绞股蓝皂苷用于制备戒毒药物中的应用

摘要

本发明公开了绞股蓝皂苷用于制备戒毒药物中的应用，首次发现绞股蓝皂苷可以恢复阿片类药物滥用所导致的免疫抑制，免疫功能下降的情况，提升阿片类药物滥用者的免疫力。绞股蓝皂苷可以使阿片类药物滥用后所出现的中枢免疫器官胸腺萎缩得以恢复，同时增加了阿片类药物所致胸腺降低的T淋巴细胞及其亚群(CD3+CD4+CD8‑T淋巴细胞和CD3+CD8+CD4‑T淋巴细胞)得以恢复；能够激活胸腺细胞中的Camp‑creb/crem/‑IL‑2信号通路，恢复胸腺IL‑2的表达，从而增加T淋巴细胞的表达。

说明书

技术领域

本发明涉及戒毒药物领域，具体涉及绞股蓝皂苷用于制备戒毒药物中的应用。

背景技术

阿片类药物所导致的免疫抑制已在细胞实验和动物模型中得到证实。不同类型的阿片类药物对免疫系统的影响是不同的。阿片类药物免疫抑制作用的调节机制是复杂的，对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用，包括抑制淋巴细胞增殖、减少细胞因子分泌、降低自然杀伤细胞的细胞毒性等。

据研究报道，长期使用和滥用阿片类药物会严重损害免疫系统，不仅会使免疫器官萎缩，还可以使先天免疫细胞如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及后天免疫细胞 T淋巴细胞减少及其功能受损从而增加机会性感染的风险。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供绞股蓝皂苷用于制备戒毒药物中的新应用。

绞股蓝性寒、味苦，具有清热解毒、止咳清肺祛痰、养心安神、补气生精之功效。其主要有效成分是绞股蓝皂甙，此外还含有甾醇类、黄酮类成分，以及维生素C、谷氨酸等17种氨基酸和铁、锌、铜等18种微量元素。由于其酸水解产物与人参皂甙的酸水解产物——人参二醇具有相同的理化性质，因而被称为“南方人参”。现代药理学研究表明绞股蓝可以降血压、降血脂、促进睡眠、提升机体免疫力的作用。

本发明针对阿片药物滥用者出现的免疫系统受损，免疫力低下的现象，提供一种中药有效成分，来改善阿片类药物所致的免疫器官萎缩、T淋巴细胞及其亚群减少的情况，增强滥用者免疫力。

申请人研究发现阿片类药物如吗啡滥用可以导致小鼠体重下降，中枢免疫器官胸腺萎缩，胸腺指数下降，同时胸腺T淋巴细胞及其亚群占比显著减少，而绞股蓝皂苷可以提升机体免疫力。因此，我们探讨了绞股蓝皂苷改善吗啡滥用所致免疫抑制的具体作用及其可能机制。通过研究发现绞股蓝皂苷可以使阿片类药物如吗啡所致小鼠体重下降得以恢复，同时改善胸腺萎缩、胸腺指数下降的情况。通过流式细胞术和HE 染色表明可吗啡所致胸腺T淋巴细胞及其亚群占比减少恢复至正常水平。

为此，本发明提供了一种中药有效成分(绞股蓝皂苷)，可以改善阿片类药物如吗啡滥用所致的机体免疫力下降的情况。

本发明要求保护绞股蓝皂苷在制备治疗或预防阿片类药物滥用导致成瘾的药物中的应用。

进一步地，本发明要求保护一种药物组合物，包括阿片类药物和绞股蓝皂苷。

更进一步地，本发明还要求保护上述药物组合物在制备治疗戒断阿片类药物成瘾的药物中的应用。

具体地，所述的阿片类药物为吗啡、杜冷丁、芬太尼、瑞芬太尼、可待因中的任意一种。

进一步地，本发明要求保护绞股蓝皂苷用于制备治疗阿片类药物滥用所导致免疫抑制的药物中的应用，尤其是：

(1)阿片类药物滥用所致的免疫器官萎缩；

(2)阿片类药物滥用所致的T淋巴细胞及其亚群数量减少。

进一步地，本发明研究发现绞股蓝皂苷能够激活胸腺细胞中的 Camp-creb/crem/-IL-2信号通路，恢复胸腺IL-2的表达，从而增加T淋巴细胞的表达。

因此，本发明还要求保护绞股蓝皂苷用于制备激活胸腺细胞中的 Camp-creb/crem/-IL-2信号通路，恢复胸腺IL-2表达的药物中的应用。

有益效果：

1、本发明首次发现绞股蓝皂苷可恢复吗啡所致体重降低，胸腺萎缩，胸腺指数下降的表现。

2、本发明首次发现绞股蓝皂苷能够增加胸腺T淋巴细胞及其亚群的占比，使吗啡所致降低的免疫细胞占比恢复至正常水平，使失衡的免疫系统恢复平衡。

3、本发明首次发现绞股蓝皂苷可以通过调节cAMP-creb/crem-IL-2通路来改善吗啡滥用所致免疫抑制情况。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/ 或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为吗啡免疫抑制造模时小鼠体重情况。

图2为绞股蓝皂苷治疗各组小鼠体重恢复情况。

图3为绞股蓝皂苷治疗后各组小鼠胸腺指数变化。

图4为各组小鼠流式细胞术测定胸腺CD3+T淋巴细胞的百分比。

图5为各组小鼠流式细胞术测定胸腺CD3+T淋巴细胞的百分比数据分析。

图6为各组小鼠流式细胞术测定胸腺CD3+CD4+CD8-T淋巴细胞的百分比。

图7为各组小鼠流式细胞术测定胸腺CD3+CD4+CD8-T淋巴细胞的百分比数据分析。

图8为各小组小鼠流式细胞术测定胸腺CD3+CD8+CD4-T淋巴细胞的百分比。

图9为各组小鼠流式细胞术测定胸腺CD3+CD8+CD4-T淋巴细胞的百分比数据分析。

图10为各小组小鼠胸腺HE染色

图11为各小组小鼠ELISA测定胸腺cAMP蛋白表达水平。

图12为各小组小鼠WB测定胸腺中转录因子creb、crem蛋白表达水平。

图13为各小组小鼠q-PCR测定胸腺转录因子creb、crem的mRNA表达水平。

图14为各小组小鼠ELISA测定胸腺IL-2蛋白表达水平。

图15为各小组小鼠q-PCR测定胸腺IL-2mRNA表达水平。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

(一)实验过程如下：

(1)绞股蓝皂苷的配置：

小鼠给药量为10ml/kg

低剂量的绞股蓝皂苷(60mg/kg):称取1.8g绞股蓝皂苷溶于30ml生理盐水中。

中剂量的绞股蓝皂苷(120mg/kg):称取3.6g绞股蓝皂苷溶于30ml生理盐水中。

高剂量的绞股蓝皂苷(180mg/kg):称取5.4g绞股蓝皂苷溶于30ml生理盐水中。

(2)动物分组及给药方案

雄性C57BL/6小鼠(6-8周)90只饲养一周以适应环境。随机分为5组，每组6 只。

(A)空白对照组(SAL+SAL)：小鼠连续6天每天腹腔注射生理盐水，上午8： 00和下午7：00各一次；第七天开始灌胃生理盐水，同样上午8：00和下午7：00各一次，连续灌胃7天。

(B)吗啡免疫抑制造模组(MOR+SAL)：小鼠腹腔注射盐酸吗啡注射液，分别以10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg、100mg/kg的剂量腹腔注射给药，上午8：00和下午7：00各一次；第七天开始灌胃生理盐水，同样上午8：00和下午7： 00各一次，连续灌胃7天。

(C)低剂量绞股蓝皂苷组(MOR+Gps低)：小鼠腹腔注射盐酸吗啡注射液，分别以10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg、100mg/kg的剂量腹腔注射给药，上午8：00和下午7：00各一次；第七天开始灌胃低剂量绞股蓝皂苷，同样上午8： 00和下午7：00各一次，连续灌胃7天。

(D)中剂量绞股蓝皂苷组(MOR+Gps中)：小鼠腹腔注射盐酸吗啡注射液，分别以10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg、100mg/kg的剂量腹腔注射给药，上午8：00和下午7：00各一次；第七天开始灌胃中剂量绞股蓝皂苷，同样上午8： 00和下午7：00各一次，连续灌胃7天。

(E)高剂量绞股蓝皂苷组(MOR+Gps高)：小鼠腹腔注射盐酸吗啡注射液，分别以10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg、100mg/kg的剂量腹腔注射给药，上午8：00和下午7：00各一次；第七天开始灌胃高剂量绞股蓝皂苷，同样上午8：00 和下午7：00各一次，连续灌胃7天。

每组小鼠每天给药前都要给小鼠称重。

(3)获取小鼠胸腺和脾脏并称重记录

灌胃给药七天结束后，于第8天早上称重后，用异氟烷将小鼠麻醉。摘眼球取血后脱颈处死。保留脾脏、胸腺组织，置于滤纸上控干水分，用分析天皮称重。

脾脏指数(％)＝脾脏重量(mg)/体重(10g)*100％

胸腺指数(％)＝胸腺重量(mg)/体重(10g)*100％

后置于PBS溶液中保存于冰上。

(4)小鼠胸腺细胞流式细胞术检测

采用流式细胞术检测各组小鼠胸腺CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+CD8-T淋巴细胞和CD3+CD8+CD4-T淋巴细胞的表达，将新鲜的胸腺组织保存在4℃的PBS中，用镊子取出置于干净的培养皿中，加入1ml已4℃预冷的PBS，研磨后用200目的尼龙筛网过滤原始悬液。各组小鼠胸腺处理完后，1500g，4℃离心5min，弃上清。加入500ul 红细胞裂解液，充分混匀，闭光充分裂解10min后，1500g，4℃离心5min，弃上清(此时若颜色仍然偏红，重复操作1次)。用预冷的PBS溶液反复清洗三次，每次均需1500g， 4℃离心5min，弃上清。最后加入500ulPBS冲悬后取出适量进行细胞计数，调整细胞为相同浓度等待后续染色。流式数据由FlowJo软件分析。

(5)小鼠胸腺HE染色

重复造模给药后取小鼠胸腺，固定于4％多聚甲醛中，然后包埋修块切片，进行 HE染色，具体步骤如下：

(1)二甲苯(Ⅰ) 15min

(2)二甲苯(Ⅱ) 15min

(3)二甲苯：无水乙醇＝1:1 2min

(4)100％乙醇(Ⅰ) 5min

(5)100％乙醇(Ⅱ) 5min

(6)80％乙醇 5min

(7)蒸馏水 5min

(8)苏木精液染色 5min

(9)水洗10min或流水冲洗 5min

(10)1％盐酸乙醇 30s

(11)水洗 30s

(12)蒸馏水过洗 5s

(13)0.5％伊红液染色 1-3min

(14)蒸馏水稍洗 30s

(15)80％乙醇稍洗 30s

(16)95％乙醇(Ⅰ) 1min

(17)95％乙醇(Ⅱ) 1min

(18)无水乙醇(Ⅰ) 3min

(19)无水乙醇(Ⅱ) 3min

(20)二甲苯(Ⅰ) 3min

(21)二甲苯(Ⅱ) 3min

(22)中性树胶封片

(6)小鼠胸腺ELISA检测cAMP、IL-2的表达

按ELISA试剂盒说明方法获取胸腺蛋白，用含cAMP、IL-2抗体的96孔板检测其表达。

(7)小鼠胸腺q-PCR检测IL-2、crem、creb的mRNA表达

引物情况如下：

GAPDH-FP:ACCACGTCCATGCCATCAC

GAPDH-RP:TCCACCACCCTGTTGCTGTA

Creb-FP:AGCAGCTCATGCAACATCATC

Creb-RP:AGTCCTTACAGGAAGACTGAACT

Crem-FP:ATGTCTTGAAAATCGTGTGGCT

Crem-RP:TGGCAATAAAGGTCTTTGAGGG

IL-2-FP:TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG

IL-2-RP:GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC

1、RNA的提取

(1)将胸腺组织置于2ml离心管中，每50-100mg组织中加入1ml Trizol，匀浆10-15s, 此步骤需在冰上进行。

(2)匀浆后，每1ml Trizol中加入200ul氯仿，快速震荡10s至充分混匀，冰上静置5min，12000rpm，4℃离心15min。取出可观察到液体分层，将上层水相用移液枪转移至干净的1.5ml离心管中。

(3)向上层水相中加入等体积己预冷的异丙醇，混匀后置于冰上静置15min，而后12000rpm，4℃离心10min，弃上清，将离心管倒置于无菌滤纸上，待异丙醇充分挥发。 (4)再向离心管中加入1ml己预冷的75％乙醇，7500rpm，4℃离心洗涤10min，弃上清，倒置于无菌滤纸上快速干燥。

(5)向干燥沉淀中加入50ul无酶水，取出适量用于浓度检测，其余保存于-80℃。

2、测RNA浓度

取1ul RNA溶液用紫外分光光度计进行检测，记录浓度(ng/ul)以及A260、A280 以及两者比值。两者比值即为纯度，纯度应在1.8-2.1为宜。若RNA溶液浓度过高，可适当稀释后再次检测。

3、逆转录反应

(1)根据所测浓度按1ug定量计算RNA体积，按以下方法加入相应体积的试剂到新的八联管中：

RNA量 1ug

5*gDNA digester 3ul

加无酶水至 15ul

结束后42℃孵育2min。再加入4*HifairⅢSuperMix5ul，混匀后按以下程序反应：25℃-5min；55℃15min；85℃5min

反应结束后，置于4℃环境保存，可直接或按一定比例稀释后使用。

4、实时荧光定量PCR

反应体系

尽量在避光条件下进行下述操作：

总计20ul

反应体系如下：

95℃(1min)—95℃(5s)—58℃(30s)—72℃(30s)，反应周期40个循环。

结果分析

计算公式如下：

Relative Expression Value＝2

(8)小鼠胸腺WB检测crem、creb的蛋白表达

1、蛋白的提取

将离心管置于冰上预冷，将小鼠胸腺组织取出称重。按比例配置混合裂解液，具体比例如下：RIPA裂解液：蛋白酶抑制剂：PMSF＝100：100：1，混合均匀置于冰上。按比例向胸腺中加入混合裂解液，在冰上操作匀浆，上下移动10次左右。12000rpm， 4℃离心10min。将上清液转移至干净的离心管中，取出适量蛋白溶液待测浓度，其余保存至－80℃，注意使用过程中避免反复冻融。

2、BCA工作法测蛋白浓度

按说明书进行操作，先溶解蛋白标准品至25mg/ml，再用标品稀释液稀释适量蛋白标准品至0.5mg/ml待用。按50:1将试剂A和B充分混匀制成工作液待用。取洁净的 96孔板，按说明说步骤加样，具体如下：按顺序向96孔板中加入0、1、2、4、8、12、 16、20ul 0.5mg/ml的蛋白标准溶液，并用稀释液将每孔补足至20ul。使标准品浓度依次为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。取样本蛋白溶液依次向空白孔中加入2ul，每个样品做三个复孔，用稀释液将每个孔补足至20ul。每孔中加入200ul工作液，37℃避光反应20min。设置酶标仪波长562测量OD值，根据样品浓度绘制标准曲线，R

3、配置SDS-PAGE胶并上样

SDS-PAGE胶配方

用超纯水清洗配胶用具以及玻璃板并晾干。将玻璃板对其卡紧置于配胶上。将适量纯水注入两块玻璃板之间，测试是否存在漏液，确认不漏液后弃纯水。按照上述配方配置适量10％分离胶，充分混匀后迅速注入防止其凝固于离心管中，避免产生气泡，静置30-40％等待凝固。按上述比例配置5％浓缩胶，待分离胶完全凝固后注入，迅速插入梳子，防止产生气泡，室温静置30min至完全凝固。配胶完成后，将其放于电泳槽中，加入适量的电泳液，小心拔出梳子，再加入适量电泳液使上样孔中气泡排除，等待上样。

4、Western-Blot方法

(1)电泳：调电压至60V，空跑10min观察电泳液中气泡运行是否正常，上样后，调电压至65V，待样品跑过浓缩胶后，调电压至85v，直至电泳结束，注意观察电泳情况防止蛋白跑出界。

(2)转膜：预先将PVDF膜浸入无水乙醇中激活，并用转膜液浸泡滤纸和海绵。转膜夹放置顺序由下至上为：转膜夹红色面、海绵、滤纸、PVDF膜、胶、滤纸、海绵、转膜夹黑色面。注意仔细排空气泡，将其夹好后放于转膜槽中，加快速转膜液，，恒流情况下400mA，40min进行转膜。

(3)封闭：转膜结束后取出，将膜放入5％BSA溶液中封闭，室温摇床缓慢震荡孵育2h。

(4)一抗孵育：用5％BSA稀释一抗，将膜从封闭液中取出放入稀释好的一抗溶液中，4℃环境下于摇床上缓慢震荡过夜孵育。

(5)洗膜：回收一抗溶液后使用TBST溶液清洗3次，每次摇床缓慢震荡10min。

(6)二抗孵育：用5％BSA溶液稀释二抗，将膜置于二抗溶液中，室温下于摇床上缓慢震荡孵育1h。

(7)洗膜：使用TBST溶液清洗3次，每次摇床缓慢震荡10min。

(8)显影：按比例将发光液A和B混匀后，在暗室中取适量滴于膜上，曝光即得。

(二)实验结果

2.1绞股蓝皂苷可以恢复吗啡所致小鼠体重下降的情况，改善小鼠因免疫抑制所致的器官萎缩，使胸腺指数恢复正常。

如图1为吗啡免疫抑制造模时小鼠体重情况：与正常小鼠相比吗啡长期注射后小鼠的体重出现了显著下降，而经过绞股蓝皂苷治疗后可发现如图2所示，绞股蓝皂苷可以使小鼠的体重恢复至正常水平，第七天时中剂量组恢复情况最为明显。

各小组小鼠胸腺指数情况如图3所示，小鼠腹腔注射吗啡后，其中枢免疫器官胸腺明显萎缩，其胸腺指数明显下降，讲过绞股蓝皂苷治疗后可以恢复至正常水平。

2.2绞股蓝皂苷增加小鼠胸腺T淋巴细胞及其亚群的占比

我们通过流式细胞术对各组小鼠胸腺细胞进行了分析，各小组小鼠胸腺T淋巴细胞的占比示意图如图4所示。与正常组小鼠相比，吗啡造模组小鼠的胸腺T淋巴细胞出现了显著下降，而绞股蓝皂苷可以增加下降的T淋巴细胞占比，尤其是中剂量的绞股蓝皂苷可以使其恢复至正常水平，其具体数据分析图如图5所示。同样，各小组小鼠胸腺T淋巴细胞亚群CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-的占比示意图如图6和图8 所示，吗啡造模组会使其显著下降，而绞股蓝皂苷可以恢复其下降情况，中剂量组可使其恢复至正常水平，其具体数据分析图如图7和图9所示。另外通过胸腺HE染色 (图10)进一步证明吗啡可以使胸腺髓质区域显著减少，胸腺髓质是生成T淋巴细胞的区域，而绞股蓝皂苷可以使髓质部分增加，同样是中剂量的绞股蓝皂苷作用最好。由上述结论可知，中剂量的绞股蓝皂苷对吗啡的免疫抑制作用改善最为明显。

2.3绞股蓝皂苷改善吗啡所致胸腺T淋巴细胞减少可能通过cAMP-creb/crem-IL-2通路进行调节。

吗啡是阿片类药物的典型代表，其主要作用于μ阿片受体，激活μ阿片受体后，可使下游cAMP表达升高。我们通过对小鼠胸腺进行ELISA检测cAMP蛋白表达，其结果如图11所示，吗啡组可使胸腺cAMP表达明显升高，而中剂量的绞股蓝皂苷可以使cAMP表达水平恢复至正常水平。这表明绞股蓝皂苷改善吗啡的免疫抑制作用与 cAMP信号通路相关。

我们又通过ELISA和q-PCR对小鼠胸腺IL-2的蛋白和mRNA表达水平进行了分析，结果无论是从翻译水平还是转录水平都表明吗啡可使胸腺IL-2表达下降，而中剂量的绞股蓝皂苷可增高其表达水平(图14和图15)。

转录因子crem和creb对IL-2的转录至关重要，creb表达的减少可直接影响IL-2的转录与表达。通过WB实验和q-PCR实验分析了cAMP下游转录因子crem和creb 的表达，结果如图12和图13所示，吗啡可使cAMP下游转录因子crem表达升高，而 creb表达下降，而中剂量的绞股蓝皂苷可使crem表达下降，使creb的表达水平恢复至正常水平。

综上所述，我们的研究表明，吗啡滥用可导致体重下降、免疫器官萎缩、胸腺指数降低，中剂量的绞股蓝皂苷可以使体重恢复，同时改善胸腺萎缩情况，使胸腺指数恢复至正常水平。另外中剂量绞股蓝皂苷可以恢复因吗啡所致下降的胸腺T淋巴细胞及其亚群的占比，使免疫细胞占比情况恢复至正常水平，改善受损的免疫系统；而这种改善作用可能是通过与cAMP-crem/creb-IL-2信号通路有关。

本发明提供了绞股蓝皂苷用于制备戒毒药物中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。