一种肿瘤肝转移组织免疫细胞的获取方法

摘要

本发明涉及动物细胞提取技术领域，具体涉及一种肿瘤肝转移组织免疫细胞的获取方法。所述的获取方法包括以下步骤：S1.肿瘤细胞的培养及脾脏注射；S2.肿瘤肝转移组织的处理；S3.肿瘤肝转移组织免疫细胞的分选。通过本发明方法能够获取高纯度的肿瘤肝转移组织免疫细胞。同时本发明方法操作简单，耗时少，一小时内可完成细胞提取操作过程，能最大程度上保持细胞活力，获得的肿瘤肝转移组织免疫细胞可作为研究材料，用于肝脏肿瘤转移微环境免疫细胞组分以及免疫细胞功能失调的相关研究，有很高的临床医学应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞提取技术领域，具体涉及一种肿瘤肝转移组织免疫细胞的获取方法。

背景技术

肝脏是人体极为重要的脏器，具有代谢、内分泌、免疫和解毒等多种功能。在恶性肿瘤病人中，肝脏是乳腺癌、结直肠癌、胃癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤好发的远处转移部位。流行病学调查的结果显示，发生肝转移的患者往往预后极差，几乎没有有效的治疗措施。因此，进一步了解肿瘤肝转移的机制并寻找靶向的干预方法是目前肿瘤研究领域迫切需要解决的关键问题。

近年来基础与临床研究已证实免疫治疗在肿瘤的综合治疗中具有重要地位，多种免疫治疗的新药已成为晚期肿瘤患者的一线治疗方案。肝脏作为远处转移器官有着独特的免疫细胞组成的微环境，但是目前对肝脏肿瘤转移微环境免疫细胞组分以及免疫细胞功能失调的认识仍较为缺乏，而开展研究的第一步是获得稳定的肿瘤肝转移组织免疫细胞。因此，尚缺少一种快速、稳定的肿瘤肝转移组织免疫细胞获取方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种肿瘤肝转移组织免疫细胞的获取方法，以达到快速获取高纯度肿瘤肝转移组织免疫细胞的目的。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

一种肿瘤肝转移组织免疫细胞的获取方法，包括以下步骤：

S1.肿瘤细胞的培养及脾脏注射：将肿瘤细胞培养至对数生长期后用胰酶进行消化，细胞悬液离心后用PBS重悬；按每只受试动物5×10

S2.肿瘤肝转移组织的处理：12-15天后处理受试动物尸体；取出肿瘤肝转移组织，剪碎、研磨过滤后得组织悬液，用PBS稀释；将组织悬液离心后，取上层液体再次离心，弃去上清后用37.5％Percoll溶液重悬细胞沉淀，离心后弃去上清；用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，冰上裂解后加入PBS停止裂解；离心后弃去上清，用PBS重悬，再次离心后弃上清；

S3.肿瘤肝转移组织免疫细胞的分选：利用CD45磁珠分选CD45+细胞，即得肿瘤肝转移组织中的免疫细胞。

具体地，步骤S1中脾脏注射的步骤为：将受试动物麻醉后消毒腹部，剪开受试动物左上腹部皮肤和腹壁，找到并固定脾脏，按每只受试动物1×10

具体地，步骤S2中处理受试动物尸体的步骤为：麻醉受试动物，眼球取血法去除多余血液，75％酒精浸泡尸体10分钟。此步骤目的为消毒小鼠。

具体地，步骤S2中取出肿瘤肝转移组织后，剪碎至1-3mm

具体地，步骤S2中将组织悬液于60-80×g常温离心1-3分钟，去除脂肪组织，取上层液体后于480-600×g常温离心8-10分钟去除坏死组织，弃上清后利用10-14mL 37.5％Percoll溶液重悬细胞沉淀，于850-900×g常温离心30-35分钟后弃上清，即可得到肝脏内全部免疫细胞。

优选地，步骤S2中将组织悬液于60×g常温离心1分钟，取上层液体后于480×g常温离心8分钟，弃上清后利用10mL37.5％Percoll溶液重悬细胞沉淀，于850×g常温离心30分钟后弃上清。

具体地，步骤S2中用3-5mL红细胞裂解液重悬细胞沉淀，冰上裂解3-5分钟后加入10-12mL PBS停止裂解。此步骤目的为裂解红细胞。

具体地，步骤S2中加入PBS停止裂解后，于500-800×g常温离心5-7分钟后弃上清，用10-12mL PBS重悬细胞，再次于500-600×g常温离心5-7分钟后弃上清。

优选地，步骤S2中加入PBS停止裂解后，于500×g常温离心5分钟后弃上清，用10mLPBS重悬细胞，再次于500×g常温离心5分钟后弃上清。

本发明优选进行磁珠分选，因为如果不磁珠分选，分离出的免疫细胞纯度为78％，分选之后纯度达到96％。

具体地，步骤S3中利用CD45磁珠分选CD45+细胞的步骤为：用MACS缓冲液重悬细胞，加入CD45磁珠后孵育10分钟，通过磁力分选架分离CD45+免疫细胞，于500×g离心后用PBS和2％FBS重悬。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)通过本发明方法，能够获取高纯度的肿瘤肝转移组织免疫细胞，可作为研究材料，用于肝脏肿瘤转移微环境免疫细胞组分以及免疫细胞功能失调的相关研究，有很高的临床医学应用价值。

(2)本发明方法操作简单，耗时少，一小时内可完成细胞提取操作过程，能最大程度上保持细胞活力，不影响后续研究实验。

附图说明

图1为胰腺癌细胞肝转移大体组织。

图2为胰腺癌细胞肝转移组织中免疫细胞流式分析结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

仪器和试剂：

CO

受试动物：小鼠。

实施例

一种肿瘤肝转移组织免疫细胞的获取方法，包括以下具体步骤：

(1)KPC胰腺癌细胞系培养基为含10％FBS的DMEM溶液，将KPC细胞接种于10cm培养皿中，37℃、5％CO

(2)采用37℃胰酶消化KPC细胞1分钟，加入2mL培养基终止消化并反复吹打细胞，将细胞悬液于300×g常温离心5分钟后洗除上清，用PBS重悬细胞；

(3)C57BL/C小鼠异氟烷气体吸入麻醉，仰卧位固定小鼠，用含75％酒精的棉球擦拭小鼠腹部3次以消毒；

(4)利用无菌的剪刀小心剪开小鼠左上腹部皮肤和腹壁，利用无菌镊子在腹腔中找到脾脏并固定，利用1mL注射器吸取1×10

(5)用镊子小心将脾脏放回腹腔，4-0可吸收无菌缝合线缝合小鼠腹壁和皮肤；

(6)期间密切观察小鼠状态，第12天将小鼠异氟烷吸入麻醉，摘除小鼠眼球并放血约1mL，75％酒精浸泡小鼠10分钟；

(7)沿腹中线小心剪开小鼠皮肤和腹壁，暴露肝脏组织，剪刀沿肝脏边缘完整去除肝脏组织，根据组织形态判断肿瘤肝转移部位，用剪刀去除转移旁组织(图1)，保留肿瘤转移组织并转移至40μm孔径尼龙滤器中；

(8)剪刀将肿瘤肝转移组织剪成约1mm

(9)将组织悬液于60×g常温离心1分钟，弃组织碎片等沉淀，取上层液体转移至15mL离心管中，于480×g常温离心8分钟，弃上清后利用10mL37.5％Percoll溶液重悬细胞沉淀，于850×g常温离心30分钟；

(10)将上层液体吸除，迅速使用3mL红细胞裂解液重悬细胞，冰上裂解3分钟，期间吹打细胞悬液3次，加入10mLPBS停止裂解；

(11)于500×g常温离心5分钟后弃上清，用10mLPBS重悬细胞并再次于500×g常温离心5分钟后弃上清；

(12)根据CD45磁珠说明书进一步分离免疫细胞：利用MACS缓冲液(PBS+2mM EDTA+0.5％FBS)重悬细胞，加入CD45磁珠后孵育10分钟，通过磁力分选架分离CD45+免疫细胞，于500×g离心后利用PBS+2％FBS重悬；

(13)对免疫细胞进行流式染色：调整细胞浓度为1×10

结果显示(如图2所示)，细胞悬液中超过99％的细胞为CD45+免疫细胞，其中中性粒细胞(Ly6G+)占比32.3％，巨噬细胞(F4/80+)占比16.5％，DC细胞(CD11c+)占比10.7％，CD4T细胞(CD4+)占比7.7％，CD8T细胞(CD8+)占比9.4％，B细胞(CD19+)占比27.9％。

综上，本发明方法能快速得到高纯度肿瘤肝转移组织免疫细胞。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。