一种基于离子液体的生物催化体系生产α-熊果苷的方法

摘要

本发明涉及一种基于离子液体的生物催化体系生产α‑熊果苷的方法，属于酶工程技术领域。该方法包括将离子液体加入α‑糖苷酶中，获得超分子催化剂；将所述超分子催化剂加入对苯二酚和蔗糖的混合反应体系，进行催化反应；所述离子液体为甜菜碱壬二酸。本发明基于离子液体和α‑熊果苷合成酶的结合建立了超分子催化体系，大幅提升了熊果苷的产量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于离子液体的生物催化体系生产α-熊果苷的方法，属于酶工程技术领 域。

背景技术

α-熊果苷是一种重要的美白原料，作为源自植物的天然酪氨酸结构类似物，能够有效抑 制酪氨酸酶的活性，是一种天然、高效的酪氨酸酶抑制剂，目前已被广泛用于化妆品和医药 领域：(1)在化妆品行业，熊果苷是一种重要的皮肤美白原料，其不仅对皮肤的雀斑、老人 斑、黄褐斑有消褪作用，而且对皮肤的滋润、皮肤灼伤后的愈合和粉刺等也颇有疗效；(2) 在医药方面，熊果苷对于人体色素沉着病和黑色素瘤也具有特殊的疗效，是临床上应用最为 广泛的治疗药物。

随着人们对α-熊果苷的深入研究，多项研究结果表明α-熊果苷在生物活性上，相较于 β-熊果苷具有一系列优势。因此，近年来，α-熊果苷开始逐步开始取代β-熊果苷，成为了 新一代熊果苷产品。

在生物法合成α-熊果苷方面，已有研究表明通过植物细胞培养技术，包括棘胸蛙、骆驼 蓬人参等植物细胞培养物，以对苯二酚为底物，能合成细胞干重7％的α-熊果苷，对苯二酚 转化率最高为80％。另外，更多研究着手于微生物的酶法转化生产α-熊果苷，如表1所示。 2002年，日本研究小组报道用野油菜黄单胞菌wu-9701冻干细胞作为生物催化剂，麦芽糖作 为葡萄糖供体，α-熊果苷产量达到10.8g/L。2013年，也有国内课题组报道利用嗜麦芽黄单 胞菌，以麦芽糖为糖基供体，α-熊果苷产量提高到30.6g/L。可见，采用微生物细胞或相应 的酶制剂法生产α-熊果苷，具有周期短、得率高和产率高的特点，可规模化生产。

表1α-熊果苷的酶法或微生物法转化

a:Nishimura T,et al.J Ferment Bioeng 1994,78:31–36；

b:Kurosu J,et al.J Biosci Bioeng.2002；93(3):328-30；

c:

d:Liu CQ,et al.World J Microbiol Biotechnol.2013,29(8):1391-1398；

e:Kitao S,et al.Biosci Biotechnol Bi℃hem 1994,58:38–42；

f:Seo ES,et al.Enzyme Microb Technol 2009,45:355–360；

g:Seo DH,et al.Appl Microbiol Biotechnol 2012,94:1189–1197。

从上述文献报道可见，生物法合成的熊果苷的产量相较于化学合成法还具有较大的差距。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种基于离子液体的生物催化体系生产α- 熊果苷的方法，主要基于离子液体和α-熊果苷合成酶的结合建立了超分子催化体系，大幅提 升了熊果苷的产量。

本发明的技术方案如下。

本发明提供一种高效生产熊果苷的方法，所述方法包括将离子液体加入α-糖苷酶中，获 得超分子催化剂；将所述超分子催化剂加入对苯二酚和蔗糖的混合反应体系，进行催化反应； 所述离子液体为甜菜碱壬二酸。

进一步地，所述甜菜碱壬二酸的添加量为1％-3％。

更进一步地，所述甜菜碱壬二酸的添加量为2％-3％。

进一步地，所述α-糖苷酶以含α-糖苷酶的纯化蛋白、粗酶液或细胞的形式存在。

更进一步地，所述α-糖苷酶以粗酶液的形式存在；所述粗酶液是利用大肠杆菌高密度发 酵生产制得。

更进一步地，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：

(1)活化大肠杆菌CGMCC No.13992，得到活化后的种子液；

(2)将步骤(1)得到的种子液接种到发酵培养基中进行高密度发酵；

(3)利用步骤(2)得到的发酵液制备粗酶液。

更进一步地，所述步骤(1)具体包括：将大肠杆菌CGMCC No.13992接种到LB平板，35℃-40℃培养8-15h；挑取单菌落，接种到LB液体培养基，35℃-40℃，200-220rpm培养 8-15h；将培养液按1％-5％的接种量转接至种子液培养基中，35℃-40℃，200-220rpm培养 2-5h，得到种子液。

更进一步地，所述步骤(2)具体包括：将所述种子液以体积浓度1％-5％的接种量接种 到发酵培养基中，控制pH 6.5-7.5，溶氧DO值大于30％，35℃-40℃培养3-5h后；加入终浓 度为10-30g/L的α-乳糖，同时补加10-30g/L的甘油，控制发酵温度20℃-30℃，控制pH6.5-7.5， 溶氧DO值大于30％，继续发酵10-30h。

更进一步地，所述步骤(3)具体包括：将发酵液离心收集细胞后，用去离子水重新悬浮 细胞，使湿菌体的含量为8-12g/L；破碎细胞后，离心处理，去除细胞碎片，得到澄清的粗 酶液。

进一步地，所述对苯二酚与蔗糖的浓度之比为1：50-80。

更进一步地，所述对苯二酚与蔗糖的浓度之比为5.5-7.5g/L：400g/L。

进一步地，所述催化反应的条件为25-35℃，pH 6.5-7.5。

更进一步地，所述催化反应的具体条件为：取50mL的α-糖苷酶粗酶液，加入终浓度6.6g/L的对苯二酚和400g/L的蔗糖；加入2％甜菜碱壬二酸，调节pH 7.0，在30℃，催化反应0.5h；补加对苯二酚至5.5g/L；接着每个0.5-1.0h取样分析一次对苯二酚的浓度，将对苯二酚的浓度控制在5.5g/L；持续反应20h后，不再补加底物对苯二酚，并取样分析对苯二酚的浓度，直至其浓度小于1.0g/L。

与现有技术相比，本发明技术方案带来的有益技术效果主要有：

本发明通过将离子液体与酶特异性结合，降低了对苯二酚对酶的抑制作用，增大了底物 投料量，在反应过程中补加底物，熊果苷的产量大幅提升，熊果苷浓度可达到198.6g/L。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

LB培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为去离子水，pH值6.5-7.0。

种子培养基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO

发酵培养基质量终浓度组成：酵母粉12g/L、蛋白胨15g/L、甘油10g/L、Na

实施例1具有高效合成2-α-GG的α-糖苷酶的制备

1.菌种活化

取甘油管菌种大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC No.13992(菌种来源参考发明专利 CN 107400653B)，将其划线到含有50mg/L的卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。挑取单 个菌落，接种到含50mg/L的LB液体培养基，37℃，200rpm摇床中过夜培养。取过夜活化培养的种子液，按1％的接种量(v/v)，转接至含50mg/L的种子液培养基中，37℃，200rpm 摇床中培养3h，作为活化的种子液。

2.α-糖苷酶的发酵

将上述新鲜培养的种子液以体积浓度2％的接种量(v/v)接种到含50mg/L卡那霉素的 发酵培养基中，控制pH6.8，溶氧DO值大于30％，37℃培养4h后；加入终浓度为20g/L的α-乳糖，同时补加20g/L的甘油，控制发酵温度25℃，控制pH6.8，溶氧DO值大于30％， 继续发酵15h，获得含有湿菌体36g/L的发酵液，用于制备粗酶液。

3.α-糖苷酶粗酶液的制备

将大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC No.13992的上述新鲜发酵液，离心收集细胞后， 用3倍体积的去离子水重新悬浮细胞，使湿菌体的含量约为10g/L。采用高压细胞匀浆仪破 碎细胞后，离心处理，去除细胞碎片，得到澄清的粗酶液。需尽快用于催化反应，避免长时 间保存。

4.α-糖苷酶粗酶液的α-熊果苷合成酶活性检测

取20mL的上述的α-糖苷酶粗酶液，于100mL的圆底烧瓶中；加入终浓度5.5g/L的对苯二酚和400g/L的蔗糖，调节pH 7.0，在30℃，置于磁力搅拌的水浴锅中，催化反应0.5h。取催化反应液用于HPLC分析，测得底物对苯二酚的转化率为40％，说明催化活性正常。

实施例2α-糖苷酶粗酶液催化合成α-熊果苷

取50mL的上述的α-糖苷酶粗酶液于250mL的圆底烧瓶中；加入终浓度6.6g/L的对苯 二酚和400g/L的蔗糖；调节pH 7.0，在30℃，置于磁力搅拌的水浴锅中，催化反应0.5h；取样采用HPLC分析分析对苯二酚的浓度为4.06g/L；补加对苯二酚至5.5g/L；接着每个0.5-1.0 h取样分析一次，并将对苯二酚的浓度控制在5.5g/L；持续反应20h后，不再补加底物对苯 二酚，并取样分析对苯二酚的浓度，直至其浓度小于1.0g/L。最终测得产物熊果苷的浓度为 85.6g/L。

实施例3离子液体对酶活力的影响

在实施例1中的粗酶液中，加入1％不同的离子液体(苦参碱椰子油酸、苦参碱山茶油酸、 苦参碱水杨酸、甜菜碱水杨酸、甜菜碱壬二酸、甜菜碱椰子油酸)，按实施例1的方法分别 测定对苯二酚转化率，结果如表2所示。

表2离子液体种类对酶活力的影响

可见，甜菜碱壬二酸的加入，对反应有促进作用。

实施例4新型催化剂(离子液体&酶复合体)的制备

以甜菜碱壬二酸为后续考察对象，按实施例3考察催化剂添加量对转化率的影响，结果 如表3所示。

表3催化剂添加量对酶活力的影响

可见，甜菜碱壬二酸的加2％，对反应有最大的促进作用。

实施例5离子液体对酶的保护作用验证

取50mL的上述的α-糖苷酶粗酶液于250mL的圆底烧瓶中；加入终浓度6.6g/L的对苯 二酚和400g/L的蔗糖；加入2％的甜菜碱壬二酸(对照组不加)；调节pH 7.0，在30℃，置于磁力搅拌的水浴锅中，催化反应0.5h。分别加入不同浓度的对苯二酚，考察对苯二酚添加量对酶活力的影响，结果如表4所示。

表4对苯二酚添加量对酶活力的影响

从上表可见，甜菜碱壬二酸的加入，可以有效提高酶对于对苯二酚的耐受性，从而保持 酶活力。

实施例6超分子催化体系催化合成α-熊果苷

取50mL的上述的α-糖苷酶粗酶液于250mL的圆底烧瓶中；加入终浓度6.6g/L的对苯 二酚和400g/L的蔗糖；加入2％甜菜碱壬二酸，调节pH7.0，在30℃，置于磁力搅拌的水浴锅中，催化反应0.5h；取样采用HPLC分析分析对苯二酚的浓度为4.06g/L；补加对苯二酚 至5.5g/L；接着每个0.5-1.0h取样分析一次，并将对苯二酚的浓度控制在5.5g/L；持续反应20h后，不再补加底物对苯二酚，并取样分析对苯二酚的浓度，直至其浓度小于1.0g/L。最终测得产物熊果苷的浓度为198.6g/L。

可见，甜菜碱壬二酸的加入，对于该生物催化反应具有很好的促进作用，能够大幅提升 熊果苷的产量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。