一种根结线虫培养基和培养方法

摘要

本发明公开了一种根结线虫培养基。它包括复合氨基酸粉、鱼粉、二水氯化钙、琼脂粉和水。本发明在水琼脂培养基中添加复合氨基酸粉和鱼粉能极大的提高根结线虫的产量，缩短周期，因此本发明提供了一种简便、快捷，能够大量获取植物根结线虫的培养方法，解决目前根结线虫培养依赖寄主，操作繁琐、培养时间长、线虫数量少的问题。

说明书

技术领域：

本发明属于植物根结线虫繁殖与保存技术领域，具体涉及一种培养植物根结线虫培养基和培养方法。

背景技术：

根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物病原线虫中种类最多、分布最广、危害最严重的一类线虫，常造成农林经济的严重损失。缪金玲、赵晓燕等研究表明，根结线虫能导致作物减产13％～25％，严重地块可高达70％以上，甚至绝收。据统计，世界范围内根结线虫造成的年收入损失率已达10％，造成直接经济损失1250亿美金以上。随着我国新农村设施农业的快速发展，根结线虫的危害有逐年上升的趋势。

近年来，植物根结线虫的防治备受国内外线虫学家的关注。为了更好的控制植物根结线虫病害的发生，人们对根结线虫的生物学特性、致病性以及各种防治方法进行了广泛深入的研究，反而对根结线虫的培养和保存方法研究较少，但根结线虫是一切研究的基础，无论是研究植物寄生线虫致病机理、线虫与-微生物-寄主间的互作关系，还是研究抗性品种、化学农药、生物技术对根结线虫的防治效果，都需要大量的供试线虫。线虫的质量和数量往往决定着根结线虫相关研究的成败。

根结线虫的培养具有依赖寄主植物的局限性，其种群培养和保存是困扰研究工作深入进行的主要因素。目前，国内外主要采用盆栽番茄、马铃薯、烟草、黄瓜等寄主或寄主植物根段外植体和组织培养离体苗等方式培养植物根结线虫，但均存在工作量大、过程繁琐、难管理、耗时多、难分离等缺陷，然而采用无外源培养基培养则可克服此类缺点。CN101473808A公开的一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法中利用番茄枯萎病镰刀菌(Fusarium oxysporum f.spcubense)制备二重培养基培养和繁殖根结线虫，虽然解决了根结线虫培养依赖寄主植物的问题，但仍然存在操作过程繁琐、菌种单一的缺陷。CN10297272355B和CN106135143A公开的利用甘薯愈伤组织和胡萝卜纯愈伤组织来培养和繁殖根结线虫，依然存在工作量大、操作繁琐和培养时间长的不足。国际上采用水琼脂培养基和玉米粉琼脂培养基培养植物根结线虫，虽然培养一段时间后能获得部分线虫，但数量及培养时间远达不到研究需要。因此，还需要寻找新的培养基配方及培养方法，以便在较短的时间内获得大量根结线虫，满足今后利用根结线虫开展相关研究的需要。

发明内容：

为解决根结线虫培养依赖寄主，而现有培养方法操作繁琐、培养时间长、线虫数量难以满足研究需要等问题，本发明公开了一种培养植物根结线虫的培养基和培养方法。

本发明的根结线虫培养基，其包括复合氨基酸粉、鱼粉、二水氯化钙、琼脂粉和水。

优选，所述的根结线虫培养基，每升含有复合氨基酸粉1～1.5g、鱼粉1～2g、二水氯化钙0.4g、琼脂粉10g和水1000ml，pH7.2。

优选，所述的根结线虫培养基，每升含有复合氨基酸粉1g、鱼粉2g、二水氯化钙0.4g、琼脂粉10g和水1000ml，pH7.2。

优选，所述的复合氨基酸粉中氨基酸种类包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、络氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸，游离氨基酸含量≥36.8％。

优选，所述的鱼粉，其中，鱼蛋白质含量＞86％；有机质含量≥88.6％；小肽含量＞80％；游离氨基酸含量＞15％；pH 6～7。

优选，所述的pH值是用pH＝7.6的0.2M磷酸盐缓冲液调节。

本发明的第二个目的是提供一种培养根结线虫的方法，其是将根结线虫接种到上述根结线虫培养基中进行培养。

优选，是在25℃恒温培养箱中黑暗培养。

本发明在水琼脂培养基中添加复合氨基酸粉和鱼粉能极大的提高根结线虫的产量，缩短周期，因此本发明提供了一种简便、快捷，能够大量获取植物根结线虫的培养方法，解决目前根结线虫培养依赖寄主，操作繁琐、培养时间长、线虫数量少的问题。

附图说明

图1是培养15天后，含培养基4的平板上出现大量白色、透明、椭圆形状的卵为根结线虫虫卵。

图2是培养21天后，水琼脂平板上出现少量线形虫体(A)，而含培养基4平板上则出现大量线形虫体(B)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1、以下实施例使用的复合氨基酸粉购自徐州绿色源农业科技有限公司。其中，复合氨基酸粉中氨基酸种类包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、络氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸，游离氨基酸含量≥36.8％。

2、鱼粉为鱼蛋白肽粉，购自丰宁三立生物科技有限公司。其中，鱼蛋白质含量＞86％；有机质含量≥88.6％；小肽含量＞80％；游离氨基酸含量＞15％；pH 6～7。

3、根结线虫的制备

南方根结线虫病原采集：在农户的番茄栽培地寻找发病严重的植株，将其完整取出(尽量保持根系完整)，去除根系所带的大土块，保留附着在根系上的少许土壤，将根系及土壤放到无菌自封袋中，立即用冰盒运回实验室。

番茄根结线虫病原分离：采回的根系用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1～2次。冲洗后的根切成1-2cm的段放入三角瓶中，加入0.5％的次氯酸钠，振荡2～3min。混合液用3层分离筛(上层60目、中层500目、下层800目)反复用灭菌水冲洗，收集500目和800目上的幼虫和虫卵。

虫卵孵化：在干净的筛网上放2层Kimwipe纸，然后放在一个玻璃培养皿上，将收集的虫卵倒入筛网中的纸上，加入蒸馏水，使筛子的底部接触到水面，但不浸没筛子。定期检查水位是否蒸发，确保筛子底部与水保持接触。6～8天内收集幼虫，评估线虫密度，并将虫密度稀释到100条/mL备用。

实施例1：不同复合氨基酸粉添加量对植物根结线虫培养效果的影响

水琼脂培养基：将琼脂粉10g、二水氯化钙0.4g加入到蒸馏水1000mL中，溶解后用pH＝7.6的0.2M磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至7.2，121℃灭菌21min，分装到培养皿中，备用。

为明确培养基中复合氨基酸粉的最适添加量，在水琼脂培养基的基础上设置复合氨基酸粉的添加量为：0、0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g/L，研究其对植物根结线虫的培养效果。

具体是分别按照0、0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g/L的量添加到水琼脂培养基中，溶解后用pH＝7.6的0.2M磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至7.2，121℃灭菌21min，分装到培养皿中，备用。

在无菌操作台上，取2mL100条/mL的根结线虫幼虫悬液接种于含有对应培养基的平板中，用封口膜将平板包好。置于25℃恒温培养箱中黑暗培养。每周观察一次平板上的线虫变化情况。培养时间3周，统计每个培养皿的线虫条数。每个试验3个重复。

结果如表1所示，在水琼脂培养基中添加不同比列的复合氨基酸粉能显著增加根结线虫的培养数量。

表1不同复合氨基酸粉添加量对根结线虫培养效果的影响

实施例2不同鱼粉添加量对植物根结线虫培养效果的影响

水琼脂培养基：将琼脂粉10g、二水氯化钙0.4g加入到蒸馏水1000mL中，溶解后用pH＝7.6的0.2M磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至7.2，121℃灭菌21min，分装到培养皿中，备用。

为明确培养基中鱼粉的最适添加量，在水琼脂培养基的基础上设置鱼粉的添加量为：0、1g、2g、2.5g、3g/L，研究其对植物根结线虫的培养效果。

具体是分别按照0、1g、2g、2.5g、3g/L的量添加到水琼脂培养基中，溶解后用pH＝7.6的0.2M磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至7.2，121℃灭菌21min，分装到培养皿中，备用。

在无菌操作台上，取2mL100条/mL的根结线虫幼虫悬液接种于含有对应培养基的平板中，用封口膜将平板包好。置于25℃恒温培养箱中黑暗培养。每周观察一次平板上的线虫变化情况。培养时间3周，统计每个培养皿的线虫条数。每个试验3个重复。

结果如表2所示，在水琼脂培养基中添加不同比列的鱼粉能显著增加根结线虫的培养数量。

表2不同鱼粉添加量对根结线虫培养效果的影响

实施例3

一种根结线虫培养基，由琼脂粉、复合氨基酸粉、鱼粉、二水氯化钙、蒸馏水组成。所述培养基以1L计算，各组分含量分别为：

所述培养基配制步骤为：称取10g琼脂粉、1.5g复合氨基酸粉、1g鱼粉和0.4g二水氯化钙混合均匀。将混合后的样品溶解于1000mL蒸馏水中，溶解后用pH＝7.6的0.2M磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至7.2，121℃灭菌21min，并分装到培养皿中即得根结线虫培养基。

实施例4

一种根结线虫培养基，由琼脂粉、复合氨基酸粉、鱼粉、二水氯化钙、蒸馏水组成。所述培养基以1L计算，各组分含量分别为：

所述培养基配制步骤同实施例3

效果例1不同培养基配方对南方根结线虫培养数量的影响

不同培养基配制方法：

水琼脂培养基：将琼脂粉10g、二水氯化钙0.4g加入到蒸馏水1000mL中，调pH7.2，121℃灭菌21min，分装到培养皿中，备用。

玉米粉琼脂培养基：称取80g玉米粉、10g琼脂粉、二水氯化钙0.4g放入1000mL蒸馏水中，用pH＝7.6的0.2M磷酸盐缓冲液调节溶液的pH至7.2，121℃灭菌21min，分装到培养皿中，备用。

本发明的两种培养基配制方法同实施例3、4，分别标记为培养基3、培养基4。

接种：在无菌操作台上，取2mL100条/mL的幼虫悬液接种于含有对应培养基的平板中，用封口膜将平板包好。置于25℃恒温培养箱中黑暗培养。每周观察一次平板上的线虫变化情况。当平板中线虫数量差异明显时，记录培养时间及平板上的线虫数量。每个处理3个重复。

结果统计：由表3可知，在虫密度100条/mL、接种量2mL、培养时间3周、培养温度25℃一致的条件下，在水琼脂培养基中添加玉米粉、复合氨基酸粉和鱼粉均能显著增加培养皿中根结线虫的数量，其中以培养基4(1g复合氨基酸粉+2g鱼粉+10g/L琼脂粉)效果最为显著，较水琼脂培养基增加了12398条/皿，较玉米粉琼脂培养基增加6754条/皿，较培养基3增加3880条/皿，且处理间差异显著。说明使用培养基4配方，3周能获得大量线虫。相比于实施例1和2的只添加复合氨基酸粉或鱼粉的水琼脂培养基，在同等含量(2.5g和3g)的情况下，同时添加复合氨基酸粉和鱼粉比单独添加的效果更好，具有增效作用。

表3不同培养基对根结线虫培养数量的影响

图1是培养15天后，含培养基4的平板上出现大量白色、透明、椭圆形状的卵为根结线虫虫卵。

图2是培养21天后，水琼脂平板上出现少量线形虫体(A)，而含培养基4平板上则出现大量线形虫体(B)。

效果例2不同培养时间对南方根结线虫培养数量的影响

设置2个培养基配方：水琼脂培养基和培养基4，3个培养时间水平：即培养3周、4周、5周。其它操作步骤同效果例1。统计3周、4周、5周后平板上的线虫数量。

结果统计：由表4可知，在虫密度100条/mL、接种量2mL、培养温度25℃一致的条件下，随着培养时间的增加，平板中根结线虫数量逐渐增加。水琼脂培养基在培养4周后获得大量线虫，而培养基4在培养3周后就获得大量虫体，比水琼脂培养基快1周。

表4不同培养时间对南方根结线虫培养数量的影响