一种膀胱癌预后标志物、预后评估系统及其应用

摘要

本发明提供一种膀胱癌预后标志物、预后评估系统及其应用，属于肿瘤预后评估技术领域。本发明通过研究发现，OTUD6A与CDC6在膀胱癌中表达量显著升高，同时研究表明，OTUD6A与CDC6表达情况与膀胱癌患者的总生存率息息相关，因此可以通过检测OTUD6A与CDC6的表达实现判断膀胱癌恶性程度及患者预后的目的，从而有助于提高膀胱癌患者的生存率，为膀胱癌的临床精准治疗决策提供新的思路，因此具有良好的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤预后评估技术领域，具体涉及于一种膀胱癌预后标志物、预后评估系统及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

尿路上皮癌是泌尿外科中常见的临床疾病之一，其中包括膀胱癌、肾盂癌以及输尿管癌等疾病，其中膀胱癌约占整个尿路上皮癌的90％以上，常好发于男性，男女发病之比约为4:1。膀胱癌复发及死亡风险高，肌层浸润性膀胱癌5年生存率不足50％。根据2022年最新全球癌症统计显示，膀胱癌在男性中发病率为第4位，死亡率为第9位。然而除了目前已知的肿瘤分级、分期、淋巴结转移和ki-67染色可以对肿瘤的恶性程度以及患者预后进行判断，目前尚未有明确的指标可以进行评估患者预后。

免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测，是利用了抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织或细胞内的抗原(多肽和蛋白)，对其定位、定性及相对定量的研究。由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机的结合在一起，其已经广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。而在病理学研究中，免疫组化的作用和意义显然更为重要。但是，发明人发现，目前鲜有利用免疫组化检测手段评估膀胱癌恶性程度及预后的方法报道。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供一种膀胱癌预后标志物、预后评估系统及其应用。本发明通过研究发现，OTUD6A与CDC6在膀胱癌中表达量显著升高，同时研究表明，OTUD6A与CDC6表达情况与膀胱癌患者的总生存率息息相关，因此可以通过检测OTUD6A与CDC6的表达实现判断膀胱癌恶性程度及患者预后的目的，基于上述研究成果，从而完成本发明。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种膀胱癌预后标志物，所述膀胱癌预后标志物包括OTUD6A和CDC6。

本发明的第二个方面，提供检测上述预后标志物的物质在制备膀胱癌相关检测产品中的应用。

其中，所述膀胱癌相关检测产品包括膀胱癌免疫组织化学检测试剂盒，其可用于判断膀胱癌恶性程度及患者预后情况。

本发明的第三个方面，提供一种产品，所述产品包含用于检测上述预后标志物的物质，所述产品用于对膀胱癌进行预后评估。

本发明的第四个方面，提供上述预后标志物、产品在制备膀胱癌预后评估系统中的应用。

本发明的第五个方面，提供一种膀胱癌预后评估系统，所述系统包括：分析单元和评估单元；

其中，所述分析单元用于获取受试者OTUD6A和CDC6的结果；

所述评估单元根据获取得到OTUD6A和CDC6的结果，赋予其对应的评估分值获得总分值，输出受试者对应的预后状态；

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案通过患者组织标本进行免疫组化染色CDC6与OTUD6A蛋白，检测两者的表达水平，根据两者表达量高低进行判断预后，评估肿瘤的恶性程度；同时还可以评估患者预后情况，从而有助于提高膀胱癌患者的生存率，为膀胱癌的临床精准治疗决策提供新的思路，因此具有良好的临床应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例中20例膀胱癌及癌旁组织标本中OTUD6A和CDC6蛋白表达量(上)以及OTUD6A蛋白(左下)和CDC6蛋白(右下)在肿瘤组织和癌旁组织中的相对表达量。

图2是本发明实施例中OTUD6A和CDC6蛋白表达在膀胱肿瘤组织中相关性分析。

图3是本发明实施例中肿瘤和癌旁组织标本中OTUD6A(左)和CDC6(右)的mRNA表达量。

图4是本发明实施例中正常尿路上皮和膀胱癌细胞系中CDC6和OTUD6A表达(左)，以及蛋白表达量相关性分析(右)。

图5是本发明实施例中膀胱癌组织芯片中OTUD6A和CDC6的免疫组化染色图。

图6是本发明实施例中OTUD6A高表达和低表达患者的生存曲线。

图7是本发明实施例中CDC6高表达和低表达患者的生存曲线。

图8是本发明实施例中OTUD6A联合CDC6表达判断患者预后的生存曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种膀胱癌预后标志物，所述膀胱癌预后标志物包括OTUD6A和/或CDC6。

具体的，本发明研究发现OTUD6A和CDC6在膀胱癌中表达量明显高于正常膀胱上皮，OTUD6A和CDC6蛋白表达量具有明显正相关性；而利用膀胱癌组织芯片中患者预后信息对OTUD6A和CDC6分别进行整体生存率分析，结果显示OTUD6A低表达膀胱癌患者的总生存率显著高于高表达组，CDC6低表达膀胱癌患者的总生存率也显著高于高表达组。将OTUD6A和CDC6蛋白联合应用预测膀胱癌患者生存情况，生存分析结果显示同时高表达OTUD6A和CDC6患者的总生存率最低，同时低表达OTUD6A和CDC6患者的总生存率最高，OTUD6A低表达且CDC6高表达患者总生存率要低于OTUD6A高表达且CDC6低表达的患者。

本发明的又一具体实施方式中，提供检测上述预后标志物的物质在制备膀胱癌相关检测产品中的应用。

其中，所述膀胱癌相关检测产品包括膀胱癌免疫组织化学检测试剂盒，其可用于判断膀胱癌恶性程度及患者预后情况。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含用于检测上述预后标志物的物质，所述产品用于对膀胱癌进行预后评估。

所述产品包括但不限于检测待测样品中OTUD6A和/或CDC6表达情况的制剂或试剂盒。

所述待测样本可以为人源样本，更具体的，所述待测样本包括受试者膀胱(癌)组织。

本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为免疫组织化学检测试剂盒。因此，所述试剂盒可以包含一抗、二抗、内源性过氧化氢清除剂、与辣根过氧化物酶反应并显色的显色试剂(如DAB溶液)，特异性对组织中细胞核染色的试剂(如苏木素)等。

其中，一抗具体为针对人OTUD6A和CDC6抗原所制备的OTUD6A和CDC6特异性抗体，如兔抗人OTUD6A多克隆抗体、兔抗人CDC6特异性抗体等，在此不做具体限定。

相对应的，二抗只需与一抗的种属、类别或亚类相匹配即可，如当一抗为兔抗人OTUD6A或CDC6多克隆抗体时，二抗可以为羊抗兔IgG。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述预后标志物、产品在制备膀胱癌预后评估系统中的应用。

所述膀胱癌预后评估系统可以用于对受试者的膀胱癌恶性程度和生存率进行评估。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种膀胱癌预后评估系统，所述系统包括：分析单元和评估单元；

其中，所述分析单元用于获取受试者OTUD6A和/或CDC6的结果；

所述评估单元根据获取得到OTUD6A和/或CDC6的结果，赋予其对应的评估分值获得总分值，输出受试者对应的预后状态；

更具体的，所述受试者OTUD6A和/或CDC6的结果为经免疫组织化学染色后获得染色强度以及阳性细胞占整个组织的面积。

所述评估单元具体评估流程包括：将染色强度分为阴性0分，较弱1分，中等2分，强阳性3分；将阳性细胞占整个组织的面积的大小分为小于5％的0分，5％-25％的1分，26％-50％的2分，51％-75％的3分，大于75％的4分；将两个分数进行相乘；0-7分则判定为低表达，8-12分则判定为高表达。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

利用免疫组织化学检测试剂盒评估膀胱癌的恶性程度及患者预后的方法包括以下步骤：

(1)将从患者体内取出的膀胱癌组织进行包埋、切片，得到石蜡切片。

(2)将石蜡切片放入65℃的烘箱内30分钟至1小时，直至组织上残余的蜡液完全脱落。

(3)依次按下表进行脱蜡处理

(4)将50×抗原修复液用三蒸水稀释成1×，放入微波炉高火5分钟后，将玻片放入煮沸的抗原修复液后，低火17分钟，将抗原修复液放于室温自然冷却。

(5)用PBS清洗玻片三次，每次3分钟。

(6)用组化笔将组织圈起，避光滴加内源性过氧化氢清除剂，静置室温20分钟，后用PBS清洗玻片三次，每次3分钟。

(7)在组织上滴加5％BSA溶液室温静置封闭1小时。

(8)用PBS稀释CDC6以及OTUD6A一抗(兔抗人OTUD6A多克隆抗体(Proteintech公司，货号24486-1-AP)；重组兔抗人CDC6抗体(Abcam公司，货号ab109315)。

)，将封闭液倒掉后滴加一抗，使一抗完全盖住组织，4℃孵育过夜。

(9)第二天将玻片拿出后放置于室温复温1小时。

(10)甩掉一抗后，用PBS清洗玻片三次，每次3分钟。

(11)滴加二抗，所述二抗为山羊抗兔IgG，Jackson ImmunoResearch，货号711-035-152，室温静置孵育1小时。

(12)用PBS清洗玻片三次，每次3分钟。

(13)用10μL的20×DAB溶液与190μL的DAB底物液混合(根据玻片组织的大小以及数量进行等比例的扩大或减少)。

(14)在组织上滴加1×DAB溶液后在显微镜下观察，至染色适中后，放入PBS中。

(15)在组织上滴加苏木素染色30秒，放入流水中冲洗5分钟。

(16)依次按下表进行脱水处理

(17)在玻片上滴加中性树胶封片。

(18)第二天在正置显微镜下进行观察并记录图像。

(19)染色评分根据如下标准：染色强度可以分为阴性0分，较弱1分，中等2分，强阳性3分；阳性细胞占整个组织的面积的大小可以分为小于5％的0分，5％-25％的1分，26％-50％的2分，51％-75％的3分。大于75％的4分。两个分数进行相乘。0-7分则判定为低表达，8-12则判定为高表达。

20对膀胱癌及其癌旁组织进行Western blot检测OTUD6A和CDC6表达。结果如图1所示，与癌旁组织相比，OTUD6A与CDC6蛋白在膀胱癌组织中表达上调。如图2所示，OTUD6A和CDC6蛋白表达呈显著正相关性。RT-qPCR结果显示OTUD6A与CDC6的mRNA表达量在膀胱癌组织中比癌旁组织高(图3)。检测不同膀胱癌细胞系和尿路上皮细胞系中CDC6和OTUD6A蛋白结果如图4所示，OTUD6A与CDC6蛋白表达呈显著正相关(r

利用膀胱癌组织芯片中患者预后信息对OTUD6A和CDC6分别进行整体生存率分析(Kaplan-Meier plot)，结果显示OTUD6A低表达膀胱癌患者的总生存率显著高于高表达组(图6)，CDC6低表达膀胱癌患者的总生存率也显著高于高表达组(图7)。将OTUD6A和CDC6蛋白联合应用预测膀胱癌患者生存情况，生存分析结果显示同时高表达OTUD6A和CDC6患者的总生存率最低，同时低表达OTUD6A和CDC6患者的总生存率最高，OTUD6A低表达且CDC6高表达患者总生存率要低于OTUD6A高表达且CDC6低表达的患者(P＝0.0307，图8)，提示OTUD6A联合CDC6表达具有指导膀胱癌患者预后价值。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。