一种快速、精准定量绿茶中氮氧杂环类化合物的检测方法及绿茶干燥程度评价方法

摘要

本发明公开了一种快速、精准定量绿茶中氮氧杂环类化合物的检测方法及绿茶干燥程度评价方法，具体涉及了一种金属浴辅助箭形固相微萃取技术结合气相色谱‑三重四极杆串联质谱技术快速分析绿茶中氮氧杂环类化合物的检测方法。本发明所提供的氮氧杂环类化合物的检测方法，能够实现对茶叶中7种氮氧杂环类化合物同时定性定量检测，选择性好，灵敏度高，解决了绿茶中氮氧杂环类化合物水平低，以及茶叶复杂基质对目标物的分析干扰严重的影响，可以实现绿茶中氮氧杂环类化合物快速、准确地测定。所述绿茶干燥程度评价方法筛选提出呋喃醛作为评价箱式热风干燥程度(含水率)的关键指标化合物。

说明书

技术领域

本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种快速、精准定量绿茶中氮氧杂环类化合物的检测方法及绿茶干燥程度评价方法。

背景技术

绿茶是我国茶叶的主要茶类之一，以其香气高鲜、滋味浓醇的优异品质备受消费者的青睐，如西湖龙井、信阳毛尖和碧螺春等。目前，绿茶香气成分的研究中，已分离鉴定包括醇、醛、酮、酯、酸、氮氧杂环类化合物等在内200余种香气组分，其中吡嗪、吡啶、吡咯、呋喃、糠醛类等氮氧杂环类化合物，香气特征突出，香味阈值低，对绿茶特征品质的形成具有重要贡献。Kumazawa等研究发现2-乙酰基-1-吡咯啉、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-乙酰基-2-噻唑啉、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪有非常高的香气稀释(FD，flavordilution)因子值，是炒青绿茶的特征香气组分。此外，Baba等研究发现4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、3-羟基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮、2-异丙基-3-甲基吡嗪、2-乙烯基-3,5-二甲基吡嗪在龙井、毛峰、碧螺春三个绿茶品种均显示很高的FD值，是绿茶的关键香气成分。美国食品香料与萃取物制造者协会(FEMA)公布的食品香料名单中，氮氧杂环类化合物占有突出的地位，其衍生物广泛存在于烘焙食品中，对不同食品特色风味的形成具有重要贡献，具有广阔的发展前景。

茶叶中氮氧杂环类化合物的含量非常低，往往无法直接进行分析。因此，前处理技术尤为重要，它直接关系到分析方法的优劣，并影响结果的可靠性、准确性和分析通量。目前，食品中氮氧杂环类化合物的前处理技术主要有同时蒸馏萃取、溶剂提取、液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、搅拌棒吸附萃取(SBSE)等。Keim等采用LLE提取并利用硅胶纯化白酒中氮杂环类化合物，该方法引入除去大部分酯类和醇类的提取步骤，有效提高了氮杂环类化合物的检出，但是前处理步骤太多会导致目标物的损失。简单快速、重复性好，对目标化合物的选择高是现代样品前处理技术的发展趋势和要求。在氮杂环类化合物的检测分析中，最早使用的是气相色谱-火焰离子化检测器(FID)和氮-磷检测器(NPD)，对于低含量的物质灵敏度不够，尽管气相色谱能有效地对不同的成分进行分离，但是对于一些特殊的组分很难进行可靠的检测，因此需要联合质谱技术。GC-QqQ-MS/MS具有保留时间和串联质谱确证的优点，大大提高了检测的准确性，其多反应监测(MRM)模式能够消除食品中复杂基质的干扰，选择性好，灵敏度高，己成为现代分析实验室一种快速、准确、可靠的分析工具。

基于茶叶香气组分的复杂性加之氮氧杂环类化合物含量低、易挥发、不稳定等特殊性能，迫切需要开发高选择性与高灵敏性于一体的快速分析方法，为优质绿茶加工技术和工艺的提升提供理论指导。

发明内容

针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种快速、精准定量绿茶中氮氧杂环类化合物的检测方法，能够实现对绿茶中7种氮氧杂环类化合物同时定性定量检测，选择性好，灵敏度高，解决了绿茶中氮氧杂环类化合物水平低难以检测的问题，以及茶叶复杂基质对目标物的分析干扰严重的影响，可以实现绿茶中氮氧杂环类化合物快速、准确地测定。

一种快速、精准定量绿茶中氮氧杂环类化合物的检测方法，为一种金属浴辅助箭形固相微萃取技术结合气相色谱-三重四极杆串联质谱技术快速分析绿茶中氮氧杂环类化合物的检测方法，包括步骤：

(a)标准工作溶液的制备：

以2-甲基呋喃、2-正丁基呋喃、2-正戊基呋喃、呋喃醛、吡咯、乙酰吡嗪、乙酰吡咯的标准品为目标物，用乙醇定容配成20mg/L的标准储备液，然后逐级稀释至5000ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、300ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL，其中2-甲基吡嗪-d6内标浓度恒定为50ng/mL的工作溶液备用；

(b)金属浴辅助箭形固相微萃取技术提取氮氧杂环类化合物

1)萃取纤维头老化：将萃取纤维头装入箭形固相微萃取(SPME Arrow)手柄中，组成SPME Arrow手动进样器，插入温度为270℃的进样口老化30min钟后缩回纤维头，拔出进样口；

2)标准样准备：移取步骤(a)中的一系列不同浓度的工作溶液于20mL顶空瓶中，用聚四氟乙烯密封帽拧紧；

待测样准备：准确称取1.0g茶样于20mL顶空瓶中，加入3950μL蒸馏水和50μL 4mg/L同位素2-甲基吡嗪-d6，保证体系里同位素内标物浓度为50ng/mL，用聚四氟乙烯密封帽拧紧；

所述茶样的制备过程包括：

(I)茶鲜叶摊放：室内温度25℃-28℃，湿度70％-80％；

(II)滚筒式杀青：滚筒杀青机1、2、3组温度分别为280℃、275℃、275℃；

(III)揉捻：转速50-52r/min，空揉5min-轻揉5min-松压2min-中压5min-重揉3min-空揉5min；

(IV)110℃、15min烘毛火处理后，分别称重80g放于不锈钢筛盘中，然后置于箱式热风烘干机里在115℃条件下干燥5～50min后取出，得到所述茶样；

3)氮氧杂环类化合物萃取：将步骤2)的顶空瓶放入金属浴中进行加热，在60℃的条件下，采用Carbon WR SPME Arrow纤维头刺穿隔膜于顶空瓶上方吸附30min；

4)样品解析：萃取完成后，将SPME Arrow萃取针插入GC进样口，200℃下解析4min，进行气相色谱-三重四极杆串联质谱技术(GC-QqQ-MS/MS)分析；

(c)气相色谱-三重四极杆串联质谱技术分析条件优化

色谱分离条件：色谱柱VF-WAXms，260℃，30m×250μm×0.25μm；程序升温：初始柱温40℃，保持3min，以3℃/min升至120℃，保持2min，然后再以10℃/min升至240℃，保持3min；载气：氦气，纯度99.999％；载气流速：1.0mL/min；N

内标物、2-甲基呋喃、2-正丁基呋喃、2-正戊基呋喃、呋喃醛、吡咯、乙酰吡嗪、乙酰吡咯的保留时间和质谱条件优化，优化后的多反应监测(MRM)模式的参数情况如下：

其它质谱参数：传输线温度：250℃；离子源温度230℃；溶剂延迟：2min；电离方式：EI源；电离能量：70eV；Q2碰撞气：氮气，纯度≥99.999％；

(d)氮氧杂环类化合物的定性及定量分析

定性分析：依据各标准品的保留时间及特征离子峰；

采用内标法进行定量分析：采用步骤(a)的工作溶液，根据所选的特征定性离子和定量离子的信息，以目标化合物与内标的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标进行线性回归分析，得到标准工作曲线；在相同的条件下，通过将待测样中目标挥发物的峰面积与内标峰面积的比值代入相应的标准工作曲线中计算得出待测茶样中目标挥发物的含量。

步骤(d)中：

2-甲基呋喃的标准工作曲线为y＝0.002239*x-1.448717*10

2-正丁基呋喃的标准工作曲线为y＝0.658498*x+0.067972，R

2-正戊基呋喃的标准工作曲线为y＝0.686733*x-0.084885，R

呋喃醛的标准工作曲线为y＝0.438733*x+0.025218，R

吡咯的标准工作曲线为y＝0.054700*x+0.099804，R

乙酰吡嗪的标准工作曲线为y＝0.109487*x+0.028905，R

乙酰吡咯的标准工作曲线为y＝0.144857*x+0.118640，R

本发明还提供了一种绿茶干燥程度评价方法，采用所述的快速、精准定量绿茶中氮氧杂环类化合物的检测方法，以呋喃醛为评估箱式热风干燥程度的关键指标化合物，将不同干燥时长下的茶样检测到的呋喃醛含量作为x变量，将以含水率为考察指标的干燥程度作为y变量进行回归分析，得到干燥程度拟合曲线；在相同的条件下，通过将待测茶样检测到的呋喃醛含量代入干燥程度拟合曲线中计算得到相应绿茶干燥程度。

所述干燥程度拟合曲线为y＝10

本发明与现有技术相比，主要优点包括：

1、本发明采用金属浴进行加热，相较于传统的水浴加热方式，具有加热速度快，控温准确，温度均匀性≤±0.3℃，温度稳定性±0.3℃。

2、本发明采用箭形固相微萃取技术对绿茶中氮氧杂环类化合物进行提取，样品前处理简单快速，避免了繁琐的预处理过程，无需有机溶剂，绿色环保；相同材质下SPMEArrow比传统SPME具有更高的灵敏度，萃取效率高，且使用寿命长。

3、本发明建立了绿茶中氮氧杂环类化合物同时定性定量分析的GC-QqQ-MS/MS方法，在优化MRM模式参数条件下，引入稳定同位素(2-甲基吡嗪-d6)作为内标物，有效排除复杂基质干扰、增强目标物响应信号、降低基线噪音，使目标物实现基线分离，大大提高了分析灵敏度。

4、本发明建立的绿茶中氮氧杂环类化合物检测方法，克服了现有技术的不足，提供了一种绿茶中氮氧杂环类化合物高选择性与高灵敏性于一体的快速分析方法。

附图说明

图1为实施例中不同干燥时长下氮氧杂环类化合物的变化趋势图；

图2为实施例中呋喃醛含量与干燥程度(含水率)的拟合曲线图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.仪器与试剂

1.1仪器

7890A-7000C气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent Technologies公司)；箭形固相微萃取手柄和萃取纤维头(美国Agilent Technologies公司)；箭形固相微萃取纤维头主要采用Carbon WR SPME Arrow；AL 204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；顶空瓶(20mL，Agilent Technologies)；密封帽(聚四氟乙烯，Agilent Technologies)；金属浴加热装置(浙江纳德科学仪器有限公司，浙江)。

1.2材料与试剂

绿茶干燥样的制备：茶鲜叶采于2020年4月中旬，浙江省嵊州市，品种为中茶108，嫩度为一芽一叶至一芽二叶。其具体的加工工艺如下：摊放(室内温度25℃-28℃，湿度70％-80％)→滚筒式杀青(滚筒杀青机1、2、3组温度分别为280℃、275℃、275℃)→揉捻(转速50-52r/min，空揉5min-轻揉5min-松压2min-中压5min-重揉3min-空揉5min)→烘毛火(110℃、15min)处理后，分别称重80g放于不锈钢筛盘中，然后置于箱式热风烘干机里在115℃条件下分别干燥5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min后取出。

氮氧杂环类化合物：2-甲基呋喃(98％)购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-正丁基呋喃(98％)、呋喃醛(≥99.5％)、吡咯(99％)、乙酰吡嗪(98％)购买于上海麦克林生化科技有限公司；2-正戊基呋喃、乙酰吡咯(＞98％)购买于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；2-甲基吡嗪-d6(99.5％)购买于CDN Isotopes。

试剂：乙醇(AR，纯度≥99.7％)购于麦克林试剂公司；去离子水由娃哈哈公司提供。

2.实验方法

(a)标准工作溶液的制备：

以2-甲基呋喃、2-正丁基呋喃、2-正戊基呋喃、呋喃醛、吡咯、乙酰吡嗪、乙酰吡咯的标准品为目标物，用乙醇定容配成20mg/L的标准储备液，然后逐级稀释至5000ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、300ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL，其中内标浓度(2-甲基吡嗪-d6)恒定为50ng/mL的工作溶液备用。

(b)金属浴辅助箭形固相微萃取技术提取氮氧杂环类化合物

I：萃取纤维头老化：将萃取纤维头装入箭形固相微萃取(SPME Arrow)手柄中，组成SPME Arrow手动进样器，插入温度为270℃的进样口老化30min钟后缩回纤维头，拔出进样口。

II：标准样和待测样准备：移取一系列不同浓度氮氧杂环类工作溶液(5000ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、300ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL，其中内标浓度(2-甲基吡嗪-d6)恒定为50ng/mL于20mL顶空瓶中，用聚四氟乙烯密封帽拧紧；准确称取1.0g茶样于20mL顶空瓶中，加入3950μL纯净水和50μL同位素2-甲基吡嗪-d6(4mg/L)，保证体系里同位素内标物浓度为50ng/mL，用聚四氟乙烯密封帽拧紧。

III：氮氧杂环类化合物萃取：将顶空瓶放入金属浴中进行加热，在60℃的条件下，采用Carbon WR SPME Arrow纤维头刺穿隔膜于顶空瓶上方吸附30min。

IV：样品解析：萃取完成后，将SPME Arrow萃取针插入GC进样口，200℃下解析4min，进行GC-QqQ-MS/MS分析。

(c)气相色谱-三重四极杆串联质谱技术分析条件优化

色谱分离条件：色谱柱VF-WAXms，260℃，30m×250μm×0.25μm；程序升温：初始柱温40℃，保持3min，以3℃/min升至120℃，保持2min，然后再以10℃/min升至240℃，保持3min；载气：氦气(纯度99.999％)；载气流速：1.0mL/min；N

质谱条件优化：优化的质谱参数主要有母离子、子离子和碰撞能量。首先，对标准储备液在m/z 40-400之间进行全扫描，确定7种氮氧杂环类化合物的保留时间和一级质谱图，并从一级质谱图中选择适当的离子作为母离子；其次，对选定的母离子在产物离子扫描模式下，分别对7种氮氧杂环类化合物进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，确定定性和定量离子对：化合物名称2-甲基呋喃定性和定量离子对分别为82→53和82→39、2-正丁基呋喃定性和定量离子对分别为81→51和81→53、2-正戊基呋喃定性和定量离子对分别为81→51和81→53、呋喃醛定性和定量离子对分别为96→67和96→39、吡咯定性和定量离子对分别为67→39和67→41、乙酰吡嗪定性和定量离子对分别为122→80和122→94、乙酰吡咯定性和定量离子对分别为109→66和109→94；然后对其二级质谱的碰撞能量(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50V)进行优化，最终优选的多反应监测(MRM)模式的参数情况见表1，该参数使目标物定性更加准确，并能有效降低基质干扰。

表1氮氧杂环类化合物保留时间、定性离子、定量离子及碰撞能量(CE)优化结果

其它质谱参数：传输线温度：250℃；离子源温度230℃；溶剂延迟：2min；电离方式：EI源；电离能量：70eV；Q2碰撞气：氮气(纯度≥99.999％)。

(d)吡嗪类化合物的定性及定量分析

定性分析：依据各标准品的保留时间及特征离子峰。

采用内标法进行定量分析：分别配制5000ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、300ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL，其中内标浓度(2-甲基吡嗪-d6)恒定为50ng/mL的氮氧杂环类化合物混合标准溶液，根据所选的特征定性离子和定量离子的信息，以目标化合物与内标的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标进行线性回归分析，得到标准工作曲线。在相同的条件下，通过将待测样品中目标挥发物的峰面积与内标峰面积的比值代入相应的标准曲线中来计算得出待测茶样中目标挥发物的含量。

3.感官审评

由具有多年评茶经验的专家严格按照GB/T 23776-2018对不同干燥时长下的茶样进行审评，重点审评茶叶的香气，结合热嗅、温嗅、冷嗅，反复确认香气类型及强度。

4.结果与分析

4.1氮氧杂环类化合物的定量标准曲线绘制、最低检测限、定量限及回收率测定

为了精确定量，对一系列不同浓度梯度的氮氧杂环类化合物标准品溶液进行GC-QqQ-MS/MS分析，以目标化合物与内标的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标进行线性回归分析，得到标准工作曲线。在相同的条件下，通过将待测样品中目标挥发物的峰面积与内标峰面积的比值带入相应的标准曲线中来计算得出待测茶样中目标挥发物的含量。如表2所示，所有标准曲线在5-1000ng/mL浓度范围内呈现较好的线性关系，相关系数R

表2氮氧杂环类化合物的线性浓度范围、检测限与定量限

为了进一步验证该分析方法的可靠性，对氮氧杂环类化合物的回收率进行测定。如表3所示，在空白基质中添加了100ng/mL的氮氧杂环类化合物标准品后，所计算出的加标回收率介于89.21％～117.32％，RSD值介于0.42％～5.38％。以上结果充分表明了分析方法具有较强的可靠性。

表3氮氧杂环类化合物的回收率及RSD值(％)测定

4.2绿茶中氮氧杂环类化合物的定性定量分析

通过对绿茶不同干燥时长下的氮氧杂环类化合物进行检测分析，共鉴定7种氮氧杂环类化合物，包括2-甲基呋喃、2-正丁基呋喃、2-正戊基呋喃、呋喃醛、吡咯、乙酰吡嗪、乙酰吡咯，其结果如图1所示。绿茶不同干燥时长下的样品中2-甲基呋喃含量介于46.43～75.41ng/mL，其随着干燥时长在缓慢增加，50min达到最高；2-正丁基呋喃含量介于6.51～18.21ng/mL，其随着干燥时长变化规律性不太明显，35min下含量达到最高；2-正戊基呋喃含量介于219.59～390.08ng/mL，其随着干燥时长先增加后降低，35min下含量达到最高；呋喃醛含量介于13.79～98.47ng/mL，其随着干燥时长先增加后降低，45min下含量达到最高，之后略有下降；吡咯含量介于13.69～144.42ng/mL，其随着干燥时长先增加后降低，45min下含量达到最高，之后急速下降；乙酰吡嗪含量介于11.71～531.57ng/mL，随着干燥时长的延长，其在35min急速增长，增长速度高达15倍，45min含量达到最高；乙酰吡咯含量介于157.53～1454.36ng/mL，其随着干燥时长在缓慢增加，50min达到最高。

不同干燥时长下的感官审评结果如表4所示，从中可以看出，不同干燥时长下茶叶香气呈现足火→火攻略高→火攻偏高→高火→老火的一个渐变过程，香气评分在干燥时长20min达到最高(88分)，之后呈下降趋势。我们以不同干燥时长下呋喃醛含量为x变量，以干燥程度(以含水率为考察指标)为y变量进行回归分析，如图2所示，可以看出呋喃醛含量与干燥程度(含水率)呈现二项式关系，其回归方程y＝10

表4不同干燥时长下感官审评结果

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。