葡萄糖胺)和2-磺基氨基-1，6-脱水-2-脱氧-β-D-甘露聚糖(1，6-脱水甘露糖胺)。LMWH中这些残基的量表示为这些类型的残基在其还原末端中存在的寡糖链的百分比。

为了测定通过本发明方法获得的产物的1，6-无水末端含量，应遵循欧洲药典第9版，第1097页，依诺肝素钠专论，识别，B段中所述的方法。在这种方法中，彻底解聚分子用肝素酶I、II和III的混合物，分离并定量由强阴离子交换色谱法(SAX-HPLC)产生的残留物。1，6-无水含量根据下式确定：

％1，6-anhidro＝Mw·(A

其中

-Mw，平均分子量

-Mw

-A

-A

-A

-A

LMWH中1，6-脱水葡萄糖胺残基和1，6-脱水甘露糖胺残基的比例可以通过核磁共振(NMR)来确定，例如

本发明的LMWH的抗FXa和抗Flla活性通过《欧洲药典》(第9版，专题文章0828)中的显色方法来确定，(《欧洲药典》第9版，专题文章0828)并以国际单位每毫克表示。

LMWH的颜色等级可以根据《欧洲药典》第2.2.2章中的方法二确定。

术语“环境温度”是指20至25℃之间的温度。

本文中所用的术语“大约”是指给定值的±10％。

本发明的LMWH的平均分子量(Mw)为3至3.8千道尔顿，优选在3至3.6千道尔顿之间。

在一个实施例中，本发明的LMWH在其寡糖链的还原末端具有1至15％的1，6-无水残基含量；优选在2至13％之间，更优选在4至11％之间。

在本发明的LMWH中1，6-脱水葡萄糖胺残基的摩尔比优选大于或等于1，6-脱水葡萄糖胺残基的摩尔比。在一个特定实施例中，LMWH中1.6-脱水葡糖胺残基：1.6-脱水甘露糖胺残基的摩尔比为1∶1至3∶1，优选1∶1至2.5∶1或1.05∶1至2.5∶1。

在本发明的一个特定实施例中，LMWH的平均分子量为3至3.8千道尔顿，其寡糖链还原末端的1，6-无水残基含量为1至15％，1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于或等于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例，优选为1∶1至3∶1。

本专利所述获得的肝素优选抗FXa活性在80-120IU/mg之间，抗Flla活性在5-20IU/mg之间。在本发明的一个特定实施例中，所获得的肝素抗FXa活性在95-120IU/mg之间，抗Flla活性在10-20IU/mg之间。

在本发明的一个特定实施例中，LMWH的平均分子量为3至3.8千道尔顿，其寡糖链还原末端的1，6-无水残基含量为1至15％，1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于或等于1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例，优选在1∶1至3∶1之间，抗FXa活性在80-120IU/mg之间，且抗Flla活性在5-20IU/mg之间。

在至少24个月内，本发明的LMWH的颜色等级优选大于或等于《欧洲药典》第2.2.2章(方法二)规定的溶液颜色参考范围中的第6级，最好在室温下和60％的相对湿度下保持至少24个月，优选至少36个月。可以按照《欧洲药典》(第2.2.2章；方法二)中所述的方法对此进行确定，也可以使用比色计自动进行。

已经发现本发明的LMWH具有很高的稳定性。具体而言，已观察到它们至少可以稳定24个月，甚至在室温下和60％的相对湿度下至少稳定36个月。

首先，本发明涉及一种获得平均分子量分布在3至3.8kDa之间的低分子量肝素(LMWH)的方法，包括以下步骤：

a)制备肝素钠溶液；

b)向步骤(a)的溶液中加入苯扎氯铵，得到苯扎氯铵肝素。

c)将步骤(b)中获得的苯扎氯铵肝素溶解在CH

d)对步骤c)中获得的解聚肝素至少进行两次H

分子量肝素的特定和优选实施例与本文先前所定义的相同。

在一个特定实施例中，步骤a)的肝素钠水溶液是由从猪肠粘膜获得的肝素制备的。

步骤c)中Triton B的添加可以通过一次添加或多次连续添加来完成，例如通过1、2、3或4次连续添加来Troton B的完成。

在一个特定的实施例中，步骤c)中的Triton B的添加最多进行三次连续的添加，即1、2或3次，每次Triton B添加的Triton B：苯扎氯铵肝素的重量比为0.2∶1至0.3∶1。步骤c)中Triton B的添加优选通过Triton B的三次连续添加来完成，并且优选每次以TritonB：苯扎氯铵肝素的重量比为0.2∶1至0.3∶1来添加Triton B。

在本发明的一个实施例中，步骤c)中Triton B的添加通过三次连续的Triton B添加完成，因此，第一次添加后，反应保持6-10小时，再进行第二次添加，第二次添加后，反应保持12-20小时，再进行第三次添加，第三次添加后，反应保持6-10小时。在另一个实施例中，在第一次添加之后，反应保持7-9小时，再进行第二次添加，第二次添加后，反应保持14-18小时，再进行第三次添加，第三次添加后，反应保持7-9小时。在另一个实施例中，第一次、第二次和第三次添加后的反应时间分别为约8、约16和约8小时。

在一个实施例中，步骤c)中的温度为25至35℃，优选27至32℃。

在一个优选实施例中，步骤d)中的H

步骤d)中每次H

在另一个实施例中，步骤d)包括三次H

步骤d)优选在20至50℃之间进行，最好是在25至45℃之间的温度下进行。

每次H

在一个优选实施例中，步骤d)在pH值为10.5至11.5之间的条件下进行。另外，本发明的方法可以在步骤d)中每次H

在步骤d)中第一次H

在一个优选实施例中，由发明程序获得的LMWH通过甲醇沉淀来纯化。

获得的LMWH可以进行冻干处理。

附图简要说明：

图1.通过本发明的程序获得的LMWH的

图2.通过本发明的程序获得的LMWH的

示例

提供以下具体示例用于说明本发明的性质。这些示例仅出于说明目的，不应解释为对本文所述发明的限制。

示例1

将10克肝素钠溶解在纯净水中，边搅拌边加入50％(w/v)的苯扎氯铵溶液，形成肝素苯扎氯铵。将形成的产物用水洗涤几次以除去过量的氯化物，最后通过冻干干燥生成产物。

将苯扎肝素肝素盐溶解在二氯甲烷中，并将温度调节至30℃±5℃。加入40％的氢氧化苄基三甲基铵(Triton B)，并使其在上述温度下反应。再重复添加两次。

向解聚产物的水溶液中加入浓度为33％(w/v)的H

将上述粗制的低分子量肝素溶解在水中，并用甲醇沉淀。将沉淀物溶解在纯净水中，并用浓度为33％(w/v)的H

将沉淀物再次溶于纯净水中，加入33％w/v的过氧化氢，并使其在40℃±2℃的条件下再次发生反应。反应结束后，用甲醇将溶液中并产生沉淀。

将纯化的产物溶于水中并进行冻干，得到6.00克平均分子量为3241道尔顿的低分子量肝素，其抗FXa活性为118IU/mg，抗Flla活性为13.7IU/mg，并在其寡糖链的还原末端出现了1至15％的1，6-无水残基，与其他低分子量肝素不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于或等于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例。

此外，这种低分子量肝素还具有在室温下稳定24-36个月的优势，根据药典中确定的参考色度范围，使用

颜色的程度是直接关系到产品稳定性的参数，可以由此确定最终包装的产品可稳定地在室温下保存24到36个月。

示例2

使用10克肝素钠，重复示例1所示的步骤，获得6.01g低分子量肝素，平均分子量3259道尔顿，抗FXa活性为103IU/mg，抗Flla活性为15.2IU/mg。该低分子量肝素具有在其寡糖链的还原末端具有1至15％的1，6-无水残基的特征，与其他低分子量肝素不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例高于1，6脱水甘露糖胺残基。

此外，这种低分子量肝素还具有在室温下稳定24-36个月的优势，根据药典中确定的参考色度范围，使用

颜色的程度是直接关系到产品稳定性的参数，可以由此确定最终包装的产品可稳定地在室温下保存24到36个月。

示例3

将10克肝素钠溶解在纯净水中，边搅拌边加入50％(w/v)的苯扎氯铵溶液，形成肝素苯扎氯铵。将形成的产物用水洗涤几次以除去过量的氯化物，最后通过冻干干燥生成产物。

将苯扎肝素肝素盐溶解在二氯甲烷中，并将温度调节至30±5℃。加入40％的氢氧化苄基三甲基铵(Triton B)，并使其在上述温度下反应。再重复添加两次。

向解聚产物的水溶液中加入浓度为33％(w/v)的H

将上述粗制的低分子量肝素溶解在水中，并用甲醇沉淀。将沉淀物溶解在纯净水中，并在40±2℃的温度下用浓度为33％(w/v)的H

将纯化的产物溶于水中并进行冻干，得到5.21克平均分子量为3269道尔顿的低分子量肝素，其抗FXa活性为119IU/mg，抗Flla活性为13.7IU/mg，并在其寡糖链的还原末端出现了1至15％的1，6-无水残基，与其他低分子量肝素不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于或等于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例。

此外，这种低分子量肝素还具有在室温下稳定24-36个月的优势，根据药典中确定的参考色度范围，使用

颜色的程度是直接关系到产品稳定性的参数，可以由此确定最终包装的产品可稳定地在室温下保存24到36个月。

示例4

使用10克肝素钠重复实施例1所示的步骤，得到6.25克平均分子量为3172道尔顿的低分子量肝素，其抗FXa活性为108IU/mg，抗Flla活性为13.1IU/mg，并在其寡糖链的还原末端出现了1至15％的1，6-无水残基，与其他低分子量肝素(如依诺肝素)不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于或等于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例。

此外，这种低分子量肝素还具有在室温下稳定24-36个月的优势，根据药典中确定的参考色度范围，使用

颜色的程度是直接关系到产品稳定性的参数，可以由此确定最终包装的产品可稳定地在室温下保存24到36个月。

示例5

使用10克肝素钠重复实施例1所示的步骤，得到6.34克平均分子量为3347道尔顿的低分子量肝素，其抗FXa活性为110IU/mg，抗Flla活性为14.7IU/mg，并在其寡糖链的还原末端出现了1至15％的1，6-无水残基，与其他低分子量肝素(如依诺肝素)不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于或等于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例。

此外，这种低分子量肝素还具有在室温下稳定24-36个月的优势，根据药典中确定的参考色度范围，使用

示例6

使用10克肝素钠重复实施例1所示的步骤，得到7.11克平均分子量为3400道尔顿的低分子量肝素，其抗FXa活性为119IU/mg，抗Flla活性为15.0IU/mg，并在其寡糖链的还原末端出现了1至15％的1，6-无水残基，与其他低分子量肝素(如依诺肝素)不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例。

此外，这种低分子量肝素还具有在室温下稳定24-36个月的优势，根据药典中确定的参考色度范围，使用

示例7

使用10克肝素钠重复实施例1所示的步骤，得到6.92克平均分子量为3328道尔顿的低分子量肝素，其抗FXa活性为117IU/mg，抗Flla活性为14.9IU/mg，并在其寡糖链的还原末端出现了1至15％的1，6-无水残基，与其他低分子量肝素(如依诺肝素)不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于或等于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例。

此外，这种低分子量肝素还具有在室温下稳定24-36个月的优势，根据药典中确定的参考色度范围，使用

示例8

使用10克肝素钠重复实施例3所示的步骤，得到7.04克平均分子量为3331道尔顿的低分子量肝素，其抗FXa活性为113IU/mg，抗Flla活性为15.3IU/mg，并在其寡糖链的还原末端出现了1至15％的1，6-无水残基，与其他低分子量肝素(如依诺肝素)不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于或等于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例。

此外，这种低分子量肝素还具有在室温下稳定24-36个月的优势，根据药典中确定的参考色度范围，使用

示例9

使用10克肝素钠重复实施例3所示的步骤，得到7.09克平均分子量为3366道尔顿的低分子量肝素，其抗FXa活性为115IU/mg，抗Flla活性为16.0IU/mg，并在其寡糖链的还原末端出现了1至15％的1，6-无水残基，与其他低分子量肝素(如依诺肝素)不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例大于或等于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例。

此外，这种低分子量肝素还具有在室温下稳定24-36个月的优势，根据药典中确定的参考色度范围，使用

比较例10(未经H

将10克肝素钠溶解在纯净水中，边搅拌边加入50％(w/v)的苯扎氯铵溶液，形成肝素苯扎氯铵。将形成的产物用水洗涤几次以除去过量的氯化物，最后通过冻干干燥生成产物。

将苯扎肝素肝素盐溶解在二氯甲烷中，并将温度调节至30℃±5℃。加入40％的氢氧化苄基三甲基铵(Triton B)，并使其在上述温度下反应。再重复添加两次。

沉淀在醋酸钠的甲醇溶液中，通过离心分离粗制的低分子量肝素。

将上述粗制的低分子量肝素溶解在水中，并用甲醇沉淀。将沉淀物溶解在40±2℃、pH值为11的纯净水中。5小时后，用甲醇将溶液中和并产生沉淀。

将纯化的产物溶于水并冻干，得到5.28g低分子量肝素，平均分子量为3280道尔顿，抗FXa活性为112IU/mg，抗Flla活性为13.70IU/mg，在其寡糖链的还原末端呈现出18.5％的1.6-无水残基。

此外，分析了1，6-脱水葡萄糖胺残基与1，6脱水甘露糖胺残基的比例，与前面的示例不同，1，6-脱水甘露糖胺残基大于1，6-脱水葡萄糖胺残基。

还分析了与样品颜色相关的稳定性程度，观察到在室温下从第十个月开始，它就会呈现出

颜色的程度是直接关系到产品稳定性的参数，可以由此确定最终包装的产品不能稳定地在室温下保存9个月以上，因此，这似乎是由添加的H

比较例11(在60℃下解聚)

将10克肝素钠溶解在纯净水中，边搅拌边加入50％(w/v)的苯扎氯铵溶液，形成肝素苯扎氯铵。将形成的产物用水洗涤几次以除去过量的氯化物，最后通过冻干干燥生成产物。

将苯扎肝素肝素盐溶解在二氯甲烷中，并将温度调节至60±5℃。加入40％的氢氧化苄基三甲基铵(Triton B)，并使其在上述温度下反应。再重复添加两次。

在解聚产物的水溶液中添加浓度为33％(w/v)的过氧化氢，具体而言，是以0.1±10％升H

将上述粗制的低分子量肝素溶解在水中，并用甲醇沉淀。将沉淀物溶解在纯净水中并用浓度为33％(w/v)的过氧化氢处理，具体而言，是在40±2℃下，以0.08±10％升H

将纯化的产物溶于水中并进行冻干，得到5.10克平均分子量为2341道尔顿的低分子量肝素，其抗FXa活性为109IU/mg，抗Flla活性为2.8IU/mg，并在其寡糖链的还原末端出现了21％的1，6-无水残基，与其他低分子量肝素不同的是，其中1，6-脱水葡萄糖胺残基的比例远小于1，6-脱水甘露糖胺残基的比例。

还分析了与样品颜色相关的稳定性程度，观察到在室温下从第十个月开始，它就会呈现出

颜色的程度是直接关系到产品稳定性的参数，可以由此确定最终包装的产品不能稳定地在室温下保存10至11个月以上，需要利用冷链使产品的稳定性超过12个月。

示例12

根据欧洲药典第9版，第1097页，依诺肝素钠专论，识别，B段中所述的方法，对示例1至11中获得产物进行分析，以确定1，6-无水残留物含量，所得结果如下：

示例13

示例1中获得的产物通过核磁共振进行分析，具体通过

具体地说，对应于1，6-无水残基的信号出现在5.57和5.62ppm，分别对应于1，6-无水甘露糖胺和1，6-无水葡糖胺的结构的异体质子，正如文献所述。

对于这类化合物的结构特征而言，另一个特别重要的二维实验是

通过这种二维技术实现的光谱色散增加允许在相应一维光谱中量化重叠的信号整体。与1，6-无水残基对应的信号出现在5.57-103.9和5.61-104.3ppm，分别对应于1，6-无水甘露糖胺和1，6-无水葡萄糖胺结构的异体质子，正如文献中所述，也可以在示例1中获得的产品样本的图1和2中观察到。

示例14

根据用于