一种带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒及其提取方法

摘要

本发明公开了一种带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒及其提取方法，属于生物工程技术领域。所述的快速DNA提取试剂盒包括快速DNA提取试剂盒；所述的快速DNA提取试剂盒包括裂解结合液LB、洗涤液W1、洗涤液W2、核酸洗脱反应液EB、磁珠MB以及蛋白酶K。所述的提取方法，包括手动核酸提取方法或搭配自动化仪器实现高通量自动化DNA提取方法。可带磁珠扩增的快速DNA提取试剂，能够满足全血、血浆、拭子等多种样本类型的DNA提取，提取后产物能直接应用于荧光定量PCR扩增检测反应，不需要进行磁珠与核酸的分离，且不影响下游检测，能够更简便、更灵敏、更快速实现核酸的提取或纯化。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒及其提取方法。

背景技术

核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命必不可少的组成物质，广泛存在于动植物细胞、微生物体内，分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。当前在医学和分子生物学等各个研究领域都离不开核酸的检测。核酸检测的核心步骤之一是核酸的提取纯化，也是分子生物学研究和临床检测的基础。现有的核酸提取方法主要包括碱裂解法、酚氯仿抽提法、螯合树脂法、离心柱膜吸附法以及磁珠法等。其中，磁珠法操作更为简便，具有超顺磁性的纳米磁珠，其表面包被了氨基、羟基或羧基等亲水化学基团。采用具有分离作用的磁珠和独特的缓冲液系统，生物样本能够在特定的缓冲液盐离子浓度和pH值等条件下裂解释放出核酸。磁珠则能够在特定的缓冲体系和pH值的溶液环境中对核酸进行特异性的吸附，通过外部磁场和试剂清洗的共同作用，将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开；再通过改变洗脱液的离子浓度将磁珠与核酸进行分离，可获得高质量的核酸；磁珠法进行核酸的提取纯化还能配合市面上的自动化核酸提取仪器进行，实现一次性多个样本的自动化核酸提取。然而，现有的利用磁珠进行核酸提取的方法仍存在部分缺陷，具体包括：1)磁珠在核酸提取的过程中，表面除了吸附特定的DNA，往往还会黏附了部分杂质如杂蛋白，容易干扰下游核酸检测；2)现有大多数核酸提取或纯化试剂往往在清洗步骤引入了乙醇，磁珠在经过含有乙醇的溶液清洗之后需要充分晾干，否则会影响后续的核酸检测的准确性；3)现有多数同类产品在核酸提取的过程中，磁珠有时候容易残留在核酸洗脱液中，一定程度对下游的荧光定量PCR检测产生抑制影响；4)对于较低浓度的样本，核酸提取或纯化的效果不佳，影响下游检测稳定性。

发明内容

1、要解决的问题

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一款带磁珠进行荧光定量PCR检测的DNA提取试剂，能够处理全血、血浆、血清、细胞、唾液、口腔、鼻咽喉拭子洗液等多种生物样本，并提供一种快速的核酸提取方法，最快仅需13分钟便能完成DNA的提取；提取后的DNA洗液不需要进行磁珠分离，直接将含有磁珠的目标DNA洗脱液作为荧光定量PCR反应溶液组分，通过加入对应靶标DNA的引物探针及DNA聚合酶反应液，可直接进行荧光定量PCR检测。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒，包括快速DNA提取试剂盒；

所述的快速DNA提取试剂盒包括裂解结合液LB、洗涤液W1、洗涤液W2、核酸洗脱反应液EB、磁珠MB以及蛋白酶K。

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的裂解结合液LB，溶剂为去离子水，其组成体系包括如下试剂：

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的洗涤液W1，溶剂为去离子水，其组成体系包括如下试剂：

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的洗涤液W2，溶剂为去离子水，其组成体系包括如下试剂：

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的核酸洗脱反应液EB，溶剂为0.1％质量百分比DEPC灭菌水，其组成体系包括如下试剂：

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的磁珠MB为硅羟基磁珠或硅羧基磁珠中的一种；

所述的磁珠MB的平均粒径为100nm-800nm；

所述的磁珠MB的磁珠悬液浓度为30mg/mL-100mg/mL。

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的蛋白酶K的浓度为20mg/mL-50mg/mL。

一种带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒的提取方法，

所述的提取方法，包括手动核酸提取方法或搭配自动化仪器实现高通量自动化DNA提取方法。

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒的提取方法中，

其中手动核酸提取方法，包括以下步骤：

(1)准备1.5mL的无核酸酶离心管，按1.5μl/T加入磁珠MB；其中，磁珠MB为硅羧基磁珠，其浓度为50mg/mL；

(2)在上述步骤(1)中无核酸酶离心管，先后加入10μl蛋白酶K和200μl样本；其中，蛋白酶K浓度为20mg/mL；

(3)在上述步骤(2)中无核酸酶离心管，加入600μl裂解结合液LB，充分振荡混匀，随后65℃温浴4min-5min，期间再次混匀2-3次；其中，裂解结合液LB各组分的浓度为：1.5M盐酸胍，2.5M硫氰酸胍，125mM Tris-HCl，25mM EDTA，7％Tween-20(m/v)，1％TritonX-100(m/v)，10％PEG6000(m/v)，0.1％十二烷基硫酸钠(m/v)，30mM三-2-甲酰乙基-膦盐酸盐，100mM氯化钠，100mM氯化锂，pH为6.0；

(4)将在上述步骤(3)中无核酸酶离心管，置于磁力架上，待管内磁珠MB充分吸附后，用移液器吸弃管内液体；

(5)取下上述步骤(4)中无核酸酶离心管，加入600μl洗涤液W1，振荡混匀30s后，将离心管置于磁力架上，待管内磁珠MB充分吸附后，用移液器吸弃管内液体；其中，洗涤液W1各组分的浓度为：100mM Tris-HCl，15％PEG200(m/v)，10％PEG6000(m/v)，2％PEG8000(m/v)，0.5％山梨酸钾(m/v)，1M盐酸胍，0.5M氯化钾，pH为7.8；

(6)取下上述步骤(5)中无核酸酶离心管，加入600μl洗涤液W2，振荡混匀30s后，将离心管置于磁力架上，待管内磁珠MB充分吸附后，用移液器吸弃管内液体；其中，洗涤液W2各组分的浓度为：100mM Tris-HCl，8％PEG8000(m/v)，10％PEG6000(m/v)，1M氯化钠，pH为8.0。

(7)将上述步骤(6)中无核酸酶离心管的管内液体尽可能吸弃干净；

(8)取下上述步骤(7)中无核酸酶离心管，加入25μl核酸洗脱反应液EB，盖上盖子，充分振荡混匀后85℃热孵育4min-5min，随后取出目标核酸洗脱反应液EB，加入对应目标DNA的引物探针及DNA聚合酶反应液，可直接上机检测；其中，核酸洗脱反应液EB各组分的浓度为：0.1％DEPC灭菌超纯水，5mM Tris-HCl，20mM KCl，30mM MgCl

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒的提取方法中，

其中搭配自动化仪器实现高通量自动化DNA提取方法，包括以下步骤：

将样本与蛋白酶K加入并按照下述程序的设置参数进行核酸提取：

裂解：混合时间为5min，磁吸时间为50s，混合速度为快，容积为800μl，状态温度为裂解加热、65℃，

洗涤1：混合时间为30s，磁吸时间为15s，混合速度为快，容积为600μl，状态温度为关闭、0℃，

洗涤2：混合时间为30s，磁吸时间为15s，混合速度为快，容积为600μl，状态温度为关闭、0℃，

洗脱：混合时间为5min，磁吸时间为0s，混合速度为快，容积为30μl，状态温度为洗脱加热、85℃；

提取结束后将洗脱孔里的核酸洗脱反应液EB取出，加入对应目标DNA的引物探针及DNA聚合酶反应液，直接上机检测即可。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的裂解结合液LB配比合理，能够充分有效地裂解全血、血浆、拭子等样本，裂解效率高，使得细胞中的核酸能够充分释放，细胞裂解与核酸结合同步进行，降低了试剂成本的同时更便于使用，有利于提高核酸的质量和提取效率，保证后续操作的准确性。

(2)本发明所述的试剂提取后的DNA洗液不需要进行磁珠分离，直接将含有磁珠的目标DNA洗脱反应液作为荧光定量PCR反应溶液组分，后续只需加入对应靶标DNA的引物探针及DNA聚合酶反应液，可直接上机进行荧光定量PCR检测。

(3)本发明的所有试剂组分均不含易燃易爆易挥发的无水乙醇或异丙醇，在使用过程中对人体的危害进一步降低；在储存和运输的过程中更稳定更安全。

(4)本发明的核酸洗脱反应液EB能够携带磁珠进行荧光定量PCR扩增检测，磁珠用量少，不影响下游核酸检测，同时能够对低浓度样本的DNA能够实现较大程度的富集，保证了低浓度样本检测的稳定性。

(5)本发明的核酸提取方法步骤简单，用时较短，在DNA提取的过程中无需晾干等待时间，无需分离磁珠与目标核酸，通过配合仪器能够实现核酸提取的自动化和高通量化，同时提取96个样本时间最快只需要13min；并且提取过程中使用的所有试剂均为无毒无害的，对实验操作人员进行了有效的保护。

(6)在进行核酸提取的时候，完成提取后直接将含有磁珠的目标DNA洗脱液作为荧光定量PCR反应溶液组分，通过加入对应靶标DNA的引物探针及DNA聚合酶反应液，可直接进行荧光定量PCR检测，区别于大多数核酸提取试剂，要额外再配制PCR反应buffer，本申请的洗脱液可以直接当做反应buffer，以期解决微量DNA的提取检测不灵敏的问题；同时，本申请的裂解液采用无醇方式，且其他试剂均不含醇；此外，相对于传统提取过程中必须进行核酸磁珠分离的操作，本申请还减少了洗脱步骤。

附图说明

图1为本发明中实施例1的10^4IU/mL血浆HBV-DNA带磁珠扩增曲线图；

图2为本发明中实施例1的50IU/mL血浆HBV-DNA带磁珠扩增曲线图；

图3为本发明中实施例1的10IU/mL血浆HBV-DNA带磁珠扩增曲线图；

图4为本发明中实施例2的10^4IU/mL全血HBV-DNA带磁珠扩增曲线图；

图5为本发明中实施例2的50IU/mL全血HBV-DNA带磁珠扩增曲线图；

图6为本发明中实施例2的10IU/mL全血HBV-DNA带磁珠扩增曲线图；

图7为本发明中实施例3的EF-1-α-DNA带磁珠扩增曲线图；

图8为本发明中实施例3的UbcH5B-DNA带磁珠扩增曲线图；

图9为本发明中实施例4的10IU/mL HBV-DNA扩增曲线图；

图10为本发明中实施例4的5IU/mL HBV-DNA扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

本发明中带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒，包括快速DNA提取试剂盒；

所述的快速DNA提取试剂盒包括裂解结合液LB、洗涤液W1、洗涤液W2、核酸洗脱反应液EB、磁珠MB以及蛋白酶K。

裂解结合液LB主要作用在于裂解样本的细胞膜，破坏表面膜蛋白及细胞核蛋白，释放样本中的DNA并促进其与磁珠的特异性吸附。其中，盐酸胍是一种核酸酶的强抑制剂，能够破坏蛋白质的三维结构，解离DNA与核蛋白的相互作用，但强度一般；硫氰酸胍是一种强有力的蛋白质变性剂，能够迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，使多数蛋白质转换成随机的卷曲状态。本发明中将盐酸胍和硫氰酸胍在一定浓度下组合使用，能够快速有效裂解细胞样本，破坏细胞膜表面蛋白及核蛋白释放DNA，并且抑制可能存在的核酸酶对DNA的降解，保护了DNA的完整性。Tris-HCl作为缓冲液组分，提供稳定的液体酸碱环境，维持核酸磷酸基团的带电状态，对DNA起一定的保护作用。EDTA(乙二胺四乙酸)是一种二价金属离子螯合剂，能够螯合Mg

洗涤液W1的主要作用在于漂洗上一步骤样本裂解的过程中残留的粘蛋白杂质。其中，盐酸胍和氯化钾的加入增强了蛋白质在液体中的溶解度。PEG的引入替代了常规方法中无水乙醇对DNA的沉淀作用，降低了对人体的使用危害，避免了乙醇挥发的风险，更为安全稳定。山梨酸钾起到防腐的作用。

洗涤液W2的主要作用是对上一步骤残留的盐酸胍和其他残留物质进一步漂洗，保证DNA的纯度。PEG的引入替代了常规方法中无水乙醇对DNA的沉淀作用，降低核酸在漂洗过程中丢失的风险。

与常规的磁珠法核酸提取试剂产品不同的是，常规的磁珠法核酸提取试剂的核酸洗脱液，仅能用于目标核酸的洗脱收集，且磁珠需要和溶液进一步分离，获得的目标核酸洗脱液才能作为检测模板进一步应用到下阶段荧光定量PCR扩增检测中。本发明中所述的核酸洗脱反应液EB，除了满足在DNA提取过程中DNA的洗脱收集作用，还兼顾了荧光定量PCR试剂的组分之一的功能，可作为荧光定量PCR试剂的组分，携带含有目标DNA模板的磁珠直接参与到荧光定量PCR扩增检测反应中。其中，经DEPC处理灭菌的超纯水溶液能够有效洗脱收集目标DNA，同时DEPC的存在能够有效抑制核酸酶对DNA的降解，保证核酸的完整性。Tris-HCl、KCl和MgCl

本发明所选用的磁珠是运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒表面进行改良和修饰后制备而成氧化硅纳米磁珠，表面修饰有特定的羟基或羧基等负电基团，裂解结合液LB中的单价阳离子能够在磁珠表面的负电基团和带负电的核酸之间形成盐桥作用，使磁珠和DNA磷酸骨架通过静电或氢键作用力相互吸附，实现磁珠与核酸的特异性结合。本发明所选用的磁珠粒径分别在100～300nm与500～800nm之间，较小粒径的磁珠在液体中的悬浮性好，有利于核酸与磁珠的充分接触进行特异性吸附，较大粒径的磁珠在液体中沉降速度快，易于吸附，有利于外部磁场对磁珠的快速聚集，从而缩短核酸提取的时间。

蛋白酶K能够在核酸提取过程中进一步辅助裂解蛋白质，降低杂质引入对下游荧光定量PCR检测的影响。蛋白酶K的加入配合本发明所述的裂解结合液LB，更有利于对于全血等富含杂质的样本中DNA的提取，使本发明能满足于更多样本类型的使用。

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的裂解结合液LB，其组成体系包括如下试剂：

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的洗涤液W1，其组成体系包括如下试剂：

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的洗涤液W2，其组成体系包括如下试剂：

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的核酸洗脱反应液EB，其组成体系包括如下试剂：

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的磁珠MB为硅羟基磁珠或硅羧基磁珠中的一种；

所述的磁珠MB的平均粒径为100nm-800nm；

所述的磁珠MB的磁珠悬液浓度为30mg/mL-100mg/mL。

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒中，

所述的蛋白酶K的浓度为20mg/mL-50mg/mL。

一种带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒的提取方法，

所述的提取方法，包括手动核酸提取方法或搭配自动化仪器实现高通量自动化DNA提取方法。

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒的提取方法中，其中手动核酸提取方法，包括以下步骤：

(1)准备1.5mL的无核酸酶离心管，按1.5μl/T加入磁珠MB；其中，磁珠MB为硅羧基磁珠，其浓度为50mg/mL；

(2)在上述步骤(1)中无核酸酶离心管，先后加入10μl蛋白酶K和200μl样本；其中，蛋白酶K浓度为20mg/mL；

(3)在上述步骤(2)中无核酸酶离心管，加入600μl裂解结合液LB，充分振荡混匀，随后65℃温浴4min-5min，期间再次混匀2-3次；其中，裂解结合液LB各组分的浓度为：1.5M盐酸胍，2.5M硫氰酸胍，125mM Tris-HCl，25mM EDTA，7％Tween-20(m/v)，1％TritonX-100(m/v)，10％PEG6000(m/v)，0.1％十二烷基硫酸钠(m/v)，30mM三-2-甲酰乙基-膦盐酸盐，100mM氯化钠，100mM氯化锂，pH为6.0；

(4)将在上述步骤(3)中无核酸酶离心管，置于磁力架上，待管内磁珠MB充分吸附后，用移液器吸弃管内液体；

(5)取下上述步骤(4)中无核酸酶离心管，加入600μl洗涤液W1，振荡混匀30s后，将离心管置于磁力架上，待管内磁珠MB充分吸附后，用移液器吸弃管内液体；其中，洗涤液W1各组分的浓度为：100mM Tris-HCl，15％PEG200(m/v)，10％PEG6000(m/v)，2％PEG8000(m/v)，0.5％山梨酸钾(m/v)，1M盐酸胍，0.5M氯化钾，pH为7.8；

(6)取下上述步骤(5)中无核酸酶离心管，加入600μl洗涤液W2，振荡混匀30s后，将离心管置于磁力架上，待管内磁珠MB充分吸附后，用移液器吸弃管内液体；其中，洗涤液W2各组分的浓度为：100mM Tris-HCl，8％PEG8000(m/v)，10％PEG6000(m/v)，1M氯化钠，pH为8.0。

(7)将上述步骤(6)中无核酸酶离心管的管内液体尽可能吸弃干净；

(8)取下上述步骤(7)中无核酸酶离心管，加入25μl核酸洗脱反应液EB，盖上盖子，充分振荡混匀后85℃热孵育4min-5min，随后取出目标核酸洗脱反应液EB，加入对应目标DNA的引物探针及DNA聚合酶反应液，可直接上机检测；其中，核酸洗脱反应液EB各组分的浓度为：0.1％DEPC灭菌超纯水，5mM Tris-HCl，20mM KCl，30mM MgCl

如上述所述的带磁珠进行荧光定量PCR检测的快速DNA提取试剂盒的提取方法中，

其中搭配自动化仪器实现高通量自动化DNA提取方法，最快可在13min内完成1～96个样本DNA的提取，包括以下步骤：

将样本与蛋白酶K加入并按照下述程序的设置参数进行核酸提取：

孔位2，裂解：混合时间为5min，磁吸时间为50s，混合速度为快，容积为800μl，状态温度为裂解加热、65℃，

孔位3，洗涤1：混合时间为30s，磁吸时间为15s，混合速度为快，容积为600μl，状态温度为关闭、0℃，

孔位4，洗涤2：混合时间为30s，磁吸时间为15s，混合速度为快，容积为600μl，状态温度为关闭、0℃，

孔位6，洗脱：混合时间为5min，磁吸时间为0s，混合速度为快，容积为30μl，状态温度为洗脱加热、85℃；

提取结束后将洗脱孔里的核酸洗脱反应液EB取出，加入对应目标DNA的引物探针及DNA聚合酶反应液，直接上机检测即可。

实施例1

本实验采用HBV阳性样本作为测试样本，用人阴性血浆稀释HBV样本浓度梯度分别为10^4IU/mL、50IU/mL、10IU/mL作为待测样本，使用本发明提供的试剂进行血浆样本HBV-DNA的提取，采取手动提取的方法。提取结束后，取23.5μl含磁珠的核酸洗脱反应液EB至200μl PCR反应管中，按下表配置荧光定量PCR反应体系：

表1荧光定量PCR反应体系

其中，HBV pbmix为珠海宝锐生物科技有限公司自主配置的荧光定量PCR引物及探针预混试剂，50×Fast Direct Enzyme/UNG mix为珠海宝锐生物科技有限公司自主配置DNA聚合酶反应预混液。

其中，HBV pbmix引物探针序列如表2所示：

表2 HBV pbmix引物探针序列

将配置好的PCR反应体系按下述反应程序设置并进行荧光定量PCR扩增检测，所选用仪器为上海宏石SLNP-96荧光PCR仪：

表3荧光定量PCR扩增程序

实验结果如下：

1.1Ct值统计

表4荧光定量PCR检测Ct值统计表

1.2荧光定量PCR扩增曲线

具体如图1、图2及图3所示。

实验结论：

根据上述结果，本发明所述的核酸提取试剂能够有效满足血浆样本中DNA的提取，磁珠带入到荧光定量PCR扩增反应体系中，并没有对荧光定量PCR结果造成不利影响；相反，促进了样本检测的稳定性，低浓度样本如10IU/mLHBV样本的检测稳定性、均一性良好，扩增Ct值合理。

实施例2

本实验采用HBV阳性样本作为测试样本，用全血样本稀释HBV样本浓度梯度分别为10^4IU/mL、50IU/mL、10IU/mL作为待测样本，使用本发明提供的试剂进行全血样本中HBV-DNA的提取，采取手动提取的方法。提取结束后，取23.5μl含磁珠的核酸洗脱反应液EB至200μl PCR反应管中，按下表配置荧光定量PCR反应体系如表5所示：

表5荧光定量PCR反应体系

其中，HBV pbmix为珠海宝锐生物科技有限公司自主配置的荧光定量PCR引物及探针预混试剂，50×Fast Direct Enzyme/UNG mix为珠海宝锐生物科技有限公司自主配置DNA聚合酶反应预混液。

其中，HBV pbmix引物探针序列如下：

表6 HBV pbmix引物探针序列

将配置好的PCR反应体系按下述反应程序设置并进行荧光定量PCR扩增检测，所选用仪器为上海宏石SLNP-96荧光PCR仪：

表7荧光定量PCR扩增程序

实验结果如下：

2.1Ct值统计

表8荧光定量PCR检测Ct值统计表

2.2荧光定量PCR扩增曲线

具体如图4、图5及图6所示。

实验结论：

根据上述结果，本发明所述的核酸提取试剂能够有效满足全血样本中DNA的提取，磁珠带入到荧光定量PCR扩增反应体系中，并没有对荧光定量PCR结果造成不利影响；样本的检测稳定性、均一性良好，扩增Ct值合理。

实施例3

本实验采用正常人的口腔细胞拭子洗液作为测试样本，使用本发明提供的试剂进行拭子样本中人基因组DNA的提取，采取手动提取的方法。提取结束后，取23.5μl含磁珠的核酸洗脱反应液EB至200μl PCR反应管中，按下表配置荧光定量PCR反应体系，检测人基因组DNA中的EF-1-α和UbcH5B片段，如表9所示：

表9荧光定量PCR反应体系

其中，EF-1-α/UbcH5B pbmix为珠海宝锐生物科技有限公司自主配置的荧光定量PCR引物及探针预混试剂，50×Fast Direct Enzyme/UNG mix为珠海宝锐生物科技有限公司自主配置DNA聚合酶反应预混液。

其中，EF-1-αpbmix引物探针序列如下：

表10 EF-1-αpbmix引物探针序列

其中，UbcH5B pbmix引物探针序列如下：

表11 UbcH5B pbmix引物探针序列

将配置好的PCR反应体系按下述反应程序设置并进行荧光定量PCR扩增检测，所选用仪器为上海宏石SLNP-96荧光PCR仪：

表12荧光定量PCR扩增程序

实验结果如下：

3.1Ct值统计

表13荧光定量PCR检测Ct值统计表

3.2荧光定量PCR扩增曲线

具体如图7、图8所示。

实施例4

本实验采用HBV阳性样本作为测试样本，用人阴性血浆稀释HBV样本浓度梯度分别为10IU/mL和5IU/mL作为待测样本，分别使用本发明提供的试剂和竞品磁珠法核酸提取试剂盒进行血浆样本HBV-DNA的提取，采取核酸提取仪自动化提取的方法。竞品磁珠法核酸提取试剂盒采购自杭州博日科技股份有限公司的MagBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒。随后将目标核酸提取产物分别进行荧光定量PCR扩增检测HBV-DNA。其中，本发明采用带磁珠的核酸洗脱反应液EB作为反应模板，竞品采用不含磁珠的纯核酸洗脱液作为反应模板，PCR反应体系及反应程序设置参考实施例1。

实验结果如下：

4.1Ct值统计

表14荧光定量PCR检测Ct值统计表

4.2荧光定量PCR扩增曲线

具体如图9、图10所示。

实验结论：

根据上述结果，本发明所述的核酸提取试剂能够有效满足血浆样本中DNA的提取，与竞品相比，本发明所述的核酸提取试剂能够高效提取低浓度病毒DNA样本，提取灵敏度高，磁珠带入至PCR扩增体系中，未对检测结果造成不良影响，且检测结果更稳定、可靠。

综上所述，本发明所述的一种可带磁珠扩增的快速DNA提取试剂，能够满足全血、血浆、拭子等多种样本类型的DNA提取，提取后产物能直接应用于荧光定量PCR扩增检测反应，不需要进行磁珠与核酸的分离，且不影响下游检测，能够更简便、更灵敏、更快速实现核酸的提取或纯化。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。