法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-06-24
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种灵芝孢子油在制备减轻紫杉醇NK细胞毒性的药物中的应用。
背景技术
灵芝是担子菌纲多孔菌科(Polyproraceae)灵芝属(Ganoderma)真菌的总称，灵芝之名见于《本草原始》，作为芝类药物始载于《神农本草经》，列为上品。明代著名医药学家李时珍的《本草纲目》，对灵芝的功效有详细的极为肯定的记载。灵芝是祖国中医药宝库中的珍品，素有"仙草"之誉。古今药理与临床研究均证明，灵芝确有防病治病、扶正固本、延年益寿之功效，用于许多慢性病的治疗，如癌症、肝炎、II型糖尿病、高血压等。
灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质。将灵芝孢子破壁粉碎获得的灵芝孢子粉的化学成分较为复杂，含有多糖类、三萜类、核苷类、维生素类、甾醇类、生物碱、无机微量元素等。灵芝孢子粉有抗肿瘤、增强免疫调节、降血糖、降血脂、抗炎、抗缺氧能力、清除自由基等作用。常采用水提取法制备提取物，所得提取物为水溶性的多糖成分。
癌症是当今世界上大多数国家的主要死因之一,为仅次于心血管病的人类第二杀手。肺癌是我国及世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，早期肺癌多无明显症状，临床上多数患者出现症状就诊时已属晚期，导致晚期肺癌整体5年生存率不高。
自然杀伤(natural killer，NK)细胞作为机体固有免疫的重要成员，是抗肿瘤免疫的先行者，是抗肿瘤的第一道防线，在肿瘤免疫方面发挥着至关重要的作用。NK细胞可以识别肿瘤细胞，并通过直接杀伤作用阻止肿瘤细胞的发生和转移，因此对肿瘤形成和发展具有重要免疫监控作用。同时，NK细胞分泌的细胞因子可以调节机体适应性免疫，进一步增强免疫系统清除肿瘤细胞的作用。NK细胞还会产生一系列细胞因子和趋化因子来调节免疫反应。例如激活的NK细胞分泌的IFN-γ可诱导CD8+T细胞成为成熟的细胞毒T淋巴细胞(CTL)，使机体免疫系统更高效地杀伤肿瘤细胞；通过释放CCL5、XCL1和XCL2，NK细胞能促进树突状细胞(dendritic cells，DCs)向实体瘤聚集，促进CD8+T细胞抗肿瘤免疫作用，延长病人的生存期。由此可见，NK细胞不仅自身发挥抗肿瘤作用，同时还可以联系固有免疫系统和适应性免疫系统，在抗肿瘤过程中起着重要作用。
肿瘤微环境中NK细胞的数量及其功能与患者的总生存率、无进展生存率以及复发风险等相关；在肺癌的免疫微环境中，NK细胞在人类和小鼠肺癌中的定位相似，增加NK细胞数量以及上调NK细胞功能是基于NK细胞的肺癌免疫治疗的关键。
肿瘤的治疗中，常用化疗、放疗和手术治疗三种方法，现在生物疗法(主要是免疫增强法，如免疫检查点抑制剂)渐露头角，但是化疗在肿瘤治疗中仍发挥着重要作用。在肿瘤的防治中，人们已经意识到恶性肿瘤的治疗不能单纯追求对肿瘤的杀伤率，接受了和肿瘤共存、且必须关注患者生活质量的改善和生存时间的延长，才能更科学地评估治疗恶性肿瘤的实际疗效。
肿瘤化疗中，根据不同的肿瘤有不同的化疗方案(药物)，如非小细胞肺癌一线化疗药可选紫杉醇，结直肠癌一线化疗药选用铂类药物；显而易见，不同的化疗方案(药物)对不同的肿瘤，其效果是不同的，不可臆推。
紫杉醇是肺癌治疗的一线化疗药物，其不良反应主要包括骨髓抑制、神经毒性、心脏毒性和过敏反应。此外，紫杉醇还有一定的免疫抑制作用，会抑制NK-92MI细胞增殖并且降低其杀伤活性。对中晚期非小细胞肺癌患者，采用顺铂联合紫杉醇化疗，NK细胞化疗后比化疗前有下降。即紫杉醇还有降低患者自体免疫的副作用，从而制约了自体免疫NK细胞的抗癌效果，严重时还可能导致癌扩散的发生！
如何更好的发挥紫杉醇的疗效、减少其不良反应、延长生存期，是临床上应用紫杉醇类化疗药物治疗肺癌受到关注和需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种灵芝孢子油在制备减轻紫杉醇NK细胞毒性的药物中的新用途。针对NK细胞的重要性结合临床需求，在Lewis荷瘤小鼠模型上，发现使用紫杉醇会产生降低动物NK细胞比例、抑制NK细胞活性等副作用；而当灵芝孢子油与紫杉醇联用，具有提高NK细胞比例和活性，从而减轻了紫杉醇NK细胞毒性，增加紫杉醇的抗肿瘤疗效，缓解紫杉醇所致的骨髓及免疫功能抑制，延长动物生存期的新性能，进而提供一种灵芝孢子油作为药物的新用途，即灵芝孢子油提高NK细胞比例和活性以减轻紫杉醇NK细胞毒性，辅助紫杉醇治疗肺癌。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种灵芝孢子油在制药中的应用，用于减轻紫杉醇对NK细胞的毒副作用。
在研究中意外发现，将灵芝孢子粉经超临界二氧化碳萃取所得的灵芝孢子油，具有减轻紫杉醇对NK细胞的毒副作用的功效。
优选的，用于提高紫杉醇治疗癌症时机体的NK细胞比例和活性。
优选的，用于提高紫杉醇治疗癌症时机体的生存期。
Lewis荷瘤小鼠模型的实验上意外发现，使用紫杉醇进行治疗时，与灵芝孢子油联用能有效地提高NK细胞比例和活性，减轻紫杉醇NK细胞毒性，增加紫杉醇的抗肿瘤疗效，缓解紫杉醇所致的骨髓及免疫功能抑制，延长机体的生存期。
优选的，所述癌症包括肺癌。
优选的，所述紫杉醇包括紫杉醇注射液、注射用白蛋白结合型紫杉醇、注射用紫杉醇脂质体中的一种或多种。
优选的，所述灵芝孢子油含有麦角甾醇、三萜、甘油三酯。
优选的，所述灵芝孢子油中，甘油三酯质量含量＞70％，三萜质量含量为25％～40％，麦角甾醇质量含量为0.1％～0.5％，水分含量＜0.25％。
一种如上所述灵芝孢子油的制备方法，包括：取破壁灵芝孢子粉，经超临界二氧化碳萃取精制，获得所述灵芝孢子油。
优选的，所述破壁灵芝孢子粉的破壁率＞95％。
优选的，所述萃取精制经过二级分离，仅保留第一级分离样品，即获得所述灵芝孢子油。
优选的，所述萃取精制的条件包括：萃取压力为25～35MPa，萃取温度为40～45℃，萃取时间为1～2h，CO
本发明仅保留一级分离得到的样品，即得所述灵芝孢子油。通过分离精制，除去大量杂质和水分，获得的所述灵芝孢子油清澈透亮，组分含量稳定。实验发现二级分离后的样品含有较多杂质，外观浑浊，水分含量高(约含10％)，易变质，实际无法确定是否同样具备减轻紫杉醇对NK细胞的毒副作用的效果，因此不予保留。
超临界二氧化碳萃取是特别适用于脂溶性、高沸点、热敏性物质提取的新型绿色提取分离技术。灵芝孢子油是灵芝孢子经破壁、超临界二氧化碳萃取所得的脂溶性活性物质，含甾醇、三萜、甘油三酯等成分。为获得质量稳定的目标灵芝孢子油，本发明通过分离精制，除去大量杂质和水分，获得的所述灵芝孢子油清澈透亮，杂质少、组分含量稳定，确保了灵芝孢子油物质基础的稳定，显然效果也得到了保障。
与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
本发明在Lewis荷瘤小鼠模型上进行实验与研究，发现紫杉醇造成降低动物NK细胞比例、抑制NK细胞活性的毒性作用。而灵芝孢子油与紫杉醇联用时，具有显著提高NK细胞比例和活性以减轻紫杉醇NK细胞毒性，增加紫杉醇的抗肿瘤疗效，缓解紫杉醇抑制小鼠胸腺指数、骨髓有核细胞以及脾脏淋巴细胞的数量及功能的作用，延长动物生存期，显著提升紫杉醇化疗的中位生存时间的作用。本发明的灵芝孢子油具有提高NK细胞比例和活性以减轻紫杉醇NK细胞毒性，辅助紫杉醇治疗肺癌的有益效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明作进一步地详细描述，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
灵芝孢子油的制备
本发明的灵芝孢子油制备方法如下：
取500g灵芝孢子粉进行破壁，破壁率＞95％，然后用超临界CO
实施例2
灵芝孢子油对NK细胞比例和活性、紫杉醇疗效及Lewis荷瘤小鼠骨髓有核细胞、其它免疫功能的影响
1、实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，实验时体质量18±4g(5-6周龄)，购于有资质的广东斯嘉景达生物科技有限公司(SCXK(粤)2020-0052)。实验期间饲养室温度控制在20～26℃，湿度40～70％，换气次数15次/h，每天照明时间12h(早8：00到晚8：00开灯)；饲喂全价颗粒饲料；饮水种类为生活饮用水。0.5％过氧乙酸消毒地面。
2、供试品及实验材料
灵芝孢子油，给药前用玉米油配成相应浓度的溶液，现配现用。紫杉醇注射液(PTX)。
细胞株：Lewis肺癌细胞。
3、实验方法
3.1建立荷瘤小鼠动物模型
复苏、培养Lewis肺癌细胞，取最佳生长状态的细胞，将细胞浓度调整至1×10
G1：溶剂对照组：玉米油,PO,QD+NS,IP,BIW
G2：紫杉醇单用组：玉米油,PO,QD+PTX,20mg/kg,IP,BIW
G3：灵芝孢子油(高剂量)联用组：灵芝孢子油(3.4ml/Kg),PO,QD+PTX,20mg/kg,IP,BIW
G4:灵芝孢子油(中剂量)联用组：灵芝孢子油(1.7ml/Kg),PO,QD+PTX,20mg/kg,IP,BIW
G5:灵芝孢子油(低剂量)联用组：灵芝孢子油(0.34ml/Kg),PO,QD+PTX,20mg/kg,IP,BIW
分组后，每组小鼠每天称重给药并观察小鼠健康状况。
3.2流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞NK细胞(CD45+CD3-NK1.1+)
处死小鼠后，无菌剖腹取出脾脏并研磨，经200目滤网过滤后，移至离心管中。1500rpm离心5min后，弃上清，加入1mL红细胞裂解液，室温静置2min，加入9mL生理盐水终止裂解；经1500rpm离心5min后，弃上清，用PBS将细胞浓度调整为0.5×108个/ml至1.0×108个/ml。
配制含0.5％胎牛血清的PBS溶液，将相应抗体按照比例和100ul细胞悬液加入至1ml的含0.5％胎牛血清的PBS中，4℃避光孵育30min；1500rpm离心5min后，弃上清，用PBS洗涤一遍，1500rpm离心5min后，弃上清，每管加入400μL含0.5％胎牛血清的PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。用流式细胞仪检测脾脏中NK细胞(CD45+CD3-NK1.1+)、Th细胞(CD45+CD3+CD4+)、Tc细胞(CD45+CD3+CD8+)、B细胞(CD45+CD3-CD19+)比例的变化。
3.3LDH法检测小鼠NK细胞杀伤活性
实验前24h传代培养靶细胞YAC－l，以含有1％小牛血清的RPMI1640培养液稀释细胞浓度至1×105/ml。将试验小鼠处死，取脾脏，研磨过滤成单细胞悬液，加入1mL红细胞裂解液，室温静置2min，加入9mL生理盐水终止裂解；经1200rpm离心5min后，弃上清，用含1％的1640培养基将细胞浓度调整为5×106/ml。实验效靶比为50:1。取YAC－1和脾细胞各50μl，加入U形96孔培养板中；自然释放孔和最大释放孔中加入细胞50μl，另加入培养液将细胞浓度稀释1倍。孵育24h后，最大释放孔中加入5ul Lysis Solution，轻摇，室温孵育15min。其后，每孔加入100ul反应混合液，轻摇混匀，避光孵育10min后，每孔加入50ul终止液，轻摇，492nm出测吸光度。
NK活性的计算:NK细胞活性％＝(反应孔OD－自然释放孔OD)/(最大释放孔OD－自然释放孔OD)×100％。
3.4测定荷瘤小鼠的抑瘤率、脾指数和胸腺指数
最后一次给药后，禁食不禁水，24h后称取各组小鼠体重，处死小鼠，解剖取瘤、脾、胸腺，称重量，计算各组抑瘤率、脾指数和胸腺指数，并进行统计学处理。抑瘤率＝(1－给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％；脾指数＝小鼠脾重量/小鼠体重；胸腺指数＝小鼠胸腺重量/小鼠体重。
3.5测定骨髓有核细胞数
完整取出小鼠一侧的股骨,剪断股骨头和胫骨端，用1ml注射器(21G针头),吸取一定体积的红细胞裂解液，冲出股骨中的全部骨髓细胞，反复冲洗，直到骨髓变白。用5ml注射器，连接1ml注射器的针头(27G针头)过滤制成单细胞悬液，需要反复大约3-4次。加入NS8ml终止，1400rpm，离心5min。弃上清，用1ml NS重悬细胞，取20ul加入计数板中计数。
3.6ConA诱导淋巴细胞转化反应实验
处死小鼠后，无菌剖腹取出脾脏并研磨，经200目滤网过滤成单细胞悬液，加入1mL红细胞裂解液，室温静置2min，加入9mL生理盐水终止裂解；经1200rpm离心5min后，弃上清，用含10％的1640培养基将细胞浓度调整为2×106个/ml。将每个样本的脾细胞悬液分两组加入96孔培养板，每孔90μL，一组加入0.05mg/mL ConA 10μL(终质量浓度为5μg/mL)为实验组，另一组加入10μL培养液作为对照。培养48h后每孔加入CCK-8继续培养1h，酶标仪450nm波长下检测各孔吸光度OD值，按下列公式计算增殖指数(PI):增殖指数＝实验组OD值/对照组OD值。
4、数据分析
统计分析：实验采用SPSS软件处理数据，所有实验结果以平均值±标准差
5、实验结果
5.1灵芝孢子油显著提高紫杉醇治疗肺癌时NK细胞比例和活性的作用
5.1.1灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠脾脏CD45+CD3-NK1.1+(NK)细胞的影响
测试不同给药组对脾脏淋巴细胞(NK细胞)比例的影响，结果如表1所示。
表1灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞(NK细胞)比例的影响
a:P＜0.05；与溶剂对照比较；
f:P＜0.05，与PTX单用组比较；
h:P＜0.05，与孢子油(高剂量)+PTX组比较。
从表1可以看出，给予紫杉醇20mg/Kg腹腔注射后，动物的NK细胞比例有轻微下降，联合灵芝孢子油可以引起NK细胞比例明显上升，与紫杉醇组相比有统计学差异，提示灵芝孢子油能够减轻紫杉醇对NK细胞的毒副作用，从而增加脾脏中NK细胞比例。
5.1.2灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠脾脏NK细胞活性的影响
采用LDH法检测NK细胞活性，测试不同给药组对脾脏NK细胞活性的影响，结果如表2所示。
表2灵芝孢子油联合紫杉醇对NK细胞活性的影响
a:P＜0.05；与溶剂对照比较；
f:P＜0.05，与PTX单用组比较；
h:P＜0.05，与孢子油(高剂量)+PTX组比较；
从表2可以发现，紫杉醇20mg/Kg腹腔注射可以抑制动物NK细胞的活性，联用灵芝孢子油组的NK细胞活性，与溶剂对照组和紫杉醇单用组相比均显著升高(P＜0.05)；提示，灵芝孢子油可以减轻紫杉醇对NK细胞的毒副作用，从而增加脾脏中NK细胞的活性。
5.2灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响
测试不同给药组对Lewis荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响，结果如表3所示。
表3灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响
a:P＜0.05；与溶剂对照比较；
f:P＜0.05，与PTX单用组比较；
从表3可以看出，在Lewis荷瘤小鼠上，灵芝孢子油可以增加紫杉醇的疗效，瘤重比单用紫杉醇组有更大幅度的下降，抑瘤率得到一定程度的提升。
5.3灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠脾脏指数、胸腺指数的影响
测试不同给药组对Lewis荷瘤小鼠脾脏指数、胸腺指数的影响，结果如表4所示。
表4灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠脏器指数的影响
a:P＜0.05；与溶剂对照比较；
f:P＜0.05，与PTX单用组比较；
从表4可以看出，紫杉醇可引起小鼠的胸腺指数显著降低，提示紫杉醇可抑制小鼠的胸腺功能；当灵芝孢子油与紫杉醇联用时，可以明显增加小鼠的胸腺指数，对抗紫杉醇引起的抑制作用。
5.4灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠骨髓有核细胞(BMN)的影响
测试不同给药组对Lewis荷瘤小鼠骨髓有核细胞(BMN)的影响，结果如表5所示。
表5灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠骨髓有核细胞数量(BMN)的影响
a:P＜0.05；与溶剂对照比较；
f:P＜0.05，与PTX单用组比较；
从表5可以看出，给予紫杉醇20mg/Kg腹腔注射后，动物的BMN显著降低；灵芝孢子油能够对抗紫杉醇引起的骨髓抑制作用。
灵芝孢子油可以增加紫杉醇的疗效。
5.5灵芝孢子油联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠淋巴细胞增殖指数(PI)的影响
检测了灵芝孢子油单药或联合紫杉醇对Lewis荷瘤小鼠淋巴细胞转化反应的影响，结果如表6所示。
表6灵芝孢子油联合紫杉醇对淋巴细胞转化反应的影响
a:P＜0.05；与溶剂对照比较；
f:P＜0.05，与PTX单用组比较；
表6表明，在0.5ug/ml的ConA共同孵育48小时后，紫杉醇20mg/Kg腹腔注射可以抑制淋巴细胞的增殖指数(PI)，灵芝孢子油均可以不同程度对抗紫杉醇的抑制作用，提示，灵芝孢子油能够对抗紫杉醇引起的抑制淋巴细胞转化的作用。
实施例3
灵芝孢子油对接受紫杉醇治疗的Lewis肺癌荷瘤小鼠生存期的影响
1、实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，实验时体质量22±4g(5-6周龄)。动物饲养于明暗交替(12h:12h)SPF级动物房中，自由进食饮水。动物在动物房中适应环境7天后开始进行实验。
2、实验材料
灵芝孢子油，给药前用玉米油配成相应浓度的溶液，现配现用。紫杉醇注射液(PTX)。
细胞株：Lewis肺癌细胞。
3、实验方法
(1)荷瘤小鼠动物模型的建立：复苏、培养Lewis肺癌细胞，取最佳生长状态的细胞，将细胞浓度调整至7.5×10
(2)实验分组
紫杉醇单用组：玉米油(5.1ml/Kg)+PTX,20mg/kg
灵芝孢子油(高剂量)联用组：灵芝孢子油(3.4ml/Kg)+PTX20 mg/kg,
灵芝孢子油(低剂量)联用组：灵芝孢子油(0.34ml/Kg)+PTX20 mg/kg
(3)灵芝孢子油对Lewis实体瘤小鼠生存时间、生命延长率的影响小鼠造模当天为第0天，从造模后第一天开始给予灵芝孢子油或玉米油灌胃，连续给药直至动物死亡。从造模后第一周开始给予腹腔注射紫杉醇或生理盐水，每周两次，直至动物死亡。统计各组小鼠存活时间，计算各组平均生存时间，按下列公式计算生命延长率：生命延长率＝(药物组平均生存时间－模型组平均生存时间)/模型组平均生存时间×100％，并进行统计学处理。
4、实验结果
单用紫杉醇治疗组的Lewis荷瘤小鼠连续灌胃给予玉米油21天，同时每周2次腹腔注射紫杉醇(PTX)，小鼠的平均生存天数为17.68±1.42d。灵芝孢子油高剂量联用紫杉醇治疗组的小鼠连续灌胃给予灵芝孢子油(3.4ml/Kg)，同时每周2次腹腔注射紫杉醇后，小鼠平均生存天数为22.05±1.49d，显著高于溶剂组(P<0.05)，生命延长率为22.89％。灵芝孢子油低剂量联用紫杉醇治疗组的小鼠连续灌胃给予临床剂量的灵芝孢子油(0.34ml/Kg)，同时每周2次腹腔注射紫杉醇后，小鼠平均生存天数为22.55±1.43d，显著常于溶剂组(P<0.05)，生命延长率为27.55％。结果提示，灵芝孢子油能够显著延长荷瘤小鼠PTX化疗生存期。
综上，本发明的灵芝孢子油对Lewis荷瘤小鼠具有显著提高NK细胞比例和活性，增加紫杉醇抗肿瘤疗效，缓解紫杉醇所致的骨髓及免疫功能抑制，延长生存期的作用。本发明的灵芝孢子油具有提高NK细胞比例和活性，从而减轻紫杉醇NK细胞毒性，辅助紫杉醇治疗肺癌的有益效果。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
