一种超临界CO2流体萃取法提取紫杉醇的方法

摘要

本发明属于溶剂萃取技术领域，公开了一种超临界CO2流体萃取法提取紫杉醇的方法，将粉碎后的曼地亚红豆杉于超临界装置的萃取罐中；CO2和C2H2OH分别由CO2泵和夹带剂泵打入各泵的腔体中，经流体混合器混合后，流入萃取釜中的集流腔，进入萃取釜开始萃取；超临界CO2流体经分离釜Ⅰ和Ⅱ减压排放，流体带出的萃取物分别从分离釜Ⅰ和Ⅱ收集；将收集物真空浓缩，并于真空干燥后检测其中的紫杉醇含量。以甲醇为修饰剂和吸收液进行萃取时，在120min内可使紫杉醇萃取完全，萃取率达96.7％，萃取物中紫杉醇纯度可达到1％以上。与传统的乙醇三次提取方法相比，超临界流体萃取法流程简单，步骤少，耗时短，无废渣溶剂残留。

说明书

技术领域

本发明属于溶剂萃取技术领域，尤其涉及一种超临界CO

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：1971年美国化学家Wani等从产于北美的短叶红豆杉(T.brevifolia)树皮中分离出高抗癌活性紫杉烷二萜化合物紫杉醇，发现紫杉醇具有独特的抗肿瘤作用。紫杉醇临床研究始于1982年，到1989年完成了I、II期的临床试验，1990年进行III期临床试验。1992年12月29日美国国家食品与药物管理局(FDA)正式批准其作为晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌等抗癌药物上市。1995年紫杉醇作为新药在中国获得批准上市。

近年来，抗癌药物发展迅速，层出不穷。但是，抗癌第一大药仍是多年使用的老药-紫杉醇。目前，紫杉醇在世界各国均为医院首选的抗肿瘤药物。

紫杉醇从红豆杉中提取是其主要的来源之一。从红豆杉中提取紫杉醇，其特点是与FDA批准上市的紫杉醇结构一致。

目前从红豆杉提取紫杉醇的方法，大多采用乙酸乙酯、二氯甲化烷、丙酮、氯仿等有机溶剂对红豆杉原料多次浸提，浸提液回收后再用有机溶剂萃取，分离等步骤得到含紫杉醇的浸膏。这种方法存在的突出问题是：

1.工艺路线长，溶剂用量大。造成提取效率低，生产成本高，存在较大环保问题。

2.在浸提、回收过程中受热时间长，容易引起紫杉醇结构发生变化。

3.废渣残留有机溶剂。对人员和环境造成不良影响。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)工艺路线长，溶剂用量大。造成提取效率低，生产成本高，存在较大环保问题。

(2)在浸提、回收过程中受热时间长，容易引起紫杉醇结构发生变化。

(3)废渣残留有机溶剂。对人员和环境造成不良影响。

解决上述技术问题的难度和意义：红豆杉中的紫杉醇因其含量低、结构类似物较多，加上又是一种大分子、热敏性物质。受温度、有机溶剂、酸、碱等环境条件的影响，提取过程中易降解或异构生成其它紫杉烷类物质。这些特性给提取、分离带来了较大的困难。研究发现紫杉醇主要源于红豆杉的根、树皮以及枝叶。紫杉醇是红豆杉中的主要活性成分，该活性成份的化学结构是一种四环二萜化合物。因此，如何探索、选择以低成本、更环保、避免长时间受热的生产工艺提取紫杉醇具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种超临界CO

本发明是这样实现的，一种超临界CO

将粉碎后的曼地亚红豆杉于超临界装置的萃取罐中；

CO

超临界CO

将收集物真空浓缩，并于真空干燥后检测其中的紫杉醇含量。

进一步，将粉碎后的曼地亚红豆杉称取6000g于超临界装置的萃取罐中。

进一步，CO

进一步，将收集物真空浓缩，并于45℃真空干燥2h后检测其中的紫杉醇含量。

进一步，所述超临界CO

(1)色谱条件：C

(2)对照品溶液的制备：精密称取经五氧化磷干燥器内干燥24小时后的紫杉醇对照品1.0mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作为对照品溶液，浓度为0.1mg/ml；

(3)供试品溶液的制备：分别取CO

(4)曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇的含量测定：取曼地亚红豆杉枝条12.5g，精密称定，分别加甲醇50ml超声提取2次，过滤，合并滤液，蒸干，残渣加二氯甲烷～水＝2：145ml萃取3次，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，过0.45μm，注入液相色谱仪测定，重复测定3次。

进一步，所述超临界CO

进一步，所述超临界CO

取系统适用性试验溶液10μl注入液相色谱仪，紫杉醇峰与杂质I峰及杂质II峰的分离度均应大于1.0；

精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；同法测定对照品溶液；

按外标法，以峰面积计算，即得。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明利用超临界CO

本发明主要以法规允许采伐、人工种植的曼地亚红豆杉为原料；以无毒、无害、价廉的CO2为萃取剂；以药用C2H2OH为夹带剂；以具有一定规模的超临界萃取装置提取紫杉醇，并对实现工业化生产具有重要的现实意义。有效解决了提取效率低，生产成本高，避免长时间受热，对环境影响的问题。

附图说明

图1是本发明实施例提供的超临界CO

图2是本发明实施提供的SFE法色谱图(al—a4)～ql传统有机萃取法色谱图b图。

图3是本发明实施提供的Taxol的ESI正离子全范围扫描质谱图。

图4是本发明实施提供的SFE过程中紫杉醇含量随时间的变化关系图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对传统紫杉醇提取方法繁琐，耗时长。本发明的超临界流体萃取法流程简单，步骤少，耗时短，无废渣溶剂残留，是一种环境友好的提取方法。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的超临界CO

S101：将粉碎后的曼地亚红豆杉称取6000g于超临界装置的萃取罐中；

S102：CO

S103：超临界CO

S104：将收集物真空浓缩，并于45℃真空干燥2h后检测其中的紫杉醇含量。

下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。

实验1

本发明提供的仪器与试剂为：

SFT(SupercriticalFluidTechnology)公司150型SFE装置，Φ(CO

本发明提供的HPLC测定条件：柱温为35℃；流动相：甲醇：乙腈：水＝30：30：40(体积比)，流速为1.0mL/min；紫外检测波长227nm；每次进样体积为10uL；用W(紫杉醇)＝99.5％绘制外标工作曲线，对样品进行定量分析；

质谱分析条件：电喷雾化学解离(ESI)：全范围扫描为150--2000，壳气为70单位，辅助气为15单位，源电压为6kV，加热毛细管温度为250℃，蒸发器温度为465℃，质谱流动相为ACN：H

1、结果

1.1SFE法与传统有机溶剂萃取法对比实验

用同一批红豆杉枝叶样品I进行SFE法和传统有机溶剂萃取法的对比实验，提取液用HPLC测定紫杉醇含量。

(1)超临界CO

取2.1618g粒径为0.25～0.45mm的枝叶样品I在27.6MPa，31℃进行超临界CO

(2)传统有机溶剂萃取法

从红豆杉枝叶树皮中提取紫杉醇有机溶剂萃取法有多种，本实验采用的叫w(C

1.2提取产物分析

对比实验提取产物色谱图如图2所示；a1，a4分别为SFE法各段时间的收集液的色谱图，b为传统有机溶剂萃取物的色谱图，①号峰为紫杉醇.从图中可以看出，在SFE法和乙醇(95％)浸提法中，紫杉醇都被明显提取。

SFE法和传统有机溶剂萃取法所提出的产物对比如表1所示。从表中可以看出，实验材料用量小的情况下，SFE法在120min内就可达到传统有机溶剂提取法4d才能达到的萃取率.传统有机溶剂萃取法和SFE法所得的物质用液质联用分析，如图3可以看到在实验条件下，对①号峰进行全范围扫描，其中主要是m/Z＝876.2的[M+Na]

1.3萃取率

以甲醇为修饰剂的SFE法对紫杉醇有较好的萃取率，紫杉醇的含量随时间的变化关系如图4所示。

以各段时间SFE法萃取出的紫杉醇的量与传统有机溶剂萃取法提取出的总紫杉醇的量的比值作为纵坐标.柱状图表示在每一时间段萃取出的紫杉醇的量，线状曲线表示总计萃取率.从图中可以看出，随着萃取时间的增加，紫杉醇萃取率也增加，在30～60min吸收液中紫杉醇的含量最高，达69.2％，到120min时，萃取完全，紫杉醇的总提取率达96.7％。

表1 SFE法与乙醇(95％)浸提法产物对比

Tab.1 Gomparison of the extracts obtained from SFE and traditionalextraction of sample I.

1)表中的

SFE法与传统有机溶剂浸提法相比较，萃取效率相当，但SFE法流程简单、步骤少、耗时短。省去了一些分离精制步骤，生产周期短，效率高；无废渣溶剂残留，能最大程度保持各组分的原有特性；只对溶质起作用，不改变溶质之外的任何成分，不产生新的三废物质，对环保有利。

实验2

(一)技术方案

1.工艺流程：

曼地亚红豆杉枝条→鲜料净选→干燥→粉碎→超临界CO2流体萃取→萃取物含量检测

2.试验设备：超临界萃取设备，萃取釜容积24L。

3.试验原料：人工种植的曼地亚红豆杉。

4.萃取剂：CO

5.夹带剂：C

6.主要检测仪器：分析天平、HPLC。

(二)具体方法

1.试验原料的分析方法

1.1色谱条件：C

1.2对照品溶液的制备：精密称取经五氧化磷干燥器内干燥24小时后的紫杉醇对照品1.0mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作为对照品溶液，浓度为0.1mg/ml。

1.3供试品溶液的制备：分别取CO

1.4曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇的含量测定：取曼地亚红豆杉枝条12.5g，精密称定，分别加甲醇50ml超声提取2次，过滤，合并滤液，蒸干，残渣加二氯甲烷～水(2：1)45ml萃取3次，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，过0.45μm，注入液相色谱仪测定，重复测定3次。结果如表1。

表1：曼地亚红豆杉枝条中紫杉醇含量(％)

2.紫杉醇萃取的方法：

参考超临界CO

2.1将粉碎后的曼地亚红豆杉称取6000g于超临界装置的萃取罐中。

2.2CO

2.3超临界CO

2.4将收集物真空浓缩，并于45℃真空干燥2h后检测其中的紫杉醇含量。

3.萃取物的分析方法：

3.1检测所用仪器与试药为：

3.1.1仪器

电子分析天平(生产厂家：METTLERTOLEDO型号:XSE105)

高效液相色谱仪(生产厂家:Agilent型号：1260)

3.1.2对照品

紫杉醇对照品：

制造单位：中国食品药品检定研究所批号：100382-201603

残渣对照品：

紫杉醇杂质I：制造单位：中国食品药品检定研究所

批号：100926-201503

紫杉醇杂质II(7-表-10-去乙酰基紫杉醇)：

制造单位：中国食品药品检定研究所

批号：100925-201503

3.1.3试剂

甲醇：色谱纯TEDIA

乙腈：色谱纯TEDIA

3.2.所述材料为：(以下格式供参考)

3.2.1色谱条件的选择

色谱柱：AgilentZORBAXSB-C18(150mmx4.6mm，5um)；

流动相：甲醇：水：乙腈(23:41:36)

流速1.0mL/min；进样量10uL；紫外检测波长227nm。

按外标法以峰面积计算试样中紫杉醇的含量。

系统适用性试验溶液：精密称取紫杉醇、三尖杉宁醇(杂质I)与7-表-10-去乙酰基紫杉醇(杂质II)对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含紫杉醇0.5mg、杂质I与杂质II均为2.5μg的溶液，作为系统适用性试验溶液。

3.2.2对照品溶液的配制

精密称取紫衫醇对照品约12mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

3.2.3供试品溶液制备：取萃取物，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。

3.3所述萃取物中紫杉醇质量分数的测定方法如下：

3.3.1取系统适用性试验溶液10μl注入液相色谱仪，紫杉醇峰与杂质I峰及杂质II峰的分离度均应大于1.0。

3.3.2精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。同法测定对照品溶液。

3.3.3按外标法，以峰面积计算，即得。结果如表2。

表2：萃取物中紫杉醇(g)

本试验以曼地亚红豆杉枝条为原料，进行了超临界CO

两种提取方法工艺流程的比较；

(一)超临界CO

1.曼地亚红豆杉枝条→净选→干燥(水分≤15％)→粉碎(20～80目)→超临界CO

2.萃取条件：萃取釜压力30MPa，萃取釜温度45℃，萃取时间180min，CO

3.每个批次3个小时即可完成。

(二)目前有机溶剂萃取法的生产工艺流程(以提取紫杉醇含量≥0.08℅为例)

1.红豆杉枝条→净选→干燥(水分≤15％)→截切(0.5～1.5mm)→加甲醇热(50±3℃)循环提取3次，每次热循环时间1小时，合并提取液，真空减压浓缩。

2.加2倍量(V/V)粗品A的乙酸乙酯，搅拌使粗品A中的有效成分充分溶解于乙酸乙酯中，加1倍(V/V)粗品A量的饮用水，点动间隔搅拌10次，静置6小时；水相乙酸乙酯重复萃取2次。合并第一、二次萃取液，温度50～60℃、真空度≥-0.04MPa浓缩至干。

3.每个批次至少19个小时才能完成。

综上所述，本发明的显著特点：

1.能大幅提高了提取效率，降低长期运行的生产成本。

2.特别适用于热敏性物质的提取，提取物有效成分不易被破坏。

3.较目前大多采用的有机溶剂对红豆杉原料提取紫杉醇的方法，其残留的有毒有害污染物质降到了零，更有利于对人员和环境的保护。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。