一种来自甘蔗杆状病毒的组成型启动子PSCBV-CHN1及其应用

摘要

本发明提供了一种来自甘蔗杆状病毒的植物组成型启动子及其应用，所述启动子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明通过检测转基因洋葱、转基因甘蔗、转基因拟南芥中外源EYFP和GUS基因的表达情况，证实了所述启动子是一种组成型启动子，能启动外源基因在植物根、茎、叶中高效表达。因此，所述启动子可用于制备转基因植物和进行植物转基因育种，可作为构建植物重组表达载体的元件，在改变植物抗性性状及植物转基因育种方面具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程和植物遗传育种技术领域，具体涉及一种来自甘蔗杆状病毒的 组成型启动子P

背景技术

植物基因工程技术是将外源基因导入受体植物细胞并使其正确有效地表达，达到改变植 物抗性性状或快速培育植物新品种的目的。植物基因工程技术在培育植物优质新品种中具有 巨大潜力，但是，该过程受到多种影响因子的制约，启动子序列是外源基因能否有效表达的 关键。

由于植物的固着性，外界生物及非生物的胁迫会诱导植物体内各类免疫应答，抗性相关 基因的转录及其后期蛋白的表达对植物应对生存挑战至关重要。基于基因工程技术的各种来 源的启动子的应用可有效提高植物抗性蛋白表达，目前已被广泛用于植物的品质改良、抗病 品种的选育以及植物生物反应器等。植物自身启动子(如Actin、Ubi等)、花椰菜花叶病毒 启动子35S启动子(CaMV 35S)以及根癌农杆菌T-DNA的胭脂碱合成酶基因的NOS启动子 等在不同植物基因改良方面的广泛应用大大推动了植物的遗传进程，有利于提高植物的适应 性。

甘蔗(Saccharum spp.hybrids)是世界最主要的糖料作物，现代商业甘蔗栽培种(甘蔗杂 交种)起源于20世纪初种间杂交，即将甘蔗热带种作为高贵种与割手密杂交的高贵化育种研 究。最初的种间杂交为建立现代甘蔗杂交育种基础提供了高糖、高抗品种，但由于在高贵化 育种进程中应用的基因型有限，导致现代甘蔗栽培种普遍存在遗传背景狭窄，成为限制甘蔗 育种进一步提高产量及提升生物/非生物胁迫抗性的主要障碍。传统的甘蔗杂交育种方法已被 广泛应用于甘蔗品种遗传改良，但该方法费时、费力。转基因技术作为高效的甘蔗遗传改良 手段，对于改良主要商业甘蔗品种及种质资源品质、抗性等性状具有重要意义。

病毒编码的启动子应用于高等植物转基因表达是植物遗传工程的重要方法，对其启动子 的研究则成为探索植物基因表达的重要切入点之一，挖掘更多病毒来源的启动子对现代遗传 育种技术具有十分重要的意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段作 为植物组成型启动子的应用。所述DNA片段具有强启动子活性，可高效地驱动目的基因在 单双子叶植物中进行表达，有利于农作物抵御生长过程中的各类病虫害和逆境胁迫，有效的 提高农作物种质质量。

实现上述目的的技术方案如下。

本发明提供了含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段在作为植物组成型启 动子中的应用。

本发明还提供了含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段或表达盒或重组表 达载体在调控目的基因在植物内表达中的应用。

在其中一些实施例中，所述表达盒包括以可表达的方式彼此连接的如SEQ ID NO：1所 示的核苷酸序列、由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列驱动表达的目的基因和终止子。

在其中一些实施例中，所述重组载体为P

所述P

所述P

在其中一些实施例中，所述目的基因为杀虫基因、抗病基因、抗逆基因、除草基因或报 告基因。

在其中一些实施例中，所述报告基因为EYFP或GUS基因。

本发明还提供了含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段或的表达盒或重组 表达载体在在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供了含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段或表达盒或重组表 达载体在植物转基因育种中的应用。

在其中一些实施例中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

在其中一些实施例中，所述植物为洋葱、甘蔗或拟南芥。

本发明还提供了一种在植物中表达外源基因的方法，包括将含有如SEQ ID NO：1所示 的核苷酸序列的DNA片段或表达盒或重组载体导入植物中，并通过筛选获得转基因植物。

在其中一些实施例中，将上述的启动子或表达盒或重组载体导入植物中的方法为农杆菌 侵染法。

在其中一些实施例中，将上述的启动子或表达盒或重组载体导入植物中的方法为基因枪 法。

本发明还提供了一种扩增如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物对，其包括如SEQ ID NO：4所示的上游引物(P

本发明还提供了如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的制备方法，包括以下步骤：以SCBV-CHN1基因组基因组DNA为模板，利用上述引物对通过PCR扩增获得。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系如下：2×PrimeSTAR Max Premix25.0 μL，10μM P

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共35个扩增循环；最终72℃延伸7min。

本发明经过研究首次发现，如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段可高效地驱 动目的基因在植物各个组织中进行表达，其来源于甘蔗杆状病毒(Sugarcanebacilliform virus， SCBV)，是一种强表达组成型启动子。因此，将其作为构建植物表达载体的元件连接在目的 基因之前，可高效驱动目的基因在植物不同组织中表达，有利于农作物抵御生长过程中的各 类病虫害和逆境胁迫。本发明中的DNA片段来源于侵染甘蔗的SCBV病毒基因组，由于与 植物基因组序列没有同源性，所以能够避免基因沉默现象的发生，在改变植物抗性性状及植 物转基因育种方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为P

图2为启动子P

图3为P

图4为P

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术 人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目 的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包 含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可 选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它 步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表 示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本发明首先以感染了SCBV-CHN1的甘蔗品种ROC27的叶片DNA为模板克隆获得含SCBV-CHN1基因组片段序列的阳性克隆质粒，然后以其为模板进行PCR扩增，将扩增产物 纯化后连接到

所述DNA分子全长855bp，经过生物信息学分析其可能具有启动子活性，与SCBMOV-MOR、SCBIMV-QLD和SCBV-TX分离物的启动子序列核苷酸一致性差异显著， 分别为43.7％、54.4％和57.7％。发明人预测其是一种具有启动子活性，并将其命名为 P

发明人进一步构建获得了含有所述P

发明人还将P

SEQ ID NO：1：

5’-AAGAACCAACTCTGCTATGTGCATGCAGAAAGCCAGCAATTCTGCTAAGTTCGG GAACTTCAAGAAACCCGAAACGAAGATTTTTCAAGTGTGCACTAAACAATTGCCATTGT TGGTACTGGCAGGATTTACTGGAGGAATACGTTCAAGATCGCATTGACGAGTTCATGCG AGAAAACTTTGATAAAACAAGAGAGGAACCAAAAGTGATCAACCCGGTTCCAAAACAT TTTGTTTCTCTTCTTGATTTGCAGAAACAAAAGGAGGAAGAAGACCCCCTCGAAAACCTGCGGTCAAGTGTCATCGACAGGCTAAGGCCTTCAGATGAACATTTCAATCCAGGGTACA TGTACCCCCTGAAGAACAGTCTGACGAAGATCCAGGACGACTACGCAAGCCCATCAAG TTCACCAGACTGGAATGAGCTGGACCTCCTGTGCTACGAGGACGAAGCTGAAGCCTATG GAGAACCACTACTCGTACGCCTAGAAGATGCTCTAGACCTCAACGACGTAAGCAATGAC GACCAATGGAGATAAACGTAAGCCATGACGTCTGCAGCGGAGCATGAAGGACCCATTCA GTGGCATCCACTGAGTCGGAATCTCAACTTTCGGTTGTGAGTGCGGTGTGAGTGCGTTA GGTGCGGAGCACCTTTGTACCCGAGTTTGCTTTCGGCGCCTGTGCCAACTTTATTCCTTG TCGGCCACGTTGCCTTTGCTTAGCCTCGACGCAAAGCATAGCGCTCGGCCAGACCGTGT GTGGTTGTGGTGTGTCCCGGGAGCCTATATAAGGCAACCGATGTAAGCTCTTACGATCAT CGGTAGTTCACCAGCTGATCATTTGAGCTCTTTG-3’

本领域技术人员应当理解，对如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加 一个或几个核苷酸，例如，在非应答元件或作用元件，替换一个或几个碱基，获得具有相同 功能的核苷酸序列，属于本发明的保护范围。

本发明构建的植物双元表达载体P

本发明构建的植物双元表达载体P

本发明中P

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施 例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1 SCBV-CHN1启动子核苷酸序列的克隆

1-1实验材料

从中国福建采集感染SCBV-CHN1的甘蔗品种ROC27叶片样品。叶片采自蔗田甘蔗+1叶(最高可见肥厚带叶片)，带回实验室后，经75％酒精清洁消毒处理后，置于自封袋中，于-80℃超低温冰箱保存。

1-2甘蔗叶片总DNA提取

甘蔗叶片总DNA提取方法采用改良CTAB法(Sun et al.,2016)。总DNA吸光度和浓度通过美国NanoVue超微量分光光度计(GE Healthcare)蛋白质核酸分析仪测定，并电泳检测总DNA完整性。

1-3 SCBV-CHN1基因组克隆

依据Genbank数据库目前已公布的两条SCBV基因组序列，通过Primer Premier 5软件设 计1对简并引物SCBV-F5603：5’-GAAGAGYGGSTTTCATCAAGT-3’(SEQ ID NO：2)和SCBV-R1002：5’-CTCCGCTTCAGGTATTCCA-3’(SEQ ID NO：3)，用于克隆SCBV基因 组序列，预期目的片段大小约为3000bp。以200ng总DNA为模板，采用LA Taq试剂盒 (TaKaRa，中国)进行PCR扩增。PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg

1-4 SCBV-CHN1启动子克隆

根据获得的SCBV-CHN1基因组片段序列，通过生物信息软件进行预测，选取启动子同 源核苷酸序列片段，设计启动子片段克隆引物P

实施例2 P

2-1 EYFP表达载体构建

植物表达载体骨架的制备：利用快速限制性内切酶XhoI和NcoI(Fermentas，美国)对 P

PCR扩增：通过无缝克隆引物设计工具(http://123.56.75.195/)设计扩增启动子P

载体连接：通过In-Fusion试剂盒(TaKaRa，中国)进行连接，将加有接头的SCBV启动子序列连接到上述经双酶切后的GUS基因表达载体中。10μL连接反应体系包含2μL 5×In-Fusion HD enzyme Premix，2μL线性化质粒载体和4μL PCR产物。将上述连接混合液 轻弹混匀，50℃水浴15min，后置于冰上，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，涂布于含 有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃暗培养12h，挑取单克隆菌落，经菌液PCR 鉴定后，送3个阳性克隆子进行测序，获得重组质粒P

2-2 GUS表达载体构建

利用快速限制性内切酶HindШ和BamHΙ(Fermentas，美国)线性化P

实施例3 P

3-1洋葱鳞片表皮制备和质粒转化

洋葱用无菌水洗净，在75％酒精中浸泡1min；去除洋葱顶部与基部切及两层外层洋葱鳞 片；将洋葱对半切四次，取外面三层，撕下洋葱鳞片内表皮，切成约2cm

如图2所示，与对照P

3-2拟南芥原生质体制备和质粒转化

野生型拟南芥叶片原生质体制备和PEG-CaCl

(1)取大小合适的叶片，切成0.5～1.0mm的细条，浸没在配制好的酶解液中，常温黑 暗条件下进行酶解，约3～4h，期间进行轻微摇晃，充分酶解；

(2)加入等体积4℃预冷的W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl

(3)利用75μm大小的尼龙网过滤到50mL的圆底离心管中；

(4)1400rpm水平离心2min后，迅速倒掉上清液，避免原生质体的损失；

(5)加入10mL W5溶液(4℃预冷)，清洗沉淀；

(6)1400rpm水平离心2min后，迅速倒出上清，加入10mL W5溶液(4℃预冷)， 避光冰浴30min；

(7)用移液枪轻轻吸去上清液后，加入10mL MMG溶液(0.4M Mannitol，15mMMgCl

(8)另取2.0mL离心管，加入20μL(1000ng/μL)质粒后，加入200μL的原生质体；

(9)加入220μL的PEG/Ca

(10)静置5min后，加入5倍体积(原生质体+质粒体积的5倍)的W5溶液，轻柔混 匀；

(11)1400rpm水平离心2min后，吸去上清液，加入150μL的W5溶液后，轻柔混匀。

(12)用5％溶度的BSA封闭晾干6个孔的酶标板(进口的细胞培养板不用事先加入BSA 润洗和封闭)，之后，加入1mL WI溶液和150μL上述步骤的质粒转化原生质体溶液到酶标 板中；

(13)将上述酶标板置于白纸上，于室温下进行孵育培养16-18h；

(14)在激光共聚焦显微镜(蔡司LSM880，德国Zeiss公司)下观察转P

如图2所示，与对照P

3-3甘蔗嫩叶组织制备和基因枪轰击

(1)甘蔗嫩叶组织制备

取生长正常且无病虫害的甘蔗(ROC22)植株梢部，去除梢部叶片和蔗茎，留20～30cm 长的组织，用体积比75％酒精溶液消毒后，移入无菌的超净工作台。剥去-1和-2叶及以外的 叶片，取-3和-4嫩叶，去除中脉后将基部幼嫩叶片切成2cm×2cm的小方块，平铺于MS固 体诱导培养基上，上表面朝下。小方块幼嫩叶片在28℃条件下暗培养3～5天后，即可作为 甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料。

(2)基因枪轰击

将P

如图2所示，与对照P

以上结果表明，启动子P

实施例4拟南芥稳定表达材料制备和GUS蛋白活性测定方法

4-1质粒转化农杆菌感受态细胞

将上述提取保存的质粒P

4-2拟南芥转化及转基因苗筛选

具体步骤如下：(1)取上述阳性农杆菌菌液10μL到10mL LB液体培养基(50μg/mL的卡那霉素和利福平)中，28℃，200rpm/min过夜活化；(2)将10mL农杆菌菌液接种到 200mLLB液体培养基(50μg/mL的卡那霉素和利福平)中，28℃，200rpm/min活化至OD

4-3 GUS组织化学染色

GUS染色缓冲液：50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)，0.5mM K

GUS终止反应液：0.2M Na

GUS反应液：50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)，10mM Na

GUS组织化学染色参考Jefferson等(1987)的方法进行：将转基因拟南芥浸泡于GUS 染色缓冲液中，37℃染色6～12h，70％乙醇脱色直至脱色完全，观察并照相。

如图3所示，P

4-4 GUS蛋白活性分析

(1)溶液配制：4-甲基伞形酮(4-MU)1mM的母液：称取0.04404g 4-MU用GUS终 止反应液定容到250mL；4-MU 1μM的母液：将0.5mL 1mM的4-MU母液稀释至500mL。

(2)GUS蛋白的提取：植物粗蛋白的提取通过植物蛋白提取试剂盒(索莱宝，北京)完成，将拟南芥组织材料用液氮研磨成粉后，加入1mL的提取液混匀，冰上放置20min， 期间每隔5min震荡1次，于4℃，14000rpm离心30min，吸取上清至新的离心管中备用。

(3)蛋白浓度的测定：采用BCA法蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝，北京)完成。配制不同浓度梯度的BSA(0μg/μL、0.0625μg/μL、0.125μg/μL、0.5μg/μL、1μg/μL以及2μg/μl 梯度液)，每浓度梯度吸取20μL到96孔板中，分别加入200μL BCA工作液(BCA:Cu

(4)GUS荧光测定：以1μM 4-MU作为荧光标准物，配置不同浓度梯度的4-MU(0nM、50nM、100nM、200nM、400nM、600nM、800nM和1000nM)，每浓度梯度吸取200μL 至酶标板中，去除气泡后，利用酶标仪在激发光365nm，发射光455nm的条件下测定不同 浓度梯度下4-MU的荧光值，每个浓度梯度3次重复，根据荧光值与对应的浓度绘制4-MU 的标准曲线。取20μL样品粗提蛋白液，加入480μL GUS反应液，混匀后于37℃孵育，分 别在0min和60min各取100μL反应液，迅速加入到0.9mL的GUS终止反应液中终止反应， 取200μL至酶标板中，去除气泡后，利用酶标仪在激发光365nm，发射光455nm的条件下 测定样品荧光值。根据4-MU的标准曲线计算样品的中GUS蛋白的活性。

GUS酶活性测定结果如图4所示，P

以上实施例仅公布了在洋葱、甘蔗、拟南芥中外源EYFP和GUS基因在植物中受启动子 P

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中 的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。 因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东省科学院南繁种业研究所

<120> 一种来自甘蔗杆状病毒的组成型启动子PSCBV-CHN1及其应用

<130> 2022-02-19

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 855

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aagaaccaac tctgctatgt gcatgcagaa agccagcaat tctgctaagt tcgggaactt 60

caagaaaccc gaaacgaaga tttttcaagt gtgcactaaa caattgccat tgttggtact 120

ggcaggattt actggaggaa tacgttcaag atcgcattga cgagttcatg cgagaaaact 180

ttgataaaac aagagaggaa ccaaaagtga tcaacccggt tccaaaacat tttgtttctc 240

ttcttgattt gcagaaacaa aaggaggaag aagaccccct cgaaaacctg cggtcaagtg 300

tcatcgacag gctaaggcct tcagatgaac atttcaatcc agggtacatg taccccctga 360

agaacagtct gacgaagatc caggacgact acgcaagccc atcaagttca ccagactgga 420

atgagctgga cctcctgtgc tacgaggacg aagctgaagc ctatggagaa ccactactcg 480

tacgcctaga agatgctcta gacctcaacg acgtaagcaa tgacgaccaa tggagataaa 540

cgtaagccat gacgtctgca gcggagcatg aaggacccat tcagtggcat ccactgagtc 600

ggaatctcaa ctttcggttg tgagtgcggt gtgagtgcgt taggtgcgga gcacctttgt 660

acccgagttt gctttcggcg cctgtgccaa ctttattcct tgtcggccac gttgcctttg 720

cttagcctcg acgcaaagca tagcgctcgg ccagaccgtg tgtggttgtg gtgtgtcccg 780

ggagcctata taaggcaacc gatgtaagct cttacgatca tcggtagttc accagctgat 840

catttgagct ctttg 855

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gaagagyggs tttcatcaag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ctccgcttca ggtattcca 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aagaaccaac tctgctatgt gcatg 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

caaagagctc aaatgatcag ctg 23

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cgggcccccc ctcgagaaga accaactctg ctatgtgcat g 41

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cccttgctca ccatggcaaa gagctcaaat gatcagctg 39

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ggccagtgcc aagcttaaga accaactctg ctatgtgcat g 41

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gaccacccgg ggatcccaaa gagctcaaat gatcagctg 39