一种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵及应用

摘要

一种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵及应用，本发明具有有序微通道的海绵在与血液接触时可以快速引导和吸收血液，大量规则排列的红细胞聚集在海绵底部的微孔结构中，这种结构化有序微通道和无序孔相结合制成的海绵大大缩短了凝血时间，提高了止血效率，本发明所用的原材料均具有优异的生物相容性，在临床使用过程中排除了潜在的生物安全性和副作用，所用的原材料均具有优异的血液相容性，不会引起溶血反应，不影响内、外源凝血通路。

说明书

技术领域

本发明涉及止血材料技术领域，具体涉及一种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵及应用。

背景技术

意外创伤是一个不可避免的问题，生理性止血在一定程度上可以缓解意外创伤带来的伤害。首先，在受损血管附近的小血管收缩，使局部血流减少。然后局部受损红细胞释放 ADP 和局部凝血过程中生成的凝血酶均可使血小板活化而释放内源性 ADP、TXA2，进而激活和募集更多血小板，形成血小板止血栓堵塞伤口，实现初步止血。最后凝血因子按一定顺序相继激活，生成凝血酶，最终使血浆中可溶性纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白，并交织成网，以加固止血栓，完成止血。

然而在突发性的事故、手术和战争中，人体的自然凝血级联响应出血被激活，但无法满足深部和不可压缩的贯穿伤引起的严重出血。这是一个急需解决的全球性问题。有效控制出血在军事领域和平民创伤领域尤为重要。据报道，有30%至40%的死亡是由于大出血造成的，全世界每年造成580万以上的死亡。此时，有效的止血剂可以在一定程度上避免失血过多而导致的高死亡率。过去几年常用的止血剂大多是纱布，绷带 ，沸石基QuikClot，明胶海绵。但这些止血剂在面对不可压缩的贯穿伤时有一定的局限性。目前迫切需要一种新型止血技术来有效控制伤口出血。

最近具有个性化形状和定制结构的3D打印作为一种用于伤口愈合应用的新技术得到了广泛应用，可以通过3D扫描定制具有复杂孔隙结构的伤口敷料。3D打印提供了一种独特且有效的方法来制造性能更高的复杂多孔结构。在组织工程中，这种简单且可控制的架构能够改善营养物质和氧气的运输、增强宿主细胞浸润、促进血管生成以及与周围组织的整合。使用3D打印的多孔模板可以增加孔的体积，更重要的是，可以实现开孔，使液体通过毛细作用进入开放通道并迅速达到溶胀平衡。

发明内容

为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵及应用。

本发明采用的技术解决方案是：一种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵,所述的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵由聚乙烯醇、具有主动止血功能的聚合物和交联剂组成，所述的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵通过以下步骤制备：

（1）制备3D打印牺牲模板：在3D制图软件上设计了一个3D空心立方体模型，3D空心立方体模型的表面设计有上大下小的倒锥体结构，所述的倒锥形结构的大口为位于3D空心立方体模型的表面的上口，小口为位于3D空心立方体模型的内部的下口，倒锥形结构的的锥度为1/3-3/4，将3D空心立方体模型以熔融堆积或光刻成型的方式得到3D打印牺牲模板；

（2）将聚乙烯醇溶解在超纯水中，配置成质量浓度在5%-15%的聚乙烯醇悬浊液，升温，再向其中加入1%-5%具有主动止血功能的聚合物，冷却至室温；

（3）向步骤（2）得到的原料中加入0.1%-0.5%的发泡剂，在1500rmp转速下剧烈搅拌用于发泡，再在1个小时内滴加0.25%-5%的1mol/L的浓度HCl；

（4）向步骤（3）得到的产物中加入0.025%-0.05%的交联剂，在1000rmp转速下交联半个小时，并将交联好的溶液倒入步骤（1）制备的的3D打印牺牲模板模具中并放入烘箱使其反应充分；

（5）将交联好的海绵脱模，最后经过冷冻干燥得到基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵。

所述的聚乙烯醇为聚乙烯醇1788、聚乙烯醇0588、聚乙烯醇1099、聚乙烯醇1792、聚乙烯醇0486、聚乙烯醇1799中的一种或几种。

所述的具有主动止血功能的聚合物为海藻酸钠、壳聚糖、明胶、凝血酶、纤维蛋白、高岭土，蒙脱石和生物活性玻璃中的一种或几种。

所述的交联剂为甲醛、戊二醛、乙醛、乙二醛中的一种或几种。

所述的倒锥形结构的位于3D空心立方体模型的表面的上口的直径为0.5-3mm。

所述的倒锥形结构的位于3D空心立方体模型的内部的下口的直径为50-200μm。

所述的倒锥形结构为倒圆锥或者倒棱锥结构。

所述的聚乙烯醇海绵上还具有发泡形成的无序微孔结构。

一种所述的基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵在制备止血材料上的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵及应用，本发明具有有序微通道的海绵在与血液接触时可以快速引导和吸收血液，大量规则排列的红细胞聚集在海绵底部的微孔结构中，这种结构化有序微通道和无序孔相结合制成的海绵大大缩短了凝血时间，提高了止血效率，本发明所用的原材料均具有优异的生物相容性，在临床使用过程中排除了潜在的生物安全性和副作用，所用的原材料均具有优异的血液相容性，不会引起溶血反应，不影响内、外源凝血通路。

附图说明

图1为本发明实施例3D打印模具示意图。

图2为本发明多孔聚乙烯醇海绵的SEM表征图。

图3为本发明多孔聚乙烯醇海绵的Micro-CT表征。

图4为实施例多孔聚乙烯醇海绵的最大吸液比。

图5为实施例多孔聚乙烯醇海绵的吸水速率。

图6为实施例序多孔聚乙烯醇海绵的孔隙率。

图7为实施例多孔聚乙烯醇海绵的全血凝血指数。

图8为实施例多孔聚乙烯醇海绵的血小板和红细胞吸附的SEM图。

图9为实施例多孔聚乙烯醇海绵的体外凝血时间。

图10为实施例多孔聚乙烯醇海绵的吸血时间。

图11为实施例多孔聚乙烯醇海绵的APTT。

图12为实施例多孔聚乙烯醇海绵的PT。

图13为大鼠肝脏缺损实验止血过程。

图14为实施例多孔聚乙烯醇海绵在肝脏损伤模型中出血量统计。

图15为实施例多孔聚乙烯醇海绵在肝脏损伤模型中出血时间统计。

图16为大鼠股动脉穿刺实验止血过程。

图17为实施例多孔聚乙烯醇海绵在股动脉损伤模型中出血量统计。

图18为实施例多孔聚乙烯醇海绵在股动脉损伤模型中出血时间统计。

图19为实施例多孔聚乙烯醇海绵的溶血率。

图20为实施例多孔聚乙烯醇海绵的细胞毒性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵，通过以下步骤制备：

（1）以光刻成型的方式得到3D打印牺牲模板。使用液态光敏树脂作为3D打印材料。首先，在SolidWorks 2019软件上设计了一个3D空心立方体，内部设定了49个锥度为0的锥体结构。作为STL格式导入打印软件CHITUBOX，设置好打印参数。最后将程序导入3D打印机进行印刷。

（2）将聚乙烯醇溶解在超纯水中，配置成质量浓度在5%-15%的聚乙烯醇悬浊液，升温至95℃。再向其中加入1%-5%的海藻酸钠，冷却至室温。

（3）向（2）中加入0.1%-0.5%的发泡剂，在1500rmp转速下剧烈搅拌用于发泡，再用注射泵在1个小时内滴加0.25%-5%的 HCl(1mol/l)。

（4）向（2）中加入0.025%-0.05%的交联剂在1000rmp转速下交联半个小时，并将交联好的溶液倒入（1）准备好的模具中并放入70°C烘箱4个小时使其充分反应。

（5）将交联好的海绵脱模，最后经过冷冻干燥得到基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵。

实施例2

（1）以光刻成型的方式得到3D打印牺牲模板。使用液态光敏树脂作为3D打印材料。首先，在SolidWorks 2019软件上设计了一个3D空心立方体，内部设定了49个锥度为1/2的锥体结构。作为STL格式导入打印软件CHITUBOX，设置好打印参数。最后将程序导入3D打印机进行印刷。

（2）将聚乙烯醇溶解在超纯水中，配置成质量浓度在5%-15%的聚乙烯醇悬浊液，升温至95℃。再向其中加入1%-5%的海藻酸钠，冷却至室温。

（3）向（2）中加入0.1%-0.5%的发泡剂，在1500rmp转速下剧烈搅拌用于发泡，再用注射泵在1个小时内滴加0.25%-5%的 HCl(1mol/l)。

（4）向（2）中加入0.025%-0.05%的交联剂在1000rmp转速下交联半个小时，并将交联好的溶液倒入（1）准备好的模具中并放入70°C烘箱4个小时使其充分反应。

（5）将交联好的海绵脱模，最后经过冷冻干燥得到基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵。

实施例3

（1）以光刻成型的方式得到3D打印牺牲模板。使用液态光敏树脂作为3D打印材料。首先，在SolidWorks 2019软件上设计了一个3D空心立方体，内部设定了49个锥度为2/3的锥体结构。作为STL格式导入打印软件CHITUBOX，设置好打印参数。最后将程序导入3D打印机进行印刷。

（2）将聚乙烯醇溶解在超纯水中，配置成质量浓度在5%-15%的聚乙烯醇悬浊液，升温至95℃。再向其中加入1%-5%的海藻酸钠，冷却至室温。

（3）向（2）中加入0.1%-0.5%的发泡剂，在1500rmp转速下剧烈搅拌用于发泡，再用注射泵在1个小时内滴加0.25%-5%的 HCl(1mol/l)。

（4）向（2）中加入0.025%-0.05%的交联剂在1000rmp转速下交联半个小时，并将交联好的溶液倒入（1）准备好的模具中并放入70°C烘箱4个小时使其充分反应。

（5）将交联好的海绵脱模，最后经过冷冻干燥得到基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵。

试验检测

对实施例1，2，3中对这种具有结构化微通道的有序结构进行了3D打印，如图1所示。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行了SEM表征。如图2所示。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行了Micro-CT表征。如图3所示。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行了最大吸液比和吸水速率测试，结果如图4、图5所示。表明这种基于3D打印模板制备的有序多孔结构的聚乙烯醇海绵吸水量可以达到自身重量的20倍以上，并且实施例3中的特殊结构海绵具有最大的吸水量。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵的孔隙率进行了测试。如图6所示。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵的全血凝血指数进行了测试。结果如图7所示。

具体实验步骤：首先，0.2 g 海绵样品放置在塑料表面皿上，在 37

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行血小板和红细胞的吸附研究。结果如图8所示。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵的体外凝血时间进行了测试。结果如图9所示。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行吸血时间研究。结果如图10所示。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行了APTT和PT测试。结果如图11、图12所示。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行了肝脏出血止血研究。结果如图13、图14、图15所示。

具体实验步骤：用 10%水合氯醛定量腹腔注射麻醉大鼠，剪掉其腹毛，打开腹腔并暴露肝脏，在肝脏底部放一张提前称量好的滤纸以评估出血量。用直径为5mm的打孔器创建肝脏体积缺损模型。用注射器将实验样本打入出血点，观察出血情况，直至止血完成。记录止血时间并测定滤纸及样本吸收的出血量。

对实施例1、2、3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行了股动脉出血止血研究。结果如图16、图17、图18所示。

具体实验步骤：用 10%水合氯醛定量腹腔注射麻醉大鼠，刮去其腿毛，将腹股沟上盖肌打开并暴露股动脉。使用解剖针进行穿刺制造深度为 0.5 mm 的出血伤口。取实验样本放置于出血部位，用预先称重的消毒纱布对创面进行手动按 压。轻轻举起样本，每隔 5秒观察出血情况，直至止血完成。记录止血时间，测定预称重纱布和样本吸收的出血量。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行了溶血率测试。结果如图19所示。

具体实验步骤：采集健康献血者的血液放于抗凝管中。取 1 ml 全血用 5 ml NS进行稀释。 将 5mg 海绵样品加入到 1 ml 的稀释全血中并在 37 ℃下孵育作用 2 h。取相同量的稀释全血分别加入到 DW 和 NS 中并作为阳性和阴性对照孵育作用 2 h。随 后，所有样品 3000 rpm 离心 10 min。吸取 200 μl上清液加入到 96 孔板中并用酶标仪检测其在540 nm 处的吸光度值。

实施例1、2、3组海绵的溶血率分别为0.47%，0.50%和0.40%，均在生物材料允许范围内（小于5%）。该止血海绵不会引起溶血现象，具有很好的生物相容性。

对实施例1，2，3中对这种基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵进行了细胞毒性研究。采用CCK-8法研究了三组海绵的体外细胞毒性。结果如图20所示。

细胞毒性实验表明，实施1-3中基于3D打印模板制备的具有有序多孔结构的聚乙烯醇海绵具有很好的细胞相容性。

各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。