一种全液相合成地洛瑞林的方法

摘要

本发明提供了一种全液相合成地洛瑞林的方法，包括：将R4‑Pyr‑His(R3)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑OH与H‑Arg(pbf)‑Pro‑NHEt进行缩合反应，得到R4‑Pyr‑His(R3)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(pbf)‑Pro‑NHEt，然后将其在切割液中进行反应，得到地洛瑞林。与现有技术相比，本发明通过全液相合成法，生产工艺绿色、温和，没有使用任何剧毒、易制毒试剂，并且生产的产品纯度高，粗品可达90％以上，成本极大降低，非常适合大规模生产。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种全液相合成地洛瑞林的方法。

背景技术

地洛瑞林(Deslorelin)，其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt，是一种促黄体激素释放激素(LHRH)，可用于治疗中枢性性早熟症，另外美国学者Shore等报告，对于晚期前列腺癌症患者，每年一次给予地洛瑞林长效埋植剂皮下埋植，能长期稳定地抑制睾酮，使其保持去势水平。

目前地洛瑞林的合成方法主要是固相合成。固相合成中需要使用大量的昂贵的多肽树脂，这不仅给企业的大规模生产带来成本的压力，而且使用溶剂多，使用易制毒试剂，环保压力大，而且在最后切肽的工序中，叔丁基很容易在酸性条件下被脱除，生成其他杂质产物，导致产品粗品纯度低。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种全液相合成地洛瑞林的方法，该方法得到产品粗品纯度较高。

本发明提供了一种全液相合成地洛瑞林的方法，包括：

S1)将R

S2)将所述R

优选的，所述H-Arg(pbf)-Pro-NHEt按照以下方法制备：

将R

其中R

优选的，所述R

将R

其中R

优选的，所述R

将R

优选的，所述H-His(R

Fmoc-His(R

优选的，所述H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR

将Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH与H-D-Trp-Leu-OR

优选的，所述Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH按照以下方法制备：

将Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Osu与H-Tyr(tBu)-OH进行缩合反应，得到Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH。

优选的，所述H-D-Trp-Leu-OR

将R

其中R

优选的，所述R

所述R

所述R

所述R

优选的，所述步骤S1)中缩合反应在有机碱与缩合剂存在的条件下进行；所述有机碱选自DIEA、TEA与NMM中的一种或多种；所述缩合剂选自DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU与HATU中的一种或多种；

所述步骤S1)中缩合反应还加入活化剂；所述活化剂选自HOSu、HOBt、HOAt与HOOBt中的一种或多种；

所述步骤S2)中的切割液包括TFA、TIS与H

本发明提供了一种全液相合成地洛瑞林的方法，包括：S1)将R

附图说明

图1为本发明实施例中得到的化合物1的液相色谱图；

图2为本发明实施例中得到的化合物2的液相色谱图；

图3为本发明实施例中得到的化合物6的液相色谱图；

图4为本发明实施例中得到的化合物9的液相色谱图；

图5为本发明实施例中得到的化合物10的液相色谱图；

图6为本发明实施例中得到的化合物11的液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种全液相合成地洛瑞林的方法，包括：

S1)将R

S2)将所述R

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售或自制均可。

在本发明中，所述H-Arg(pbf)-Pro-NHEt优选按照以下方法制备：将R

在本发明中，所述R

在本发明中，所述R

在本发明中，所述H-His(R

在本发明中，所述H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR

在本发明中，所述Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH优选按照以下方法制备：将Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Osu与H-Tyr(tBu)-OH进行缩合反应，得到Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH；所述Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Osu与H-Tyr(tBu)-OH的摩尔比优选为1：(1.05～2)；所述缩合反应优选在有机碱存在的条件进行；所述H-Tyr(tBu)-OH与有机碱的摩尔比优选为1：1.2，更优选为1：1.05，再优选为1：1；所述有机碱优选为DIEA、TEA与NMM中的一种或多种；所述缩合反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂选自DMF、THF、甲醇、乙醇与NMP中的一种或多种；在本发明中，此步骤优选先将Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Osu溶于有机溶剂后，依次加入H-Tyr(tBu)-OH与有机碱进行缩合反应；所述缩合反应的时间优选为40～80min，更优选为50～70min，再优选为60min；缩合反应后，优选加入酸性溶液快速搅拌析出；所述酸性溶液优选为盐酸溶液；所述酸性溶液的浓度优选为0.3～0.6mol/L，更优选为0.5mol/L；然后优选过滤、洗涤至中性，干燥，得到Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH；所述干燥的温度优选为30℃～35℃。

在本发明中，所述H-D-Trp-Leu-OR

将R

将所述R

本发明通过全液相合成法，生产工艺绿色、温和，没有使用任何剧毒、易制毒试剂，并且生产的产品纯度高，粗品可达90％以上，成本极大降低，非常适合大规模生产。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种全液相合成地洛瑞林的方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售；在本发明中如无特殊说明，所述冷浴均为冰浴。

本发明权利要求书和说明书中出现物质的英文缩写对应的中文名称见表1。

表1中英文对照表

实施例1

1、合成化合物1：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH

1.1投料：

按照表2的物料进行投料。

表2物料种类及用量

1.2操作过程

将合成Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSu用DMF完全溶解后，再准确称取H-Tyr(tBu)-OH加入上述反应瓶，加TEA 110mmol开始反应。搅拌反应60min后，HPLC检测反应完全。

将反应液分两次倒入三角瓶中，再加入0.5M盐酸快速搅拌析出，过滤的固体，然后用纯化水洗至中性，30℃干燥。收集固体装至容器中，称重。

利用HPLC对得到的化合物1进行分析，得到液相色谱图如图1所示。

化合物1的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min,70％B～90％B；

收率：97％；纯度：87.5％。

2、合成化合物2：Fmoc-D-Trp-Leu-OMe.HCl

2.1投料

按照表3的物料进行投料。

表3物料种类及用量

2.2操作过程：

准确称取Fmoc-D-Trp-OH、HOSU于反应瓶中，用DMF完全溶解后，再称取H-Leu-OMe.HCl于三角瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min，加入TEA，快速摇匀，加入上述反应瓶中，继续冷浴5min后加入DCC开始反应。

反应1.5h后HPLC检测反应完全。

待完全反应后过滤反应液，用0.5M盐酸水溶液析出，过滤的固体，然后用纯化水洗至中性，30℃干燥。收集固体装至三角瓶中，称重。

利用HPLC对得到的化合物2进行分析，得到液相色谱图如图2所示。

化合物2的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，50％B～90％B；

收率：103.6％，纯度：94.1％。

3、合成化合物3：H-D-Trp-Leu-OMe

3.1按照表4投料。

表4物料用量及种类

3.2操作过程

准确称取Fmoc-D-Trp-Leu-OMe.HCl于反应瓶中，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，真空干燥，得到化合物3。

利用HPLC对得到的化合物3进行分析，确定得到目标产物。化合物3的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，3％B～10％B；

收率：89.2％；纯度：89.4％。

4、合成化合物4：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe

4.1投料：

表5物料用量及种类

4.2操作过程

准确称取Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DIEA，再将H-D-Trp-Leu-OMe用DCM溶解后加入反应中开始反应。反应1.0h后HPLC检测反应完全，浓缩，用0.5M盐酸沉淀，过滤收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，称重，得到化合物4。

利用HPLC对得到的化合物4进行分析，确定得到目标产物。化合物4的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，50％B～90％B；

收率：92.3％；纯度：81％。

5、合成化合物5：H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe

5.1投料

按照表6的物料投料。

表6物料用量及种类

5.2操作过程

准确称取Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe于反应瓶中，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，真空干燥。

利用HPLC对得到的化合物5进行分析，确定得到目标产物。化合物5的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min；70％B～90％B；

收率：97％；纯度：85.4％。

6、合成化合物6：H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe

6.1投料

按照表7的物料进行投料。

表7物料用量及种类

6.2操作过程

准确称取Fmoc-His(Trt)-OH、HOBt、H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DCC开始反应。

反应1.5h后HPLC检测反应完全，过滤反应液，倒入反应瓶中，再加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入0.5M盐酸溶液析出固体，过滤，烘干。

取Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe于反应瓶中，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，烘干，得到化合物6。收率：85％，纯度：81.8％。

利用HPLC对得到的化合物6进行分析，得到液相色谱图如图3所示。

化合物6的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，70％B～90％B。

7.合成化合物7：Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe

7.1投料

按照表8的物料进行投料。

表8物料用量及种类

7.2操作过程

准确称取Boc-Pyr-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DIEA，再将H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe用DMF溶解后加入反应中开始反应。

反应1.5h后HPLC检测反应完全，过滤反应液，滤渣用DMF洗涤两次，用0.5M盐酸沉淀，过滤后收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重；收率：81％，纯度：85.1％。利用以下检测条件确定得到目标产物。

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，80％B～95％B。

8、合成化合物8：Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH

8.1投料

Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe 59.8mmol；

甲醇：1110ml；

2M NaOH:110ml；

0.1M盐酸溶液：2L。

8.2操作过程

称取Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe，置于甲醇中搅拌5min完全溶解后，取2M NaOH缓慢加入反应，开始反应。反应3h后HPLC检测反应完全，加入盐酸溶液，沉淀，过滤后收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重，得到化合物8；收率：74％，纯度：88.9％。

利用HPLC对得到的化合物8进行分析，确定得到目标产物。检测方法：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min,70％B～90％B。

9、合成化合物9：Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt

9.1投料

表9物料用量及种类

9.2操作过程

准确称取Fmoc-Arg(pbf)-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min，加入DIEA，撤掉冷浴，反应20min。

称取H-Pro-NHEt.HCl于三角瓶中，用DMF完全溶解后加入TEA，快速混匀后加入上反应中开始反应。

反应2h后HPLC检测反应完全，用0.5M盐酸沉淀，过滤后收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重；收率112％，纯度：99.4％。

利用HPLC对得到的化合物8进行分析，得到液相色谱图如图4所示。

检测方法：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，50％B～90％B。

10、合成化合物10：H-Arg(pbf)-Pro-NHEt

10.1投料

Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt.HCl：150mmol；

二乙胺：500ml。

10.2操作过程

准确称取Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt.HCl于反应瓶中，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，真空干燥，得到化合物10。收率88％，纯度70％。

利用HPLC对得到的化合物10进行分析，得到液相色谱图如图5所示。

检测方法：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min,5％B～50％B。

11、合成化合物11：Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt

11.1投料

表10物料用量及种类

11.2操作过程

准确称取Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DIEA，再将H-Arg(pbf)-Pro-NHEt用DMF溶解后加入反应中开始反应。

反应1.0h后HPLC检测反应完全，加入0.5M盐酸析出固体，过滤收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重，得到化合物11。收率102.1％，纯度：74.9％。

利用HPLC对得到的化合物11进行分析，得到液相色谱图如图6所示。

12、合成地洛瑞林粗品

12.1投料

Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHE t：44.2mmol；

切割液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)：300ml。

12.2操作过程

将Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt加入反应瓶中，加入切割液反应30min后用冷冻乙醚沉淀，过滤，收集固体，得到产物粗品，产物用水溶解后HPLC检测分析。

收率：79.7％，纯度93.1％。