去甲泽拉木醛在抗登革病毒感染中的潜在应用

摘要

本发明提供了一种针对登革病毒(dengue virus)中在病毒复制、组装、成熟过程中起关键作用的NS2B/NS3蛋白酶(NS2B/NS3protease)的抑制剂，该抑制剂的名称为去甲泽拉木醛(Demethylzeylasteral)，对登革病毒NS2B/NS3蛋白酶具有显著抑制活性，因此本发明提供的化合物能够用来制备针对登革病毒NS2B/NS3蛋白酶的小分子抑制剂，有望成为抗登革病毒感染的潜在药物。

说明书

技术领域

本发明涉及药学的技术领域，具体说是去甲泽拉木醛在抗登革病毒感染中的应用。

背景技术

登革病毒(dengue virus，DENV)是一种由伊蚊传播的虫媒病毒，在热带地区传播广泛。在过去的几十年里，世界范围内登革病毒血清型和媒介分布的流行病学研究急剧增加。患者感染病毒，临床表现有轻度发烧的登革热(DF)、严重的登革出血热(DHF)或登革休克综合征(DSS)几种，症状不等，会导致头痛、肌肉酸痛、关节痛、恶心、呕吐和皮疹，出现白细胞减少、血小板减少、血管通透性增加等症状。研究显示，全球每年报道的登革热感染病例高达3.9亿，共有39亿人暴露在感染登革热的风险之中，被世界卫生组织2019年列为全球健康面临的最大威胁之一，对公共卫生安全造成严重负担。引起登革热的4种病毒血清型DENV(1、2、3、4)均可引发不同程度的疾病，恢复后的患者对感染过的其中一种血清型具有终身免疫，但对异源血清型只有短期交叉保护作用，当作用减弱时，继发感染的患者会增加发生重症登革热的风险。在四种血清型中，DENV1和DENV2是与已知爆发相关的最常见类型。在DENV感染早期阶段通过抗病毒治疗降低病毒水平可以防止或降低患者发展为DHF/DSS的机会,发热后的40h内被认为是采取治疗的理想时机。目前还没有药物被批准用于登革热的治疗，迄今为止，只有少数已经在临床试验中进行了测试，如氯喹，洛伐他汀，泼尼松龙等，然而，这些化合物并没有展现出很好的效果，没有被用作有效的抗登革热疗法。因此，需要在早期阶段确定有效且耐受的药物用于治疗DENV感染患者，以防止病情进一步进展，并在患者发生严重并发症后把死亡率降到最低。疫苗是遏制病毒感染的最有效手段，正在研究的登革热疫苗都取得很大进展，但仍旧面临许多新的挑战，如在多个国家投入使用的疫苗登瓦夏(Dengvaxia)在临床中饱受争议，结果显示其未能对四种血清型提供完全的保护，且只可用于曾经感染过登革病毒的人，否则接种该疫苗可能会加重儿童未来感染登革热病毒时的症状。目前只能通过控制媒介来降低传染的发生。

登革热和新冠病毒感染具有共同的临床表现，因此很容易以合并感染的形式存在。随着COVID-19在全球的广泛肆虐，多个国家都出现了COVID-19和登革热合并感染的病例，合并感染的案例多发生在成年男性身上，这使治疗的难度增加，给人们带来了新的疾病负担。研究结果表明，白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞减少与SARS-CoV-2和DENV合并感染密切相关。

登革病毒NS3蛋白酶具有典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体结构，通过与辅因子NS2B结合而进入其活性状态，介导多蛋白在特定位点的加工。登革病毒蛋白酶NS2B/NS3pro是登革病毒成熟中至关重要的靶点，含有该酶活性位点突变的NS3pro突变病毒是非传染性的，因而以此为靶点研究开发抗登革病毒药物具有重大意义。

去甲泽拉木醛，英文名是Demethylzeylasteral，提取于中药雷公藤中，是一种三萜类单体。作为雷公藤中的一种有效成分，去甲泽拉木醛具有抗炎、免疫抑制的功能，可缓解由全身性免疫介导的慢性炎症性疾病动脉粥样硬化。另外近期研究显示，其对多种癌细胞，如乳腺癌、人结直肠癌、胃癌、鼻炎癌、膀胱癌等表现出良好的抑制活性。但至今，去甲泽拉木醛在抗登革病毒感染中的应用未见报道。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提供去甲泽拉木醛在抗登革病毒感染中的应用。

本发明还提供了针对登革病毒NS2B/NS3蛋白酶的抑制剂。

本发明所涉及去甲泽拉木醛CAS号为107316-88-1，购自上海陶素生化科技有限公司。在药物筛选过程中，通过设立阴性对照，复筛排除假阳性结果，发现去甲泽拉木醛对登革病毒1型NS2B/NS3蛋白酶有很好的抑制活性，因此该化合物有望作为抗登革病毒感染的潜在药物。

本发明提供一种用于预防或治疗登革病毒感染的药物，其活性成分为去甲泽拉木醛，该药物包含上述含有去甲泽拉木醛以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

本发明具有的优点和积极效果是：

本发明的针对登革病毒1型NS2B/NS3蛋白酶(DENV1 NS2B/NS3pro)的抑制剂，这种抑制剂为去甲泽拉木醛。去甲泽拉木醛对登革病毒中的NS2B/NS3蛋白酶活性具有显著的抑制效果。

附图说明

图1是去甲泽拉木醛对DENV1 NS2B/NS3蛋白酶的抑制作用示意图。

图2是去甲泽拉木醛的IC

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下面将详述本发明的具体实施方式。

1.登革病毒NS2B/NS3蛋白酶(DENV1 NS2B/NS3pro)的表达与纯化

(1)仅含NS2B中心亲水区的重组NS2B/NS3pro的表达足以产生可溶性和有活性的蛋白酶，故采用G

(2)在平板上挑取长出的阳性克隆，于37℃摇床中培养，待OD

(3)离心机3500rpm离心后收集菌体，使用高压细胞破碎仪或者超声波细胞破碎仪进行菌体破碎，收集上清液进行纯化操作。

(4)首先对蛋白进行初步纯化，将上清液置于镍柱中，使用垂直混悬仪混悬1-2h,使其与镍介质充分结合，咪唑梯度洗杂洗脱获得较纯的蛋白，再根据目的蛋白特性，通过离子交换层析、凝胶过滤层析进一步纯化，最后获得纯度较高，电荷、大小均一性良好的蛋白样品用于后续实验。

2.DENV1 NS2B/NS3 pro的活性测定

采用纯度大于95％的Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC作为底物,使用荧光共振能量转移技术进行酶促反应动力学的相关测定。

用缓冲液配置DENV1 NS2B/NS3 pro(加入体系后终浓度为100nM)，在孔中加入89μL稀释好的DENV1 NS2B/NS3 pro，1μL待测化合物，在37℃下孵育10min，然后迅速加入10μL底物Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC(体系中的终浓度为20μM)启动反应，设置不加化合物的阴性对照，设置30s间隔读取荧光值，取前300s数据进行反应初速率的计算，分析数据，通过公式计算每个化合物的抑制率，初步筛选出有效化合物。

数据处理后，对于化合物库中抑制率＞70％的抑制剂进行复筛，设置多组平行，并进行荧光淬灭实验以排除实验者操作失误或抑制剂本身性质原因造成的假阳性结果。

3.去甲泽拉木醛IC

首先进行抑制剂的准备，用95％的DMSO配制11个不同浓度的抑制剂去甲泽拉木醛，使其在体系中的终浓度分别为100μM、80μM、40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM。在孔中加入89μL稀释好的DENV1 NS2B/NS3 pro，1μL抑制剂去甲泽拉木醛，在37℃下孵育10min，然后迅速加入10μL底物

Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC(体系中的终浓度为20μM)启动反应，设置阴性对照。读取数据设置如上，分析每个孔的荧光值变化，使用软件进行数据分析，利用初速率拟合得到去甲泽拉木醛浓度与抑制率的关系曲线，求得IC

本发明涉及药学的技术领域，具体说是去甲泽拉木醛在抗登革病毒感染中的应用，去甲泽拉木醛对DENV1 NS2B/NS3 pro活性抑制率达90％以上,在制备抗登革病毒中NS2B/NS3蛋白酶的小分子抑制剂方面有很大应用潜力，有成为抗登革病毒感染的潜在药物的希望。

以上所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常用的方法。

以上仅为本发明的具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。