一种电化学免疫用DNA甲基化位点对数量检测方法

摘要

本发明公开了一种电化学免疫用DNA甲基化位点对数量检测方法，包括以下步骤：步骤一，抽血采样；步骤二，梯度分离；步骤三，细胞裂解；步骤四，磁珠分离；步骤五，洗脱提取；步骤六，位点检测；其中在上述步骤一中，用医用注射器从待测体上抽取适量的血液，并注入医用采血管中，密封保存，得到血液样本；其中在上述步骤二中，用医用滴管从步骤一中得到的血液样本中取预定量滴入医用离心管中，并加入适量的淋巴细胞分离液，密封后再将医用离心管放到超速离心机上进行密度梯度离心，分离PBMC后得到血清样本；该发明采用磁珠法分离纯化DNA，简化了流程，降低了操作的难度，试样中DNA纯度高、含量多，分离效果好、用时短，检测通量高。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA甲基化技术领域，具体为一种电化学免疫用DNA甲基化位点对数量检测方法。

背景技术

DNA甲基化，一般指的是在DNA甲基化转移酶的作用下将甲基选择性地添加到基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶上形成5mC的过程，能够在不改变DNA序列的前提下，引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，改变遗传表现。目前，行业内主要采用光电化学分析方法，通过光电化学免疫传感器将DNA甲基化过程中变化的光信号转变成电信号，从而对DNA上的甲基化位点进行分析，检测甲基化序列位点的数量。

然而，现有电化学免疫用DNA甲基化位点对数量检测方法大多采用传统DNA提取方法，流程繁琐，操作不便，试样中DNA纯度低、含量少，分离效果差、用时长，检测通量低，且对试样除杂力度不足，试样中杂质较多，不可避免的影响了DNA甲基化的效率，降低了DNA甲基化位点对数量的检测精度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种电化学免疫用DNA甲基化位点对数量检测方法，以解决上述背景技术中提出DNA纯度低、操作不便以及检测精度差的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种电化学免疫用DNA甲基化位点对数量检测方法，包括以下步骤：步骤一，抽血采样；步骤二，梯度分离；步骤三，细胞裂解；步骤四，磁珠分离；步骤五，洗脱提取；步骤六，位点检测；

其中在上述步骤一中，用医用注射器从待测体上抽取适量的血液，并注入医用采血管中，密封保存，得到血液样本；

其中在上述步骤二中，用医用滴管从步骤一中得到的血液样本中取预定量滴入医用离心管中，并加入适量的淋巴细胞分离液，密封后再将医用离心管放到超速离心机上进行密度梯度离心，分离PBMC后得到血清样本；

其中在上述步骤三中，将步骤二中得到的血清样本倒入医用试管中，并加入适量的裂解液，再放到振荡器上混合均匀，使细胞壁、细胞核和细胞器破裂，并分散在裂解液中，得到裂解样本；

其中在上述步骤四中，将适量的磁珠加入医用试管中，与步骤三中得到的裂解样本混合均匀，再将医用试管放到磁珠分离器上，利用磁场力使磁珠分散在裂解样本中，并吸附住DNA，得到分离样本；

其中在上述步骤五中，将适量的洗涤液加入医用试管中，与步骤四中得到的分离样本混合均匀，静置后沉淀分层，弃去上清液，再将适量的洗脱液加入下浊液中混合均匀，使DNA脱离磁珠并溶解在洗脱液中，静置后沉淀分层，取上清液，得到试样；

其中在上述步骤六中，将步骤五中得到的试样倒在光电化学免疫传感器的感应区，并将适量的DNA甲基化转移酶和预制引物滴加入试样中，使试样中的DNA发生甲基化、预制引物中的未反应物发出荧光，光电化学免疫传感器再将荧光的光信号转换成电信号，并传输给检测仪器，即得DNA甲基化位点对数量。

优选的，所述步骤二中，超速离心机的转速为60～80r/s，离心时间为13～17min。

优选的，所述步骤三中，振荡器的振幅为15～26mm，振荡时间为1～3min。

优选的，所述步骤三中，裂解液选用氯仿，且氯仿的温度为22～25℃。

优选的，所述步骤四中，磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁珠，直径为1～10nm。

优选的，所述步骤四中，磁珠分离器的转速400～600r/min，分离时间为8～13min。

优选的，所述步骤五中，洗涤液选用浓度为70％的乙醇，且乙醇的温度为20～23℃。

优选的，所述步骤五中，洗脱液选用去离子水，且去离子水的温度为18～21℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该电化学免疫用DNA甲基化位点对数量检测方法，采用磁珠法分离纯化DNA，从而简化了流程，降低了操作的难度，试样中DNA纯度高、含量多，分离效果好、用时短，检测通量高；用磁珠分离纯化法取代了传统的DNA提取方法，增大了对试样的除杂力度，减少了试样中DNA以外的其他杂质，确保了DNA甲基化的效率，提高齐了DNA甲基化位点对数量的检测精度。

附图说明

图1为本发明的方法流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明提供的一种实施例：一种电化学免疫用DNA甲基化位点对数量检测方法，包括以下步骤：步骤一，抽血采样；步骤二，梯度分离；步骤三，细胞裂解；步骤四，磁珠分离；步骤五，洗脱提取；步骤六，位点检测；

其中在上述步骤一中，用医用注射器从待测体上抽取适量的血液，并注入医用采血管中，密封保存，得到血液样本；

其中在上述步骤二中，用医用滴管从步骤一中得到的血液样本中取预定量滴入医用离心管中，并加入适量的淋巴细胞分离液，密封后再将医用离心管放到超速离心机上进行密度梯度离心，超速离心机的转速为60～80r/s，离心时间为13～17min，分离PBMC后得到血清样本；

其中在上述步骤三中，将步骤二中得到的血清样本倒入医用试管中，并加入适量的裂解液，裂解液选用氯仿，且氯仿的温度为22～25℃，再放到振荡器上混合均匀，振荡器的振幅为15～26mm，振荡时间为1～3min，使细胞壁、细胞核和细胞器破裂，并分散在裂解液中，得到裂解样本；

其中在上述步骤四中，将适量的磁珠加入医用试管中，磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁珠，直径为1～10nm，与步骤三中得到的裂解样本混合均匀，再将医用试管放到磁珠分离器上，磁珠分离器的转速400～600r/min，分离时间为8～13min，利用磁场力使磁珠分散在裂解样本中，并吸附住DNA，得到分离样本；

其中在上述步骤五中，将适量的洗涤液加入医用试管中，洗涤液选用浓度为70％的乙醇，且乙醇的温度为20～23℃，与步骤四中得到的分离样本混合均匀，静置后沉淀分层，弃去上清液，再将适量的洗脱液加入下浊液中混合均匀，洗脱液选用去离子水，且去离子水的温度为18～21℃，使DNA脱离磁珠并溶解在洗脱液中，静置后沉淀分层，取上清液，得到试样；

其中在上述步骤六中，将步骤五中得到的试样倒在光电化学免疫传感器的感应区，并将适量的DNA甲基化转移酶和预制引物滴加入试样中，使试样中的DNA发生甲基化、预制引物中的未反应物发出荧光，光电化学免疫传感器再将荧光的光信号转换成电信号，并传输给检测仪器，即得DNA甲基化位点对数量。

基于上述，本发明的优点在于，采用磁珠法分离纯化DNA，增大了对试样的除杂力度，减少了试样中DNA以外的其他杂质，确保了DNA甲基化的效率，提高齐了DNA甲基化位点对数量的检测精度，且简化了流程，降低了操作的难度，试样中DNA纯度高、含量多，分离效果好、用时短，检测通量高。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。