气道基底层干细胞在良性气道狭窄治疗中的应用

摘要

本发明涉及基于气道基底层干细胞在良性气道狭窄的治疗中的应用。本发明研究显示，利用气道基底层干细胞可在气道狭窄段表面重建正常气管上皮，并抑制狭窄段肉芽组织增生，因此采用先清除狭窄段肉芽组织再利用气道基底层干细胞移植的疗法，可显著治疗气管狭窄，且有效避免了常规治疗后的狭窄复发，使气管狭窄趋于稳定，极大的改善了患者的生存质量。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及气道基底层干细胞在良性气道狭窄治疗中的应用。

背景技术

良性气道狭窄是介入呼吸病学常见疾病，多由于结核或气管插管所致，以明显的肉芽组织增生为主要病理改变，严重影响患者呼吸功能，并可导致窒息。目前主流的治疗方法为手术治疗或支气管镜介入治疗。

通过手术将狭窄段切除并行端端吻合术是良性气道狭窄的常规治疗手段，其疗效显著，可完全恢复气管管腔通畅，但手术治疗对于患者身体一般情况要求较高，同时对于狭窄段长度有限制，超过5cm的狭窄因为吻合口张力过高无法通过手术切除，仅少部分病人可耐受手术治疗。另一方面，手术治疗虽然并发症少见，但仍有部分病人在吻合口处出现明显肉芽组织增生，导致再狭窄的发生。

支气管镜介入治疗主要是通过球囊扩张、高频电刀、激光消融等方式清除狭窄段肉芽组织以达到恢复管腔通畅的效果，对于无法接受手术的良性气道狭窄患者而言是主要的治疗手段。介入治疗短期疗效明显，但无法抑制肉芽组织增生，在数周或数个月内出现再狭窄，患者往往需要定期接收支气管镜介入治疗以维持狭窄段气管直径。

总的来说，无论是手术治疗亦或是支气管镜介入治疗，都受到多方面的制约，无法有效治疗良性气道狭窄。

气管上皮在保护粘膜下组织免受外界刺激的同时，还具有抑制成纤维细胞增殖分化的作用。气道基底层细胞作为一类可分化为多种气道上皮细胞的干细胞，受到了组织工程学的广泛关注，研究者将有骨髓间充质干细胞诱导分化获得的自体软骨细胞以及自体呼吸道上皮细胞在生物反应器中接种至脱细胞支架，并移植到患者体内，替代了患者发生软化的左主支气管。据文献报道(DOI：10.29235/1814-6023-2020-17-4-417-426)，采用自体粘膜来源的间充质干细胞治疗喉气管狭窄，其呼吸功能得到改善和运动耐受性有所提高，短期疗效明显。但远期而言，由于间充质干细胞无法形成上皮组织，其主要依靠其抗炎和促生长的作用而起效。因此，利用间充质干细胞是无法根治良性气道狭窄的，始终会复发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为良性气道狭窄提供一种长效的干细胞疗法。本发明疗法先清除狭窄段肉芽组织，再利用气道基底层干细胞移植，可在气道狭窄段表面重建正常气管上皮，并抑制狭窄段肉芽组织增生，有效避免了常规治疗后的狭窄复发，使气管狭窄趋于稳定，极大的改善了患者的生存质量。

本发明的目的是提供气道基底层干细胞在良性气道狭窄治疗中的应用。

本发明的另一目的是提供气道基底层干细胞在制备治疗良性气道狭窄的干细胞药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种治疗良性气道狭窄的气道基底层干细胞悬液。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

目前尚未有研究者提出通过再生医学治疗良性气道狭窄的可行方法，医学界尚没有意识到重建上皮组织的对治疗气道狭窄的可行性和重要性。但经过本团队的研究，确定气道基底层干细胞能有效治疗良性气道狭窄，首次确定了采用气道基底层干细胞治疗良性气道狭窄的方案。

因此本发明要求保护：

气道基底层干细胞在良性气道狭窄治疗中的应用。

气道基底层干细胞在制备治疗良性气道狭窄的干细胞药物中的应用。

优选地，所述的气道基底层干细胞源自本体最佳。

更优选地，所述的气道基底层干细胞取自气道狭窄2-3级支气管上皮。

一种治疗良性气道狭窄的气道基底层干细胞悬液，干细胞悬液的细胞密度为400～600万个/mL。

其中，优选地，所述的干细胞悬液的细胞密度为500万个/mL。

其中，优选地，所述的干细胞悬液的分散介质为生理盐水或磷酸盐缓冲液。

其中，优选地，所述的磷酸盐缓冲液的pH为6～8。

其中，优选地，所述干细胞悬液中含有1％～5％(w/v)人血白蛋白，更优选3％(w/v)人血白蛋白。

该治疗良性气道狭窄的气道基底层干细胞悬液可应用于制备治疗良性气道狭窄的干细胞药物。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种通过再生医学治疗良性气道狭窄的可行方法，将清除狭窄段肉芽组织与气道基底层干细胞移植结合治疗：

(1)为气道狭窄的干细胞治疗提供一种可供应用的干细胞。

(2)可在气道狭窄段表面重建正常气管上皮。

(3)可有效减少良性气道狭窄的再狭窄发生，稳定气道肉芽。

(4)改善了患者的生存质量。

附图说明

图1显示气道基底层干细胞的形态(光镜)。

图2显示气道基底层干细胞免疫荧光鉴定KRT5/P63表达情况。

图3显示空白对照组模型犬造模后气管情况。

图4显示实验组第一只模型犬经自体气道基底层干细胞治疗气管损伤的治疗结果。

图5显示实验组第二只模型犬经自体气道基底层干细胞治疗气管损伤的治疗结果。

图6显示实验组第三只模型犬经自体气道基底层干细胞治疗气管损伤的治疗结果。

图7显示BMSC对照组模型犬经间自体骨髓间充质干细胞治疗气管损伤的治疗结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1气道狭窄模型建立

随机选取9只健康成年雄性比格犬，通过气管插管球囊压迫比格犬气道24小时的方式建立插管后良性气道狭窄模型，经检查验证，均建模成功。

构建成功的模型随机分为3组(实验组、空白对照组和BMSC对照组)，每组3只。

实施例2气道基底层干细胞提取、分离、鉴定和培养

提前2周在支气管镜引导下使用细胞刷刷取比格犬(实验组比格犬)气道狭窄2-3级支气管上皮，获取自体气道基底层干细胞；

按照文献(Rapid Expansion of Human Epithelial Stem Cells Suitable forAirway Tissue Engineering)所述培养方法对刷检获取的原代细胞进行扩增，并通过免疫荧光技术检测细胞krt5/p63表达情况，鉴定所培养细胞的类型。

结果：培养所得的细胞形态如图1所示，免疫荧光技术均显示krt5/p63表达阳性如图2所示，表明所培养的均为气道基底层干细胞。

实施例3气道基底层干细胞治疗气道狭窄

比格犬造模后3天可见损伤处大量坏死物质，7天后出现严重气管狭窄，常规放置金属支架治疗。

(1)细胞移植前3天通过常规治疗方法清除模型犬的狭窄段肉芽组织，并测量模型狗的狭窄段长度；

(2)干细胞准备：

实验组：在细胞移植当天，按照狭窄段长度每1厘米移植500万细胞的比例，将所需气道基底层干细胞消化并使用PBS重悬为浓度约500万/mL的细胞悬液，加入人血白蛋白至其质量浓度为3％；

BMSC对照组：在细胞移植当天，按照狭窄段长度每1厘米移植500万细胞的比例，将所需脐带间充质干细胞(来源于BMSC对照组比格犬)消化并使用PBS重悬为浓度约500万/mL的细胞悬液，加入人血白蛋白至其质量浓度为3％；

(3)细胞移植前，需通过支气管镜吸净气道内分泌物；

(4)将喷洒管头端喷头剪去，经支气管镜将喷洒管送入气管内；

(5)细胞移植：

实验组模型犬：使用注射器吸取实施例2所得自体气道基底层干细胞悬液，经喷洒管缓缓推入，均匀涂抹在狭窄段表面；

BMSC对照组模型犬：使用注射器吸取脐带间充质干细胞悬液，经喷洒管缓缓推入，均匀涂抹在狭窄段表面；

空白对照组模型犬：使用注射器吸取等量含3％人血白蛋白的PBS，经喷洒管缓缓推入，均匀涂抹在狭窄段表面；

(6)间隔1周，重复上述(1)-(5)步骤两到三次。

结果：如图3所示为对照组模型犬造模后表现，放置金属支架治疗后，恢复气管通畅，可短期内可维持管径，但约一周后气管再狭窄发生，经清除肉芽组织后涂抹含3％人血白蛋白生理盐水治疗无效，形成致死性气管狭窄。

如图4-6所示为实验组3只模型犬经自体气道基底层干细胞治疗气管损伤的治疗结果，放置金属支架治疗，恢复气管通畅，但一周后气管再狭窄发生。经清除肉芽组织后移植气道基底层干细胞，经过两次移植后狭窄段表面可见光滑气道上皮，狭窄段1个月内无明显进展。

并且因临床上倾向于将3个月未发生复发的气管狭窄视为治愈，所以我们的动物实验还进行了3个月的随访，结果表明在细胞移植成功后3个月，狭窄组织一直维持稳定。

因此本发明的治疗方案在放置有金属支架的情况下，可以完全稳定狭窄部分，并保证其在至少3个月时间内不会复发，可预期具有较长的稳定期。

同时我们还利用骨髓间充质干细胞(BMSC)替换气道基底层干细胞进行了对比实验，如图7所示，经脐带间充质干细胞移植治疗一周后观察可见狭窄无明显进展，但细胞移植两周后可见再狭窄复发，管腔严重狭窄。从实验的结果来看，间充质干细胞仅可以在一到两周内稳定狭窄组织。

另外特别说明：之所以在干细胞治疗前放置金属支架治疗，主要原因在于目前现有的气管狭窄造模手段会导致不同程度的气管软骨破坏，管腔会随着呼吸缩窄，不得已需要放置金属支架进行支撑。然而另外一方面，金属支架本身也会促进肉芽组织生长，形成临床上最棘手的难治性气管狭窄。因此本发明的结果表明，在放置有金属支架这一大干扰因素的情况下，本发明的气道基底层干细胞移植疗法仍可以有效稳定狭窄组织，更加证明其疗效优异。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。