高丽人参的品种筛选用指标物质及利用其的高丽人参品种的筛选方法

摘要

本发明涉及高丽人参的品种筛选用指标物质及利用该指标物质的高丽人参品种的筛选方法，并通过确认并分离非皂甙成分中的仅包含于高丽人参的品种的活性成分来提供高丽人参的品种筛选用指标物质，针对于冒充为高丽人参进行销售的产品，可通过分离纯化活性成分来判断是否为高丽人参，而无需使用现有的分子生物学方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高丽人参(korean ginseng)的品种筛选用指标物质(Indexmaterial)及利用该指标物质的高丽人参品种的筛选方法，更具体地，与多个人参种类相比，涉及一种利用仅高丽人参所含的活性成分的高丽人参的品种筛选用指标物质及利用该指标物质的高丽人参品种的筛选方法。

背景技术

人参(Panaxginseng Meyer)作为主要的东方的主药材之一，长期以来一直被用作改善疲劳和虚弱的主要治疗剂。天然生长于韩国和中国东北部的该植物通常被称为高丽人参(Koreanginseng)，目前以东北亚为中心在世界各地进行栽培。

至于人参的药理成分，1854年从西洋参的根分离出一种作为皂苷混合物的无形物质，并从此开始了对人参有效成分的科学研究。但有关人参的化学活性成分的正式研究开始于1957年，即随着苏联的布雷赫曼(Brekhman)强调皂苷配糖体(glycoside)为人参的药效成分，从而开始对皂苷进行了深入的研究，且直到19世纪60年代才在生物化学领域积极进行了许多研究。

发现大多数人参中具有多种活性成分，包括人参皂苷(ginsenoside)、多糖类(polysaccharides)、肽类(peptides)、基于聚乙炔的醇类(polyacetylenic alc ohols)及脂肪酸类(fatty acids)。

现代科学发现高丽人参的药理功效包括改善脑功能、减轻疼痛效果、癌症预防效果(包括抗肿瘤活性)、改善免疫功能、抗糖尿病效果、改善肝功能、调节血压、抗疲劳和抗压力效果、改善更年期障碍和性功能、抗老化效果(包括抗氧化)。

基于这种原因，高丽人参已成为全球最受瞩目的植物治疗剂。

人参根据起源(origin)和耕作(cultivation)而有各种名称。人参属(Panaxgenus)由17种(species)构成，其中，高丽人参(P.ginseng C.A.Meyer) 、中国参(P.notoginseng)及美国参(P.quinquefolium)的药效众所周知。

高丽人参大致分为三种种系：紫茎系、青茎系及黄果系。到目前为止，通过纯系分离育种方法(pure-lineSelection method)从三种纯系培养出了12个品种，紫茎系有连丰(Yunpoong)、高丰(Gopoong)、仙丰(Sunpoong)、仙云(S unwun)、仙原(Sunweon)、仙香(Sunhyang)、K-1、天一、天良(

到目前为止，作为用于筛选人参品种的分子生物学方法试过以下几种，包括随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、简单重复序列区间(inter-simpleSequence repeats，ISSR)、限制性片段长度多态性 (restriction fragmentlength polymorphism，RFLPs)及简单重复序列 (simpleSequence repeats，SSR)。

然而，这些方法缺乏再现性和可靠性，因此，有必要尽快防止将不是高丽人参的其他品种冒充成高丽人参以高价销售的扰乱市场秩序的行为。

现有技术文献

专利文献

(专利文献1)KR 10-1481723 B1

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，提供一种高丽人参的品种筛选用指标物质及利用该指标物质的高丽人参品种的筛选方法。

本发明的另一目的在于，通过确认并分离非皂甙成分中的仅包含于高丽人参的品种的活性成分来提供高丽人参的品种筛选用指标物质。

本发明又一目的在于，提供一种高丽人参品种的筛选方法，其中，针对于冒充成高丽人参进行销售的产品，可通过分离纯化活性成分来判断是否为高丽人参，而无需使用现有的分子生物学方法。

用于解决问题的手段

为了实现上述目的，根据本发明一实施例的高丽人参的品种筛选用指标物质为从高丽人参(Panaxginseng C.A.Meyer)提取物分离的分级提取物中所含的活性成分，上述活性成分为非皂甙成分，使用紫外线(UV)254nm的PAD检测仪测量超高效液相色谱(UPLC)图谱(spectrum)时，上述活性成分可在13. 3分钟处出现第一峰(peak)并在13.5分钟处出现第二峰(peak)。

上述活性成分可以为以下述化学式1表示的化合物：

[化学式1]

其中，

n及m彼此相同或不同，各自独立地为1至5的整数，

R

以上述化学式1表示的活性成分的摩尔质量可以为410至430g/mol。

上述活性成分可以为以下述化学式2表示的化合物：

[化学式2]

其中，

p为1至3的整数，

q为1至5的整数，

R

以上述化学式2表示的活性成分的摩尔质量可以为455至465g/mol。

上述高丽人参提取物使用70％的乙醇作为提取溶剂进行提取。

上述分级提取物使用甲醇作为分级提取溶剂来对使用70％的乙醇从高丽人参提取的提取物进行分级提取。

根据本发明的另一实施例的利用指标物质筛选高丽人参品种的方法包括： 1)从无法确认人参种类(Species)的多个人参组中分离出人参种类的样品的步骤；2)分别对分离的人参种类的样品进行粉末化，并利用提取溶剂制备人参提取物的步骤；3)通过对上述人参提取物进行分级提取来获得分级提取物的步骤；以及4)利用UV 254nm的PAD检测仪测量每种上述人参种类分离的分级提取物的超高效液相色谱图谱。上述UPLC图谱测量结果，包含在13.3分钟处出现的第一峰(peak)及13.5分钟处出现的第二峰(peak)的活性成分的人参为高丽人参(Panaxginseng C.A.Meyer)。

以下，进一步详细说明本发明。

根据本发明一实施例的高丽人参的品种筛选用指标物质为从高丽人参(Panaxginseng C.A.Meyer)提取物分离的分级提取物中所含的活性成分，上述活性成分为非皂甙成分，使用UV 254nm的PAD检测仪测量超高效液相色谱图谱时，上述活性成分在13.3分钟处出现第一峰(peak)并在13.5分钟处出现第二峰(p eak)。

由于人参已记录在本草学中，可知从很久以前就作为药用作物来使用。像这样，人参可以用作药用作物是因为人参中皂苷的物质所起的作用，人参中存在的皂苷成分专门被命名为人参皂苷。

一直积极进行着有关这些人参皂苷研究。有报道对所有起源的人参进行了皂苷成分分析，但实际上很难由此推测皂苷的起源。

因此，在本说明书中，选择了几种韩国国内及海外起源的人参并确认了可区分这些人参的非皂甙成分，尤其，确认了可筛选高丽人参(Koreanginseng，P anaxginsengC.A.Meyer)品种的指标物质。

上述活性成分为非皂甙成分，使用紫外线254nm的PAD检测仪测量超高效液相色谱图谱时，上述活性成分可在13.3分钟处出现第一峰(peak)并在13.5 分钟处出现第二峰(peak)

具体地，上述活性成分为以下述化学式1表示的化合物，摩尔质量为410 至430g/mol，优选为426.4g/mol：

[化学式1]

其中，

n及m彼此相同或不同，各自独立地为1至5的整数，

R

以上述化学式1表示的化合物的-OR

更优选为，以上述化学式1表示的化合物可以为以下述化学式3表示的化合物：

[化学式3]

另一个作为非皂甙成分的活性成分，可以为以下述化学式2表示的化合物，摩尔质量为455至465g/mol，优选为462.4g/mol：

[化学式2]

其中，

p为1至3的整数，

q为1至5的整数，

R

以上述化学式2表示的化合物中-OR

优选地，以上述化学式2表示的化合物可以为以下述化学式4表示的化合物：

[化学式4]

上述高丽人参提取物可通过常规的提取物的制备方法来制备。

具体地，可通过如下步骤来获得高丽人参提取物，包括：粉碎高丽人参的步骤；使用有机溶剂来浸出上述粉碎物的步骤；浸出试样后进行干燥的步骤；使用有机溶剂来再次浸出干燥的试样的步骤；浸出试样后进行干燥的步骤；使用水来进行浸出的步骤；以及进行浸出的步骤。

还可包括通过使用有机溶剂来对使用上述有机溶剂提取的提取物进行分级提取的步骤。

制备上述提取物的方法可以为超声波提取法、浸出法及回流提取法等本领域常规的提取方法。具体地，其可以为通过使用水、碳原子数为1至6的醇或其混合溶剂对通过清洗及干燥去除杂质的人参进行提取的提取物，其还可以是将上述溶剂依次用于试样来进行提取的提取物。

以100mL的碳原子数为1至6的醇为基准，上述回流提取法的条件为：天然产物的粉碎物10至30g；回流时间1至3小时；以及50至100％的碳原子数为1至6的醇。更具体地，以100mL的碳原子数为1至6的醇为基准，其条件为：天然产物的粉碎物10至20g；回流时间1至2小时；以及70至90％的碳原子数为1至4的醇。

上述浸出法的条件为：15至30℃；24至72小时；以及50至100％的碳原子数为1至6的醇。更具体为：20至25℃；30至54小时；以及70至80％的碳原子数为1至6的醇。

上述超声波提取法的条件为：30至50℃；0.5至2.5小时；以及50至100％的碳原子数为1至6的醇。具体为：40至50℃；1至2.5小时；以及70至80％的碳原子数为1至6的醇。

以试样的重量为基准，上述提取溶剂可使用2至50倍，更具体为2至20 倍。为了进行提取，可将试样置于提取溶剂中1至72小时以用于浸出，更具体地，可放置24至48小时。

提取后，提取物可通过依次使用新的分级提取溶剂来进行分级提取。分级提取时所使用的分级提取溶剂，即上述溶剂为选自由水、己烷、甲醇、丁醇、乙基乙酸(ethylacetic acid)、乙酸乙酯、二氯甲烷及其混合物组成的组中的一种以上，优选为甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷。

获得提取物或分级提取物后，还可使用浓缩或冷冻干燥等方法。

具体地，上述高丽人参提取物使用70％的乙醇作为提取溶剂进行提取。就上述分级提取物而言，使用甲醇作为分级提取溶剂来对使用70％的乙醇从高丽人参提取的提取物进行分级提取。

若使用上述提取溶剂及分级提取溶剂进行分离纯化，可对非皂甙化合物进行分离纯化，并可以确认上述非皂甙化合物中的仅高丽人参品种所含(其他人参品种未含)的活性成分，因此可用作高丽人参的品种筛选用指标物质。

本发明的另一实施例的使用指标物质筛选高丽人参品种的方法包括：1)从无法确认人参种类的多个人参组中分离出人参种类的样品的步骤；2)分别对分离的人参种类的样品进行粉末化，并利用提取溶剂制备人参提取物的步骤；3) 通过对上述人参提取物进行分级提取来获得分级提取物的步骤；以及4)利用U V 254nm的PAD检测仪测量每种上述人参种类分离的分级提取物的超高效液相色谱图谱。上述UPLC图谱测量结果，包含在13.3分钟处出现的第一峰(peak) 及13.5分钟处出现的第二峰(peak)的活性成分的人参为高丽人参(Panaxgins eng C.A.Meyer)。

如上所述，在全球市场上有多个品种的人参进行着流通，代表性地有高丽人参(Panaxginseng C.A.Meyer)、美国人参(Americanginseng，Panax quinqu efolium)及中国人参(Chineseginseng，Panax notoginseng)。

根据上述人参品种，外观上没有区别，因此不易区分，在市场上无差别地乱流通时，可能会出现把价格相对低的中国人参当作高丽人参来销售的问题。

为此，若利用本发明的高丽人参品种的筛选方法，在多个人参组中，可通过部分样品的分级提取物掌握是否包含活性成分，从而不仅可以容易确认是否有高丽人参，而且能够以高准确度确认人参品种。

发明的效果

本发明通过确认并分离非皂甙成分中的仅包含于高丽人参的品种的活性成分，从而提供一种高丽人参的品种筛选用指标物质，对于冒充为高丽人参进行销售的产品，可通过分离纯化活性成分来判断是否为高丽人参，而无需使用现有的分子生物学方法。

附图说明

图1为根据本发明一实施例的人参提取及分级提取过程中的每步骤的进程的图。

图2为根据本发明一实施例的多个品种的人参提取物的薄层色谱(TLC)分析结果。

图3为根据本发明一实施例的多个品种的人参分级提取物的TLC分析结果。

图4为根据本发明一实施例的多个品种的人参提取物的高效液相色谱(HP LC)分析结果。

图5为根据本发明一实施例的人参分级提取物的超高效液相色谱(UPLC) 色谱图分析结果。

图6为根据本发明一实施例的人参分级提取物的UPLC色谱图分析结果上的特定峰值的MS/MS数据。

具体实施方式

以下，将详细描述本发明的实施例，以便本领域普通技术人员能够容易地实施本发明。但是，本发明可以以各种不同的形式实施，并且不限于在此描述的实施例。

人参样品准备

对于人参，选择了世界市场上普遍流通的品种，选择了栽培地或年龄不同的12种被称为高丽人参(Korean ginseng)的高丽参(Panax ginseng C.A.Me yer)、被称为美国人参(American ginseng)的西洋参(Panax quinquefolium)、被称为中国人参(Chineseginseng)的三七(Panax notoginseng)。对于所有人参，使用对包括主根、支根和须根在内的整个根部分进行粉末化来储存的人参。

①K-28(高丽人参/骊州/5年根)

②K-29(高丽人参/扶余/4年根)

③K-43(高丽人参/清州/6年根)

④K-44(高丽人参/锦山/4年根)

⑤G-3(高丽人参/长白山/6年根)

⑥H-3(花旗参/香港/4年根)

⑦H-5(花旗参/长白山/4年根)

⑧H-6(花旗参/长白山/5年根)

⑨H-7(花旗参/长白山/6年根)

⑩J-1(田七参/长白山/4年根)

1.试剂及仪器

样品的提取及分离使用了乙醇(ethanol)、甲醇(methanol)及水(water)，并使用了三田纯化学公司(Samchun pure chemical Co.)产品的1等级溶剂。就分离而言，将Diaion HP-20和MCI CHP 20P(美国圣路易斯色谱科(Supelco， St.Louis，MO，USA))两种用作凝胶(gel)。

2.提取

对每个样品准确称取70g的试料粉末后，加入1000mL的70％的乙醇，重复超声提取2次，每次1小时30分钟，并浓缩滤液。

3.1.液体-液体分离

在浓缩每个样品的70％的乙醇提取物之前，利用减压浓缩仪(日本东京理化N-1100V(N-1100V，Eyela，Tokyo，Japan))仅将乙醇挥发。随后，加入与剩余水相同体积的正丁醇(n-butanol)并涡旋(vortexing)1分钟以引起溶剂之间的物质移动。为了进行基于两个溶剂之间的密度差异的分离，使用离心机进行分离，并在4000×g下处理10分钟。分别回收分离的两个溶剂，对于丁醇层而言，使用减压浓缩器挥发溶剂并回收粉末，而对于水层而言，使用冷冻干燥机(韩国伊尔辛生物碱FDS8508(FDS8508，Ilshinbiobase，Korea))使水升华，从而回收粉末。

3.2.通过柱层析(Column chromatography)的分离

3.2.1.Diaion HP-20柱层析

将浓缩的每个样品的70％的乙醇提取物溶解于水后，将其载入合成吸附剂中填充Diaion HP-20的柱(column)中。Diaion HP-20是苯乙烯(styrene)与二乙烯基苯(divinylbenzene，DVB)的共聚物，其特征在于，分布有多个细孔，因此表面积大(surface area)，由于细孔较大，容易洗脱被吸附的物质的。并且，由于具有疏水性(hydrophobicity)，在有机分子之间可吸附疏水基团，因此在本实验中，可以实现糖类等亲水性物质不会被吸附而被去除的效果。随后，通过使用甲醇(methanol)洗脱收集被吸附的物质，然后进行浓缩。

每个样品的甲醇分级提取(methanol fraction)量：K-28(3.0125g)、K-29(1.2000g)、K-43(2.5706g)、K-44(2.1026g)、G-3(1.7450g)、H-3(2.5003g)、 H-5(3.2654g)、H-6(3.9624g)、H-7(3.0825g)、J-1(5.9016g)、J-3(1.4224g)、 S-4(5.4512g)。

3.2.2.MCI GEL CHP 20P柱层析

将浓缩的甲醇分级提取物(methanol fraction)溶解于30％的甲醇(methan ol)后，载入合成吸附剂中填充MCI CHP 20的柱(column)中。MCI GEL C HP 20P也是苯乙烯(styrene)与二乙烯基苯(DVB)的共聚物，由于粒度(pa rticle size)与细孔的大小小于Diaion HP-20，因此可以分离小尺寸(Size)的物质。载入后按30％的甲醇分级提取(30％methanol fr.)、60％的甲醇分级提取(6 0％methanol fr.)、100％的甲醇分级提取(100％methanol fr.)顺序注入溶剂来进行洗脱，结果根据溶剂亲和度分离了物质。

每个样品的MCI分级提取(fraction)量

①K-28：MCI-1(0.2708g)、MCI-2(0.0452g)、MCI-3(0.1092g)、MCI-4 (0.2735g)、MCI-5(0.2201g)、MCI-6(0.5141g)、MCI-Wash(1.087g)

②K-29：MCI-1(0.0146g)、MCI-2(0.1343g)、MCI-3(0.1475g)、MCI-4 (0.1348g)、MCI-5(0.0548g)、MCI-6(0.2488g)、MCI-Wash(0.4182g)

③K-43：MCI-1(0.0784g)、MCI-2(0.0724g)、MCI-3(0.1604g)、MCI-4 (0.3535g)、MCI-Wash(1.1503g)

④K-44：MCI-1(0.1162g)、MCI-2(0.2941g)、MCI-3(0.2708g)、MCI-W ash(0.501g)

⑤G-3：MCI-1(0.3813g)、MCI-2(0.0488g)、MCI-3(0.0684g)、MCI-4 (0.2324g)、MCI-Wash(0.6907g)

⑥H-3：MCI-1(0.1392g)、MCI-2(0.0143g)、MCI-3(0.0359g)、MCI-4 (0.0678g)、MCI-5(0.4783g)、MCI-Wash(1.4478g)

⑦H-5：MCI-1(0.1779g)、MCI-2(0.2503g)、MCI-3(0.9307g)、MCI-Wa sh(1.8201g)

⑧H-6：MCI-1(0.1284g)、MCI-2(0.0461g)、MCI-3(0.0619g)、MCI-4 (0.1454g)、MCI-5(0.3934g)、MCI-6(0.971g)、MCI-Wash(2.3284g)

⑨H-7：MCI-1(0.1736g)、MCI-2(0.103g)、MCI-3(0.4645g)、MCI-Was h(1.1273g)

⑩J-1：MCI-1(0.0217g)、MCI-2(2.5956g)、MCI-3(0.161g)、MCI-4(1. 0119g)、MCI-Wash(0.934g)

1.试剂及仪器

用于薄层色谱法(Thin Layer Chromatography，TLC)的展开的溶剂均使用了1等级的甲醇(methanol)、水(water)、氯仿(chloroform)，薄层色谱板(T LC plate)使用了Kieselgel 60 F254。薄层色谱板(TLC plate)的染色使用了1 0％的H

2.实验方法

从多个人参品种中按每个国家选择一种，并以70％的乙醇提取物、液体-液体分离物和柱层析(column chromatography)分离物用作样品，且注入了相同的量。将每个样品载入TLC进行展开，展开溶剂使用了70：30：4(v/v/v)的氯仿：甲醇：水(Chloroform：Methanol：Water)。展开完成后，使用各种染色试剂对TLC板结果进行比较分析。

其结果如图2所示，图2上的数值是指如下提取物及分级提取物。

1：K-43 70％的乙醇提取物

2：K-43液体-液体分离物中丁醇层

3：K-43液体-液体分离物中水层

4：G-3 70％的乙醇提取物

5：G-3液体-液体分离物中丁醇层

6：G-3液体-液体分离物中水层

7：H-6 70％的乙醇提取物

8：H-6液体-液体分离物中丁醇层

9：H-6液体-液体分离物中水层

10：J-13 70％的乙醇提取物

11：J-1液体-液体分离物中丁醇层

12：J-1液体-液体分离物中水层

13：K-43 Diaion HP-20处理的水分级提取物

14：K-43 Diaion HP-20处理的甲醇分级提取物

在对每个人人参样品进行比较分析之前，在查看染色结果时，使用10％的硫酸进行处理的染色最清晰，可见度高，因此选择对TLC结果使用10％的硫酸来进行。本发明的描述中包括的实施例以使用10％的硫酸染色的(a)的结果为基准。

首先，当按每个人参品种进行比较时，当确认未进行分离的单纯70％的乙醇提取物的结果(1、4、7、10)时，由于没有很好地展开，因此确认了需要分离过程。

就每个人参品种的液体-液体分离物中丁醇层而言，展开良好，且物质的分离也良好。

比较使用相同的人参(K-43)但采用不同分离过程的样品中用甲醇洗脱的样品时，液体-液体分离物中甲醇层(2号)与Diaion HP-20处理的甲醇分级提取物(14号)中后者的物质分离可见度高。并且，甚至从条带的深度来看，14 号整体颜色也更深且具有更多物质，因此从回收率来看，通过Diaion HP-20处理也是一种更有效的方法。基于上述结果，选择了通过Diaion HP-20的分离方法，而不是液体-液体分离。

1.试剂及仪器

用于薄层色谱法(Thin Layer Chromatography，TLC)展开的溶剂均使用了 1等级的甲醇(methanol)、水(water)、氯仿(chloroform)，薄层色谱板(TLC plate)使用了Kieselgel 60F254。薄层色谱板(TLC plate)的染色使用了10％的H

2.实验方法

将12种人参的所有MCI分级提取物用作了样品。通过将每个样品加载到T LC来进行展开，展开溶剂使用了70：30：4(v/v/v)的氯仿：甲醇：水(Chlor oform：Methanol：Water)。展开完成后，比较分析TLC板UV 254nm处的图案，然后用10％的硫酸染色后进行了比较分析。

实验结果如图3所示，图3的(a)部分为K-43(UV 254nm)，(b)部分为H-3(UV254nm)，(c)部分为J-3(UV 254nm)，(d)部分为K-43(10％的硫酸染色)，(e)部分为H-3(10％的硫酸染色)，(f)部分为J-3(10％的硫酸染色)。

在(a)部分和(b)部分的TLC板中用圆圈标记的部分可在每个人参种类中共同发现，对应于推测为是酚类物质的成分。

在上述(b)部分中用方块标记的部分虽然在K-43中出现了相似的高度，但在10％的硫酸染色结果中没有被染色，因此推测其与K-43中发现的成分不同。

在(d)部分中用圆圈标记的部分是预期为人参皂苷的部分。

实验结果发现，在MCI分级提取物的后半部分发现人参中的人参皂苷，在 MCI分级提取物的前半部分中，在高丽人参及花旗参中分别确认了特殊的苯酚成分。

并且，高丽人参的苯酚成分和花旗参的苯酚成分在UV 254nm结果和通过 10％的硫酸的染色结果不同，因此在高丽人参中确认了与其他人参不同的苯酚成分。

1.试剂及仪器

分析使用了乙腈(acetonitrile)(HPLC级，J.T.Baker，Philipsbug，NJ，美国(USA))、HPLC用蒸馏水、甲酸(formic acid)(ACS级，密理博(Milipore)，芬兰(Finland))。所用的HPLC装置为Agilent 1260infinityⅡ(德国瓦尔特布隆(Waldbronn，Germany))，色谱柱使用了CAPCELL PAK C18mgS5(资生堂 (Shiseido)，5μm，4.6×250mm，日本东京(Tokyo，Japan))。

2.分析条件

将在蒸馏水(D.W)和乙腈(ACN)中混合0.1％(v/v)的甲酸(formic acid) 以梯度洗脱(gradient elution)方式进行使用。乙腈的比例以如下方式依次增加，即0分钟时5％的乙腈(ACN)、30分钟时30％的乙腈(ACN)、40分钟时60％的乙腈(ACN)，并且以如下条件进行了柱洗涤(washing)，即在45分钟时95％的乙腈(ACN)、50分钟时95％的乙腈(ACN)、52分钟时5％的乙腈(ACN)、 55分钟时5％的乙腈(ACN)的条件。展开温度设为30℃，流速设为0.6mL/mi n，样品的进样量(injection volume)为10μL。样品定量10m后，通过混合1. 0mL的50％的甲醇(methanol)来制备成10mg/mL的浓度，利用聚四氟乙烯(P TFE)材质的0.45μm的针头式过滤器(Syringe filter)对其进行过滤后使用。物质的检测通过使用PAD检测仪测量254nm的处的吸光收程度来进行。

实验结果如图4所示。

具体地，为了选取在UV 254nm下从K-43的分级提取物(fr.2)中检测到的物质(通过TLC确认)，按照HPLC色谱图(chromatogram)中按顺序选取了 10个高的峰(peak)。

基于此，确认了在其余高丽人参中也相同地能检测到，但在花旗参和田七参中未能检测到的峰。

总共比较64个MCI分级提取物的结果，十个候选峰中只有第六号和第七号峰满足上述条件，推测这就是一种仅在高丽参中发现的特定非皂苷物质。随后，通过UPLC分析确认了第六号和第七号物质。

1.试剂及仪器

分析使用了乙腈(acetonitrile)(HPLC级，J.T.Baker，Philipsbug，NJ，USA)、HPLC用蒸馏水、甲酸(formic acid)(ACS级，Milipore，Finland)。所用的HP LC装置为布鲁克compact型(Bruker compact)(德国不来梅道尔顿(Daltonik， Bremen，Germany))，色谱柱使用了ACQUITY UPLC CSH C18(沃特世(Wa ters)，1.7μm，2.1×150mm，美国马萨诸塞州米尔福德(Milford，MA，USA))。

2.分析条件

将在蒸馏水(D.W)和乙腈(ACN)中混合0.1％(v/v)的甲酸(formic acid) 以梯度洗脱(gradient elution)方式进行使用。乙腈(ACN)的比例以如下方式依次增加，即0分钟时5％的乙腈(ACN)、20分钟时20％的乙腈(ACN)，并且以如下条件进行了柱洗涤(washing)，即在22分钟时95％的乙腈(ACN)、2 7分钟时95％的乙腈(ACN)、29分钟时5％的乙腈(ACN)、35分钟时5％的乙腈(ACN)的条件。展开温度设为30℃，流速设为0.2mL/min，样品的进样量(injection volume)为10μL。样品定量10m后，通过混合1.0mL的50％的甲醇 (methanol)来制备成10mg/mL的浓度，利用聚四氟乙烯(PTFE)材质的0.45 μm的针头式过滤器(Syringefilter)对其进行过滤后使用。物质的检测通过使用PAD检测仪测量254nm的处的吸光收程度来进行。

实验结果如图5及图6所示。

具体地，紫外线图谱(UV spectrum)确认了在UPLC色谱图中，也能检测到HPLC色谱图上的13.3分钟处检测到的第6号峰，以及在13.5分钟处检测到的第7号峰。

由于在UPLC 13.3分钟处检测到的峰的m/z值为425.1159，因此预计是摩尔质量约为426.12g/mol的物质。通过MS/MS分析显示此种图形(pattern)的预期材料是紫杉醇A(lasiocarpin A)。

由于在UPLC 13.5分钟处检测到的峰的m/z值为461.0860，因此预计摩尔质量约为462.09g/mol。通过MS/MS分析显示这种图形(pattern)的预期物质是木犀草素-7-葡萄糖苷酸(luteolin-7-glucuronide)。

上述分析结果如下述表1所示。

[表1]

确认了在13.3分钟和13.5分钟的峰是否在并非是MCI分级提取物的70％的乙醇提取物中也会被发现，结果在高丽参中发现，但在花旗参和田七参中没有显示。

下面表2为整理高丽人参的各个峰的ppm值的表。

[表2]

根据上述实验结果可以确认，与其他人参品种相比，高丽人参种类含有作为非皂苷化合物的特定成分。若利用上述实验结果，可确定可将其用作确认人参品种的的指标物质。

以上详细描述了本发明的优选实施例，但是本发明的权利范围不限于此，本领域技术人员使用权利要求所限定的本发明的基本概念进行各种修改和改进也属于本发明的权利要求范围。