骨髓来源间充质干细胞在良性气道狭窄中的应用前景及治疗机制初探

摘要

目的：　　良性气道狭窄是一种威胁生命的呼吸系统疾病。近年来，随着危重症医学和呼吸支持技术水平的提高，以及肺移植等手术的开展和普及，良性气道狭窄的发生率逐渐增高。当前，良性气道狭窄的治疗手段及疗效均有限，治疗主要包括:手术切除狭窄段及断端吻合、球囊扩张、冷冻治疗、热消融（YAG或CO2激光、电凝、氩气刀）治疗、支架置入及局部/系统应用类固醇。以手术治疗为金标准，但受狭窄段长度及患者心肺基础情况的限制，并不适用于所有患者;介入治疗的再狭窄率高且需要定期气管镜随访。良性狭窄的主要发病机制是气道粘膜损伤和由成纤维细胞主导的异常修复[1，2]。该疾病通常始于（感染或非感染因素导致的）气道粘膜大面积损伤，可伴随局部出血或血管淤血、伴不同程度的炎症反应（炎症细胞募集和炎症介质释放），气道粘膜继而出现水肿、坏死、脱落、溃疡，可合并病原体感染。然后，成纤维细胞大量募集和增殖，炎性细胞趋化及浸润，新生毛细血管血管形成，共同构成新鲜的肉芽组织。最后阶段是气道重塑，成纤维细胞分泌大量胶原纤维，造成胶原沉积，肉芽组织老化脱水，成纤维细胞变成具有收缩表现的肌成纤维细胞，发生组织挛缩及瘢痕狭窄。成纤维细胞的主要来源:邻近纤维结缔组织中的成纤维细胞迁移、上皮间质化(EMT)及外周血循环纤维细胞等。作出大胆猜想:如若从病变早期即引入治疗手段，促进粘膜修复和减轻炎症，是否可以从根源上缓解或避免肉芽组织过度增生。间充质干细胞(MSCs)兼具促进组织修复及抗炎功能，是治疗的绝佳选择。间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞的一种，来源于发育早期中胚层，具有高度自我更新、多向分化潜能。MSCs治疗疾病有多种机制:分化代替、旁分泌、外泌体及线粒体转移。骨髓是MSCs的重要来源之一，本课题组在骨髓来源间充质干细胞(BMMSCs)研究相关领域积累了丰富的经验。为了研究BMMSCs在良性气管狭窄治疗中的潜力，建立了尼龙刷刮擦良性气管狭窄的SD大鼠模型，应用BMMSCs作为局部治疗，并对治疗前景和机制进行初步探索。　　方法：　　首先采用全骨髓贴壁法进行SD大鼠BMMSCs的原代培养，通过流式细胞技术对BMMSCs进行表型鉴定，并进行（成骨、成脂）诱导分化鉴定。采用链蛋白酶冷消化法进行SD大鼠气管-支气管上皮细胞(TBECs)的原代培养，并进行纯度鉴定。细胞鉴定后，通过Transwell小室构建SD大鼠BMMSCs与TBECs共培养体系，体外划痕实验探索BMMSCs对上皮修复的作用。用人来源BMMSCs与正常人来源支气管上皮细胞(NHBE)重复上述共培养-划痕实验。　　其次，以220g-300g体重的雄性Sprague Dawley大鼠为研究对象，通过尼龙刷刮擦机械性损伤气道粘膜的方式，建立良性气管狭窄的SD大鼠模型，观察造模后大鼠的症状体征及生存情况。并通过HE染色及Masson染色，探索造模后不同时间点气管组织的病理变化。　　而后在粘膜机械损伤的局部应用1×106BMMSCs，通过体内实验探索BMMSCs对良性气道狭窄治疗的可行性。将SD大鼠分为3组:伪手术组、狭窄模型组（尼龙刷刮擦机械损伤）和BMMSCs治疗组（尼龙刷刮擦机械损伤+BMMSCs局部治疗），自然死亡的动物即时收集样本，其余存活动物于造模后第22天统一处死。收集气管组织，固定于4％磷酸盐缓冲的多聚甲醛，HE染色后观察病理改变，并分析评估管腔大小、测算狭窄指数。另取SD大鼠重复造模及BMMSCs治疗，通过HE染色与PAS染色探索造模+BMMSCs局部治疗后不同时间点上皮组织的修复情况。　　最后部分探索了BMMSCs促进上皮修复及预防肉芽组织增生的机制。通过CFSE荧光染料标记BMMSCs，机械损伤及BMMSCsCFSE治疗4天后对气管组织进行冰冻切片、泛角蛋白免疫荧光染色，观察BMMSCs是否能够通过直接分化替代的方式来修复上皮结构。另取SD大鼠分为3组:伪手术组、狭窄模型组（尼龙刷刮擦机械损伤）和BMMSCs治疗组（尼龙刷刮擦机械损伤+BMMSCs局部治疗），第四天处死并收集新鲜外周血及气管组织。气管组织进行RNA提取，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，用实时聚合酶链反应(qPCR)检查各细胞因子表达水平。由于肉芽组织主要成分为成纤维细胞，而循环纤维细胞为成纤维细胞主要来源之一，本研究还应用流式细胞学对不同组外周血循环纤维细胞百分比进行检测。　　结果：　　一、大鼠来源细胞实验部分:划痕后以DMEM无血清培养基培养，对照组上皮细胞平均迁移速度为(19.82±5.43)μm/hr，BMMSCs共培养组为（59.42±2.976）μm/hr，p=0.0002，差异有统计学意义。人来源细胞实验部分:DMEM无血清培养基培养，单纯划痕组经过16h培养后，划痕愈合速度为（37.91±2.79）μm/hr，MSCs共培养组划痕愈合速度为（67.60±8.51）μm/hr，p＜0.0001;大气道上皮细胞完全培养基重复划痕实验，对照组上皮细胞平均迁移速度为（83.92±4.91）μm/hr，BMMSCs共培养组为(124.2±5.55)μm/hr，p＜0.0001。共培养体系-划痕实验证实BMMSCs可加速上皮细胞迁移及修复。　　二、成功建立尼龙刷刮擦良性气管狭窄的SD大鼠模型，尼龙刷机械刮擦可严重损伤气道上皮、引起肉芽组织显著增生及气管狭窄。造模第8天，大鼠生存率为0，气管几乎完全被新生肉芽组织闭塞，而对照组无死亡事件。造模后d2、4、6、8天的气管组织呈不同期病理改变，与文献报道的组织损伤修复过程相仿。　　三、伪手术组狭窄指数为（5.55±2.71）％，狭窄模型组为(55.87±8.76)％，BMMSCs治疗组为(11.12±4.80)％，伪手术组与机械损伤组间狭窄度差异有统计学意义，p＜0.0001;伪手术组与BMMSCs治疗组间狭窄度差异无统计学意义;机械损伤组与BMMSCs治疗组间狭窄度差异有统计学意义，p＜0.0001。21天存活率伪手术组100％,机械损伤组0％，BMMSCs治疗组80％。BMMSCs局部应用可促进损伤后的上皮修复，改善肉芽形成从而减轻气道阻塞，大大降低狭窄指数，提高存活率。　　四、BMMSCS（CFSE绿色荧光标记）与修复后的上皮（泛角蛋白染色红色荧光）信号不重合，提示BMMSCs促进上皮修复并非通过直接分化替代的方式。伪手术组大鼠外周血循环纤维细胞为（0.85±0.34）％，狭窄模型组尼龙刷刮擦后，循环纤维细胞数量增加至(4.92±1.74)％，BMMSCs治疗组循环纤维细胞显著低于狭窄模型组（2.04±0.68）％。其中伪手术组与狭窄模型组(p=0.002)、MSC治疗组与狭窄模型组(p=0.0037)间差异有统计学意义，而BMMSCs治疗组与伪手术组间差异无统计学意义(p=0.2385)。qPCR结果提示转移生长因子β1、白细胞介素1、CollagenⅢ、肿瘤坏死因子α在造模后第四天显着升高，BMMSCs治疗组与之相比显著降低，提示BMMSCs治疗后局部促炎因子表达量下降。　　结论：　　成功地构建了良性气道狭窄的动物模型，操作简便，造模效果可靠，重复性好，可作为研究良性气管狭窄发生发展机制和检测治疗效果的新工具。通过体外共培养-划痕实验证实，BMMSCs可加速上皮修复;动物实验结果提示，气道机械损伤后，局部应用BMMSCs能够降低损伤局部炎症因子的表达，加速上皮组织修复，抑制肉芽过度增殖，可有效改善气道狭窄情况，或可作为临床上良性气管狭窄治疗的新方向。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分共培养体系划痕实验探索BMMSCs对上皮修复的作用

一、实验目的

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、本章小结

第二部分SD大鼠机械损伤良性气道狭窄模型的建立

一、实验目的

二、材料和方法

三、实验结果

四、讨论

五、本章小结

第三部分气道机械损伤后局部应用BMMSCs对良性狭窄治疗的可行性研究

一、实验目的

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、本章小结

第四部分气道机械损伤后局部应用BMMSCs对良性狭窄治疗的机制研究

一、实验目的

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、本章小结

总结

参考文献

文献综述 良性气道狭窄的诊疗现状

攻读学位期间发表论文及参加科研工作情况

致谢