线粒体自噬激活剂在血小板保存中的应用

摘要

本发明公开了线粒体自噬激活剂在血小板保存中的应用，可用于提高保存血小板的功能，以及用于制备血小板保存添加剂。本发明通过实验，验证了线粒体自噬激活剂可有效降低血小板在保存过程中的线粒体损伤，提高保存血小板功能，并且国内外尚无利用自噬激活剂有效提高保存血小板功能的先例，进而有望将线粒体自噬激活剂应用在血小板的保存中，也有望用于制备血小板保存添加剂，从而改善血小板保存质量。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及线粒体自噬激活剂的一种新应用，具体涉及线粒体自噬激活剂在血小板保存中的应用。

背景技术

血小板是血液中含量最多、体积最小的胞质结构，具有特定的形态和生化组成。人的血小板生理寿命约7-9天，其在止血、伤口修复、炎症反应等生理和病理过程发挥重要作用。临床上成分输注的血小板基本来源于各地血站采集、保存的血小板。除了低血小板症病人外，随着我国人口的老龄化加剧，癌症放疗患者持续增加、大手术病例的增加，我国对血小板异体输注的需求越来越大，导致我国临床血小板输注供不应求的矛盾越来越突出。

国际上常规血小板储存条件是22±2℃震荡保存不超过5天。常温保存的血小板，维持正常功能的有效寿命较短，易发生凋亡而导致输注低效甚至无效；4℃低温保存虽能减少微生物污染，但低温诱导血小板膜表面糖蛋白GPIbα聚集，引起血小板凋亡，使低温保存的血小板回输后在血液循环中被更快清除。Tamam等研究报道凋亡途径激活是导致保存过程中血小板发生功能受损的主要原因，血小板聚集能力与凋亡密切相关。但是，多年来研究显示，抑制血小板凋亡途径，尽管可以改善血小板细胞活力，但不能改善保存血小板的功能受损问题。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明提供一种线粒体自噬激活剂在血小板保存中的应用，以改善血小板保存质量。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种线粒体自噬激活剂CCCP（Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone）在血小板保存中的应用。

进一步的，所述线粒体自噬激活剂可用于提高保存血小板的功能，改善血小板的保存质量。

本发明还提供了一种线粒体自噬激活剂在制备血小板保存添加剂中的应用。

本发明通过以下方法来验证线粒体自噬激活剂提高保存血小板功能的效果：

1）单采血小板获取；

单采血小板获取前，需采集献血者一定量的静脉血进行血型、血色素、乙肝、谷丙转氨酶、血小板计数、血液粘稠度、血脂含量、红细胞含量检验，合格后方可进行采集；

采集时，从献血者一只手臂进针，血液在完全密封、一次性无菌耗材内，经过血液分离机，利用物理离心的原理，分离出血小板成分后，将其它血液成分还输给献血者，从而获得单采血小板。

2）线粒体自噬激活剂（CCCP）处理保存血小板；

将单采血小板在22±2℃震荡保存8天，于保存第6天和第8天分别使用无菌注射器吸取2份一定量的单采血小板，分为溶剂对照组（Ctrl）和线粒体自噬激活剂组（CCCP），采用对照溶剂对溶剂对照组（Ctrl）的单采血小板进行处理，采用线粒体自噬激活剂对线粒体自噬激活剂组（CCCP）的单采血小板进行处理，经室温处理一定时间，方可进行后续操作。

3）制备洗涤血小板；

将处理好的单采血小板转移至离心管，在设定参数下离心一定时间，沉淀的血小板重悬于一定体积的Tyrode缓冲液中，并维持一定浓度。

4）流式细胞术检测△Ψm去极化；

取一定量制备好的Ctrl组和CCCP组洗涤血小板，分别加入JC-1，轻轻吹匀后放置相应温度下避光孵育一定时间，随后补充一定量的 Tyrode缓冲液，转移至流式管中，进行流式细胞仪分析；流式细胞仪分析结果显示CCCP组血小板线粒体跨膜电位去极化较Ctrl组更低，说明CCCP处理有效降低储存血小板线粒体损伤。

5）聚集检测仪检测血小板聚集能力；

取一定量制备好的Ctrl组和CCCP组洗涤血小板，与磁珠一起加入比色杯中，随后向洗涤血小板中加入一定量的 CaCl

本发明的有益效果为：

本发明通过实验，验证了线粒体自噬激活剂可有效降低血小板在保存过程中的线粒体损伤，提高保存血小板功能，并且国内外尚无利用自噬激活剂效提高保存血小板功能的先例，进而有望将线粒体自噬激活剂应用在血小板的保存中，也有望用于制备血小板保存添加剂，从而改善血小板保存质量。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1a表示本发明验证方法的血小板JC-1检测流式细胞散点图；

图1b表示本发明验证方法的血小板线粒体跨膜电位去极化统计分析图；

图2a表示本发明验证方法的血小板聚集能力检测反应曲线图；

图2b表示本发明验证方法的血小板聚集能力统计分析图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明提供了一种线粒体自噬激活剂CCCP（Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone）在血小板保存中的应用。

进一步的，所述线粒体自噬激活剂可用于提高保存血小板的功能，改善血小板的保存质量。

本发明还提供了一种线粒体自噬激活剂在制备血小板保存添加剂中的应用。

本发明通过以下方法来验证线粒体自噬激活剂提高保存血小板功能的效果：

1）单采血小板获取；

单采血小板获取前需采取静脉血2-3 mL进行血型、血色素、乙肝、谷丙转氨酶、血小板计数、血液粘稠度、血脂含量、红细胞含量检验，合格后方可进行采集；从献血者一只手臂进针，血液在完全密封、一次性无菌耗材内，经过血液分离机，利用物理离心的原理，分离出血小板成分后，将其它血液成分还输给献血者，从而获得单采血小板。

2）线粒体自噬激活剂（CCCP）处理保存血小板；

将单采血小板在22±2℃震荡保存8天，于保存第6天（S-D6）和第8天（S-D8）使用无菌注射器吸取2份1 mL单采血小板，分为溶剂对照组（Ctrl）和线粒体自噬激活剂组（CCCP），采用对照溶剂对溶剂对照组（Ctrl）的单采血小板进行处理，采用线粒体自噬激活剂对线粒体自噬激活剂组（CCCP）的单采血小板进行处理，经室温处理2 h，进行后续操作。

3）制备洗涤血小板；

将处理好的单采血小板转移至离心管，在200 g（1400 rpm）下离心20 min，沉淀的血小板重悬于一定体积的Tyrode缓冲液（2.5mmol/L HEPES，150mmol/L氯化钠，2.5mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，1mmol/L氯化钙，1mmol/氯化镁，pH 7.4）中，维持浓度为3×10

4）流式细胞术检测△Ψm去极化；

取制备好的Ctrl组和CCCP组洗涤血小板（50μL），分别加入JC-1(2μg/mL)，轻轻吹匀后放置37℃避光孵育20min，随后补充150μL Tyrode缓冲液，转移至流式管中，进行流式细胞仪分析；

参见图1a-1b所示，流式细胞仪分析结果显示，CCCP组血小板线粒体跨膜电位去极化较Ctrl组更低，说明CCCP处理有效降低了储存血小板线粒体损伤。

5）聚集检测仪检测血小板聚集能力；

取制备好的Ctrl组和CCCP组洗涤血小板（250μL），与磁珠一起加入比色杯中，随后向洗涤血小板中加入2.5μL CaCl

从上述测试结果可以得出，线粒体自噬激活剂（CCCP）可有效降低血小板在保存过程中的线粒体损伤，提高保存血小板功能，并且国内外尚无利用自噬激活剂效提高保存血小板功能的先例，进而有望用于制备血小板保存添加剂，以改善血小板保存质量。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。